朱畇昊 張夢佳 董誠明*

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2. 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046）

半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）是中國天然珍貴藥材之一，為天南星科（Araceae）半夏屬（Pinellia）植物，其塊莖入藥具有消痞散結(jié)，燥濕化痰，降逆止嘔的功效?，F(xiàn)代研究表明半夏中含有多種化學(xué)成分，主要包括生物堿、半夏淀粉、甾醇類、氨基酸、揮發(fā)油、有機(jī)酸類、半夏蛋白及多種微量元素等，具有抗炎、抗衰老、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等藥理作用［1］。半夏臨床應(yīng)用廣泛，市場需求量大，但是野生資源少，目前多為人工栽培。半夏最適生長溫度為10～25℃，當(dāng)溫度超過32℃時(shí)，半夏會發(fā)生倒苗，嚴(yán)重影響藥材產(chǎn)量及質(zhì)量。因此防止半夏倒苗，提高半夏植株的高溫耐性，是提高半夏產(chǎn)量的重要措施。

高溫脅迫對植物生產(chǎn)的威脅是一個(gè)全球性的熱點(diǎn)問題。高溫脅迫會引起植物體一系列的生理生態(tài)變化，影響植物的生長和發(fā)育，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量嚴(yán)重下降［2］。茉莉酸甲酯（MeJA）是一種信號傳導(dǎo)物質(zhì)，與植物的高溫、干旱、低溫、病蟲害等抗逆反應(yīng)有關(guān)。楊華庚等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下外源MeJA 可以提高蝴蝶蘭幼苗植株的SOD、POD 等抗氧化酶的活性，減少M(fèi)DA 的積累和相對電導(dǎo)率值，增加可溶性蛋白和脯氨酸的含量，從而增強(qiáng)蝴蝶蘭幼苗的耐熱性。在植物受脅迫時(shí)，植物體內(nèi)茉莉酸能誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗性。已有研究報(bào)道，噴施外源脯氨酸、NO、腐殖酸、Ca2+均能不同程度緩解高溫對半夏的傷害［4～7］，迄今未見外源茉莉酸甲酯與半夏耐熱性相關(guān)的報(bào)道。

本研究以半夏植株為實(shí)驗(yàn)材料，研究高溫條件下外源茉莉酸甲酯對植株的抗氧化酶活性、可溶性糖含量、有機(jī)酸含量及高溫脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量的影響，探討茉莉酸甲酯對提高半夏耐熱性的影響及其機(jī)理。為解決半夏高溫下易倒苗的問題提供新的解決思路與方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用材料經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為天南星科植物半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit）。選擇顆粒飽滿、大小重量相近的半夏塊莖清洗干凈，用10% 的次氯酸鈉浸泡15 min 消毒，用蒸餾水沖洗至無刺鼻氣味，播種于壤土、蛭石、有機(jī)肥混合均勻的花盆中，將花盆放于25℃、濕度80%、光照強(qiáng)度4 000 lx 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至苗高10 cm左右，選擇生長狀況較一致的植株，作為供試植株。

1.2 試驗(yàn)處理

選擇生長狀況均勻的半夏植株分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，40 ℃處理模擬高溫脅迫，實(shí)驗(yàn)組噴施適量的50 μmol·L-1的外源MeJA 溶液，空白組噴施等量的蒸餾水。對空白組和實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行取樣，取樣時(shí)間間隔為2、6、12、24、48 h。

1.3 抗逆性相關(guān)指標(biāo)測定

收集的樣品使用液氮速凍，放置于-80℃冰箱中保存，待測。半夏葉片中過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和游離脯氨酸（Pro）等含量的測定參考薛建平等［8］的方法進(jìn)行。每個(gè)指標(biāo)測定3 次。SOD 應(yīng)用氮藍(lán)四唑（NBT）法測定；APX 應(yīng)用抗壞血酸法測定；POD 應(yīng)用愈創(chuàng)木酚法測定；MDA 應(yīng)用硫代巴比妥酸（TBA）法測定，Pro 應(yīng)用茚三酮顯色法測定。

