史 森 苗 娜 史羽桐 王慧梅

（東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

84K 楊是由韓國育種學(xué)家以銀白楊（Populus alba）為母本，腺毛楊（P.glandulosa）為父本雜交培育出來的品種［1］，具有樹體高大直立、苗期生長快、適應(yīng)性強、材質(zhì)好等優(yōu)點，是優(yōu)良的工業(yè)用材樹種［2］。由于84K楊樹屬于白楊派，扦插繁殖較困難［3］。近年來，植物組織離體培養(yǎng)技術(shù)已成為苗木快速繁育的重要手段。與其他繁育方法相比，組織培養(yǎng)的特點是能精確地控制環(huán)境，不受季節(jié)控制，且繁殖速度快、節(jié)省材料，同時能保證繁殖后代整齊一致，保持原有品種的優(yōu)良性狀［4］。因此利用組織培養(yǎng)技術(shù)對84K楊進行快速繁殖具有重要的意義。

碳源在組織培養(yǎng)中對組培苗的生長和品質(zhì)具有重要影響，蔗糖一直作為植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源而廣泛應(yīng)用，不僅能夠有效地為細胞呼吸代謝提供底物與能源，而且能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)的生長。培養(yǎng)基中添加的蔗糖濃度大小影響植物組培苗形態(tài)發(fā)生途徑、生長和生理特性。84K 楊的組織培養(yǎng)已有研究報道［5～6］，但碳源對84K 楊組培繼代苗的生長和生理特性的影響還未見研究報道。因此本實驗研究了不同蔗糖濃度對84K 楊樹組培繼代苗的生長及生理特性的影響，為84K 楊樹組培快繁提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究材料

材料為無菌的84K 楊樹組培繼代苗，由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室曲冠證教授饋贈。84K 楊樹組培繼代苗的繼代培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 0.1 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1，瓊脂濃度8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1。培養(yǎng)基pH 為5.8，光周期為16/8 h，每個月繼代培養(yǎng)1次。

1.2 研究方法

1.2.1研究材料處理

挑選1.1 中繼代培養(yǎng)生長一致的84K 楊樹組培繼代苗接種于150 mL 的三角瓶中，基本培養(yǎng)基為1/2MS+0.01 mg·L-1NAA+0.01 mg·L-1IBA+8 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)基中分別添加10、20、30及40 g·L-1的蔗糖，pH 為5.8，光周期為16/8 h。分別在培養(yǎng)的第5，10，15 及20 d 時取樣并進行各種生理指標(biāo)的測定。每組處理15株組培繼代苗，重復(fù)3次。

1.2.2組培苗干重的測定

將84K 楊樹組培繼代苗從培養(yǎng)基中取出，將瓊脂清洗干凈，用濾紙吸干水分，放入40℃烘箱中烘干至恒重，即為干重。

1.2.3組培苗凈光合速率的測定

葉片凈光合速率采用Li-6400 便攜式光合作用系統(tǒng)進行測定。測定時選取生長部位一致的葉片，每個處理選取3株不同的植物進行測量［7］。

1.2.4葉綠素含量的測定

稱取0.03 g 新鮮組培苗的葉片，加入75%預(yù)冷的丙酮，浸泡24 h，離心10 min 后抽取上清液并用紫外分光光度計測定在665 和649 nm 波長下的吸光值，每組實驗重復(fù)3次［8］，計算公式為：

1.2.5可溶性糖與可溶性淀粉含量的測定

可溶性糖與可溶性淀粉采用蒽酮比色法測定［9］。稱取新鮮葉片0.2 g 并加入10 mL 去離子水于沸水浴20 min。反應(yīng)體系為：1 mL 樣品上清液和4 mL蒽酮試劑搖勻后用來測定可溶性糖。測糖后的植物殘渣加入8 mL 3 mol·L-1鹽酸于沸水浴45 min，之后將殘渣轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并加入8mL 3 mol·L-1NaOH后定容。反應(yīng)體系為：1 mL樣品上清液和4 mL蒽酮試劑，搖勻煮沸5 min后冷卻。均用紫外分光光度計在625 nm下測定吸光值［10］。分別用蔗糖當(dāng)量（mg SE/g）與葡萄糖當(dāng)量（mg GE/g）表示可溶性糖與淀粉含量，上述實驗均重復(fù)3次。

1.2.6核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（Rubisco）的測定

酶提取液制法：稱取0.5 g鮮樣，研磨樣品過程中加入液氮制冷。后加50 mmol·L-1pH=7.0 PBS磷酸緩沖液，研磨成勻漿后，4℃下高速離心10 min，所得上清液為粗酶提取液。

反應(yīng)體系的總體積為1 mL。反應(yīng)液組成：100 mmol·L-1pH 為7.5 的Tris-HCl，20 mmol·L-1MgCl2，25 mmol·L-1NaHCO3，10 units 甘 油 醛，0.3 mmol·L-1NADH，5 mmol·L-1磷酸 肌 酸，5 mmol·L-1ATP，5 units 肌酸磷酸激酶1 units RUBP。加入67 μL 酶液，混勻后開始計時，用紫外分光光度計記錄340 nm處3分鐘內(nèi)吸光值變化［11］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果采用Excel 軟件進行作圖分析，其中平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差用于數(shù)據(jù)分析。采用Duncan 多重比較對數(shù)據(jù)差異性分析。每組實驗3次重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖對84K楊樹組培繼代苗生長的影響

