呂武龍 鄧 煒 雷 靂 劉大勇 運新躍 李長義

種植體植入體內(nèi)立刻會引起炎癥反應［1］。巨噬細胞是首先到達種植體表面的一種細胞，是炎癥反應的主要效應細胞。巨噬細胞通過吞噬細胞殘片，分泌各種酶、細胞因子，影響傷口愈合和組織再生過程［2,3］。此外，巨噬細胞具有極大的可塑性，不同種植體表面形貌和/或化學性質(zhì)可影響巨噬細胞的極化和細胞因子的分泌，最終影響種植體的早期骨結(jié)合過程［4,5］。紫外線照射是一種新型種植體表面改性技術(shù)，可提高鈦種植體表面生物活性，促進種植體早期骨結(jié)合［6］。紫外線照射的拋光和TiO2納米管形貌能否影響巨噬細胞炎癥反應，少有報道。本項研究探討紫外線照射的以上兩種不同表面形貌對巨噬細胞功能的影響，為該技術(shù)的臨床應用提供理論基礎。

1.材料與方法

1.1 試件的制備 純鈦試件（直徑為15mm，寶雞鈦業(yè)股份有限公司）經(jīng)碳化硅砂紙拋光至600目備用，即拋光組。參考作者以往的研究［7,8］，采用陽極氧化法在拋光后的純鈦試件表面制備TiO2納米管，0.5%氫氟酸溶液為電解液，鉑片為陰極，實驗采用20V恒電壓，時間為40min，制備出TiO2納米管，即納米管組。為了使試件充分老化，參考Tsukimura等［9］的方法，所有拋光組和納米管組試件經(jīng)高壓滅菌后避光保存8周。各組取一半試件置于紫外燈（30W，λ=253.7nm，飛利浦公司）下10cm處照射48h，照射后立即進行實驗。經(jīng)紫外線照射的拋光組和納米管組試件標記為拋光+紫外線組和納米管+紫外線組。

1.2 表面特征分析 采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800，日本日立）觀察拋光組和納米管組各1個試件的表面形貌。取以上4組試件各3個，室溫下將1μL超純水滴在試件表面，用接觸角測定儀（JGW-360A，廈門崇達智能科技有限公司）測量接觸角。

1.3 細胞培養(yǎng) 在5%CO2、37℃的條件下，用含青霉素、鏈霉素和10%胎牛血清的高糖達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）培養(yǎng)RAW264.7 小鼠巨噬細胞（北京協(xié)和細胞資源中心），每2-3 天傳代1次。將四組試件放置于24 孔培養(yǎng)板中，以2×104個/孔的細胞密度將巨噬細胞接種在不同鈦試件上，并設置空白對照組。

1.3.1 細胞黏附和增殖實驗 培養(yǎng)4、24、72h后，用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測各組試件巨噬細胞黏附和增殖情況，每組每個時間點3個試件。到達預定時間后，收集各組培養(yǎng)24和72h的細胞上清液用于后續(xù)細胞因子檢測實驗。到達預定時間后，漂洗試件，并轉(zhuǎn)移到新的24孔培養(yǎng)板中，加1mL含CCK-8的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1h。吸取200μL混合溶液至96孔培養(yǎng)板中，450nm處測定吸光度（OD值）。

1.3.2 細胞因子檢測 取各組24和72h 的細胞上清液，按照液相芯片分析技術(shù)（Magnetic Luminex Assay）（LXSAMSM-05，R&D，美國）的說明，檢測腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和巨噬細胞炎性 蛋 白1α（macrophage inflammatory protein1α，MIP-1α）的質(zhì)量濃度。

1.3.3 細胞形態(tài)觀察 每組巨噬細胞培養(yǎng)2h后，各取一個試件，經(jīng)3%戊二醛溶液固定、梯度脫水、干燥后噴金，用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對各組試件表面接觸角、相同時間點的細胞黏附和增殖OD 值、細胞因子的質(zhì)量濃度分別進行單因素方差分析，并用SNK 法檢驗組間差別，檢驗水準設置為雙側(cè)α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 拋光組和納米管組試件表面形貌觀察 較低的放大倍數(shù)下（500 倍），拋光組試件有明顯的打磨痕跡（圖1A），而納米管組試件隱約可見打磨痕跡，表面有直徑約為1-5μm 大小不等的凹坑（圖1B）。較高的放大倍數(shù)下（100000 倍），拋光組試件仍然有明顯劃痕，無明顯納米結(jié)構(gòu)（圖1C），而納米管組試件表面均勻分布直徑約為80nm 的TiO2納米管（圖1D）。

圖1 拋光組和納米管組試件的表面形貌觀察（A，B掃描電鏡放大500倍；C，D掃描電鏡放大100000倍）A，C：拋光組；B，D：納米管組

2.2 各組試件表面接觸角 拋光組、納米管組、拋光+紫外線組和納米管+紫外線組試件表面接觸角分別為77.4°±4.6°、49.5°±6.9°、39.6°±3.8°和0.0°±0.0°，見圖2。拋光+紫外線組和納米管+紫外線組試件表面接觸角明顯小于拋光組和納米管組（P＜0.05），且納米管+紫外線組試件呈超親水性，顯著小于拋光+紫外線組（P＜0.05）。

圖2 試件表面接觸角PT：拋光組；NT：納米管組；PT+UV：拋光+紫外線組；NT+UV：納米管+紫外線組。a表示與拋光組相比P＜0.05；b表示與納米管組相比P＜0.05；c表示與拋光+紫外線組相比P＜0.05

2.3 各組細胞黏附和增殖（見圖3）培養(yǎng)4 和24h 時各組細胞吸光值相似，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培養(yǎng)72h 時，納米管+紫外線組細胞增殖顯著高于其他四組（P＜0.05）。

圖3 各組細胞黏附和增殖情況PT：拋光組；NT：納米管組；PT+UV：拋光+紫外線組；NT+UV：納米管+紫外線組；Ctrl：空白對照組。a表示與拋光組相比P＜0.05；b表示與納米管組相比P＜0.05；c表示與拋光+紫外線組相比P＜0.05；d表示與空白對照組相比P＜0.05

2.4 各組細胞因子的質(zhì)量濃度（見表1）培養(yǎng)24h 時，拋光組TNF-α 質(zhì)量濃度明顯高于其他四組（P＜0.05），而各組VEGF 均很低，無顯著性差異（P＞0.05）；培養(yǎng)72h時，拋光+紫外線組和納米管+紫外線組TNF-α 和VEGF 質(zhì)量濃度均分別顯著小于拋光組和納米管組（P＜0.05）。培養(yǎng)24h 時，拋光+紫外線組和納米管+紫外線組MIP-1α 質(zhì)量濃度均低于拋光組（P＜0.05）；培養(yǎng)72h 時拋光組MIP-1α質(zhì)量濃度顯著高于其他四組（P＜0.05）。

2.5 各組細胞形態(tài)觀察（見圖4）培養(yǎng)2h 后，拋光組巨噬細胞大多呈橢圓形，伸展充分，納米管組更多細胞呈橢圓形，伸展更充分，長寬比更大，且有大片的板狀偽足；拋光+紫外線組和納米管+紫外線組巨噬細胞大都呈圓形，拋光+紫外線組細胞呈球狀，而納米管+紫外線組細胞更扁。

表1 各組試件細胞上清液中細胞因子質(zhì)量濃度的比較（ng/L，Mean±SD）

圖4 小鼠巨噬細胞在4組試件表面培養(yǎng)2h后的細胞形態(tài)（A，B，C，D掃描電鏡放大500倍；E，F(xiàn)，G，H掃描電鏡4000倍放大）A，E：拋光組；B，F(xiàn)：納米管組；C，G：拋光+紫外線組；D，H：納米管+紫外線組

3.討論

種植體表面特征（如表面形貌、親水性等）是影響種植體早期骨結(jié)合的重要因素［10，11］。種植體表面特征不僅影響骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，也影響巨噬細胞細胞因子的分泌、M1/M2極化的改變，從而最終影響種植體早期骨結(jié)合［4］。本項研究結(jié)果顯示：紫外線照射的TiO2納米管形貌可明顯增加其表面親水性和巨噬細胞增殖；此外，紫外線照射的兩種種植體形貌均可降低巨噬細胞炎癥因子的分泌。