蔗糖作為植物組織培養(yǎng)中最常用的碳源，能支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的生長［12］。由圖1可以看出，蔗糖濃度對84K 楊樹組培繼代苗的生長有著明顯的影響，隨著培養(yǎng)時間的延長，較高濃度的蔗糖明顯有利于84K 楊樹組培繼代苗的生長。當(dāng)培養(yǎng)時間為20天時，30和40 g·L-1的蔗糖濃度處理生長明顯好于10和20 g·L-1的處理，從節(jié)約成本的角度考慮，選擇30 g·L-1的蔗糖為84K 楊組培苗繼代培養(yǎng)的最佳蔗糖濃度。當(dāng)培養(yǎng)到20 天時，30 g·L-1的蔗糖處理組培苗的干重為0.123 g，是10 g·L-1處理的1.5 倍。也有一些研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中較高的蔗糖濃度有利于組培苗的生長，如30與40 g·L-1的蔗糖能顯著促進馬鈴薯試管苗的生長［13］，非洲菊組培苗的干重也隨培養(yǎng)基中蔗糖濃度從0～45 g·L-1增加而增加［14］，這和我們的研究結(jié)果一致。

2.2 蔗糖對84K 楊樹組培繼代苗葉綠素含量、凈光合速率及Rubisco酶活性的影響

由圖2可以看出，不同濃度的蔗糖對84K楊組培苗的葉綠素總量沒有明顯的影響，但隨著培養(yǎng)時間的增長，培養(yǎng)10 天以后，不同濃度蔗糖處理的84K 楊組培苗的葉綠素總量明顯增高。培養(yǎng)15天時，蔗糖濃度30g·L-1的處理組培苗的葉綠素含量最高。

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度蔗糖對84K 楊樹組培繼代苗的凈光合速率有著重要的影響，且這種影響和培養(yǎng)時間有著緊密的聯(lián)系。結(jié)果如圖3所示，隨著培養(yǎng)時間的增長，30 與40 g·L-1蔗糖處理的組培苗具有較高的凈光合速率，明顯高于10與20 g·L-1蔗糖處理的組培苗凈光合速率，培養(yǎng)15 d時，30 g·L-1蔗糖處理的組培苗的凈光合速率最大，為3.617 μmol·m-2·s-1，是10 g·L-1蔗糖處理的組培苗凈光合速率的1.7 倍。我們同時也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)第5 天時，低濃度蔗糖處理的84K 楊樹組培繼代苗的凈光合速率明顯高于高濃度的蔗糖處理，但當(dāng)培養(yǎng)到第10 天時，高濃度蔗糖處理的84K 楊樹組培繼代苗的凈光合速率明顯增強。這可能是因為高濃度的蔗糖對84K 楊樹組培繼代苗的凈光合速率有抑制作用，隨著培養(yǎng)時間的增長，培養(yǎng)基中的蔗糖不斷消耗，這種抑制作用逐漸消除。而低濃度蔗糖的處理中，隨著培養(yǎng)時間的增長，養(yǎng)分逐漸消耗，不能提供足夠的碳源用于組培苗的光合作用。

從圖4可以看出，蔗糖濃度對84K楊樹組培繼代苗的Rubisco 酶活性有一定的影響，在不同的培養(yǎng)時間，30 和40 g·L-1蔗糖處理的組培苗具有較高的Rubisco 酶活性，繼代培養(yǎng)20天時，40 g·L-1蔗糖處理的組培苗具有最高的Rubisco 酶活性，為31.911 U·g-1FW·min-1，是10 g·L-1蔗糖處理的1.9倍。

總之，我們的研究結(jié)果表明，在較高的蔗糖濃度處理中，隨著培養(yǎng)時間的增加，84K 楊樹組培繼代苗具有較高的葉綠素含量、Rubisco 酶活性及凈光合速率。在草莓的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，較高濃度蔗糖處理的草莓組培苗具有較高的葉綠素含量和Rubisco 酶活性，但其凈光合速率是下降的［15］。但在水稻的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，水稻組培苗葉片的凈光合速率與Rubisco 酶活性呈正相關(guān)［16］。這些結(jié)果表明，蔗糖濃度對組培苗的影響因物種而異，不同的物種應(yīng)分別加以研究。

2.3 蔗糖對84K 楊樹組培繼代苗可溶性糖與可溶性淀粉的影響

研究已發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中蔗糖的含量對組培苗中糖和淀粉的含量有重要影響。當(dāng)培養(yǎng)基中添加較多的蔗糖時，地黃組培苗的根和葉中含有較多的可溶性糖和可溶性淀粉［17］。同樣在煙草的組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中蔗糖的添加導(dǎo)致煙草組培苗的葉片中可溶性糖和可溶性淀粉的含量增加［18］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的蔗糖對84K 楊組培苗體內(nèi)的可溶性糖含量有一定的影響，高濃度的蔗糖處理的組培苗含有較高的可溶性糖（見圖5），但培養(yǎng)基中的蔗糖對84K 楊組培苗體內(nèi)的可溶性淀粉含量沒有明顯影響（見圖6）。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中含有高濃度蔗糖的84K楊組培苗體內(nèi)含有較高的可溶性糖，這能否為組培苗移栽后提供更多的能量并增強其移栽后的適應(yīng)能力，我們接下來的研究要進行深入研究。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基的蔗糖濃度對84K 楊組培苗的生長有著重要的影響，較高濃度的蔗糖明顯有利于84K楊組培苗的生長，從節(jié)約成本的角度，選擇30 g·L-1濃度的蔗糖作為84K 楊組培苗繼代培養(yǎng)的最佳蔗糖濃度。在含30 g·L-1濃度蔗糖的培養(yǎng)基上生長的組培苗，不僅具有較高的葉綠素含量，Rubisco酶活性及凈光合速率，而且具有較高的可溶性糖含量。這些生理特性可能有利于組培苗的的移栽成活率和適應(yīng)性，因此在本研究的基礎(chǔ)上，下一步我們將對培養(yǎng)基中的蔗糖濃度對組培繼代苗的移栽成活率及適應(yīng)性進行研究。