本項研究中，充分老化的納米管組試件的接觸角明顯小于拋光組，而納米管+紫外線組試件的接觸角是超親水性的0°，顯著小于拋光+紫外線組（P＜0.05）。該結(jié)果說明紫外線照射和TiO2納米形貌具有協(xié)同作用，顯著增加了該試件表面的親水性。其原因可能有以下兩點：第一，鈦種植體在存儲過程中會不斷吸附碳氫化合物，降低了親水性，從而影響種植體表面理化性質(zhì)和生物活性［12，13］。TiO2納米管能延緩鈦表面碳氫化合物等污染物的沉積，因此，經(jīng)過8周充分老化后，納米管組試件的接觸角也比拋光組試件小。第二，TiO2經(jīng)紫外線照射后產(chǎn)生的光催化反應能有效清除其表面的碳氫化合物等污染物［12，14］。與拋光+紫外線組相比，納米管+紫外線組試件表面的TiO2氧化層更厚，能產(chǎn)生更強的光催化反應，更有效清除碳氫化合物，從而增加了親水性［12，15］。

種植體表面特征能影響細胞的黏附增殖、分化和局部細胞因子的分泌［16］。本項研究中，盡管各組試件表面巨噬細胞最初的黏附情況相似，但72h后納米管+紫外線組細胞增殖最快。其原因可能是獨特的TiO2納米管形貌經(jīng)紫外線照射后，能有效清除碳氫化合物等污染物，改變了試件表面的親水性和化學性質(zhì)［15］，從而影響了蛋白質(zhì)的吸附、細胞的黏附增殖［2，5］。

盡管拋光組和拋光+紫外線組的細胞黏附增殖沒有差異，但是拋光+紫外線組巨噬細胞分泌的炎癥因子比拋光組少，甚至比納米管組少，說明紫外線照射的兩種形貌表面親水性和化學性質(zhì)的變化均有利于減少巨噬細胞炎癥細胞因子的分泌。巨噬細胞具有極大的可塑性，不同種植體表面形貌和/或化學性質(zhì)產(chǎn)生的不同微環(huán)境能改變其表型和功能［16，17］。本項研究中，紫外線照射的兩種形貌均能減少巨噬細胞分泌TNF-α、MIP-1α和VEFG。研究顯示，親水性形貌可減少巨噬細胞炎癥細胞因子的分泌，與本項研究結(jié)果一致［2，5，18，19］。通常認為，最初的炎癥反應是成功骨結(jié)合的必要條件，而持續(xù)過度的炎癥反應則不利于骨結(jié)合形成。如短暫、低水平的TNF-α可促進骨髓間充質(zhì)干細胞的歸募和成骨分化，而持續(xù)高水平的TNF-α對骨愈合有不利影響［20］。MIP-1α具有單核細胞趨化作用，能募集淋巴細胞和單核細胞到種植部位，從而促進了炎癥反應［20］。VEGF的分泌是組織修復過程中血管形成的必要條件，而Spiller等發(fā)現(xiàn)，主要是M1型巨噬細胞而非M2型巨噬細胞分泌VEGF［21］。本項研究結(jié)果提示紫外線照射的兩種形貌均能減少巨噬細胞炎癥反應，可能改變了巨噬細胞極化，這可能是紫外線照射能促進種植體早期骨結(jié)合的部分原因。

本項研究結(jié)果顯示，納米管+紫外線組和拋光+紫外線組試件表面的巨噬細胞最初的形態(tài)呈圓形，與未照射組巨噬細胞形態(tài)有很大差異。這與紫外線照射改變了兩種形貌試件表面親水性和化學性質(zhì)有關(guān)。作者在實驗時注意到，將細胞懸液接種到納米管+紫外線組和拋光+紫外線組試件表面時，細胞懸液迅速向四周鋪展。紫外線照射導致的試件各向同性可能也是巨噬細胞向四周鋪展，呈圓形的原因。研究發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)可調(diào)控巨噬細胞表型和功能，導致分泌的細胞因子有差異［22］。而紫外線照射鈦種植體表面導致巨噬細胞功能的改變，其分子機制還有待于進一步研究。

4.結(jié)論

紫外線照射是一種簡單有效的種植體表面改性技術(shù)。紫外線照射能增加兩種鈦表面形貌尤其是TiO2納米管形貌的親水性。紫外線照射的TiO2納米管形貌能促進巨噬細胞增殖；紫外線照射的種植體表面形貌能減輕炎癥反應。