1.4 有效成分含量測定

將4 組半夏的塊莖洗凈、去皮、切片、40℃烘干、打粉。

總有機(jī)酸供試品的制備：取粉末5 g，精密稱定，放置于三角瓶中，加入95%的乙醇，每次50 mL，加熱回流1 h，重復(fù)以上操作3 次，合并濾液，蒸干，殘?jiān)芗尤?.1 mol·L-1的NaOH 滴定液10 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加入新沸過的冷水至刻度，搖勻［9］。

總有機(jī)酸含量采用電位滴定法測定。

多糖供試品的制備：每個(gè)樣品稱取1 g，加100 mL 的蒸餾水，60℃加熱回流5 h，補(bǔ)足重量后，離心并抽濾。精密量取2 mL 提取液，加乙醇使其含量為85%，靜置過夜。離心，用無水乙醇洗滌，蒸餾水溶解，定容至50 mL，備用［10］。

多糖含量采用硫酸—苯酚法，用紫外分光光度計(jì)在485 nm下測量樣品的吸光度。

1.5 高溫脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)分析

RNA 提取采用康為試劑植物RNA 提取試劑盒進(jìn)行。cDNA 合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用Applied Biosystems 公司Step One Plus 系統(tǒng)進(jìn)行檢測。以GAPDH 為內(nèi)參基因。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，檢測半夏中抗逆相關(guān)基因的相對表達(dá)量。qPCR 檢測的反應(yīng)體系為20 μL，按照以下進(jìn)行配置：10 μL 2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix（QIAGEN），正反向引物均為0.4 μL，cDNA 模板2 μL；加ddH2O 至20 μL［11］。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃，3 min；95℃，10 s；56℃，20 s；72℃，30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線測定，采用2?ΔΔCt分析方法進(jìn)行相對定量表達(dá)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析的最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA 對高溫脅迫下半夏SOD、APX和POD活性的影響

如表2 所示，在高溫處理下，各時(shí)間點(diǎn)MeJA處理組的SOD 活性均高于對照組，推測可能是在高溫脅迫下，噴施MeJA 可以增加SOD 的活性，從而緩解高溫引起的超氧陰離子自由基爆發(fā)對半夏帶來的傷害。不同處理時(shí)間下，噴施MeJA 的植株APX 活性均比空白對照組高，且在處理48 h 時(shí)變化顯著（P＜0.05）。隨著脅迫時(shí)間的延長APX 活性逐漸增加，在脅迫24 h 后達(dá)到最高。在高溫條件下，半夏植株經(jīng)外源MeJA 噴施后，葉片中POD活性均高于空白組。

2.2 MeJA 對高溫脅迫下半夏MDA和脯氨酸含量的影響

由表3可知，實(shí)驗(yàn)組MDA 含量低于空白組，說明噴施外源MeJA 減輕了高溫條件下半夏的膜脂過氧化程度，對植株有保護(hù)作用。脯氨酸含量高，植株的抗逆性強(qiáng)，由下表可以看出實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)高于空白對照組，說明在高溫脅迫下，噴施MeJA進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，使植株抗逆性更強(qiáng)。

表4 MeJA處理對半夏可溶性糖含量的影響Table 4 Effect of MeJA treatment on soluble sugar content of Pinellia ternata

表5 MeJA處理對半夏中總有機(jī)酸含量的影響Table 5 Effect of MeJA Treatment on Organic Acid Content in Pinellia ternata

2.3 MeJA 對高溫脅迫下半夏可溶性糖含量的影響

可溶性糖為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對緩解植物在逆境下的傷害有著重要作用。數(shù)據(jù)顯示，40℃空白處理組的可溶性糖含量比25℃處理組的高，40℃噴施MeJA 組的含量比40℃空白組的高，在48 h 時(shí)變化顯著，說明噴施MeJA 可以增加半夏的可溶性糖含量來提高半夏滲透壓，繼而提高對高溫的抗性。

2.4 MeJA 對高溫脅迫下半夏中總有機(jī)酸含量的影響

由表5數(shù)據(jù)可以看出，有機(jī)酸含量總體變化不大。在取樣時(shí)間為48 h 時(shí)，40℃處理組的有機(jī)酸含量比25℃的高，且空白組高于實(shí)驗(yàn)組。

2.5 MeJA 對高溫脅迫下半夏抗逆相關(guān)基因表達(dá)的影響

前期，課題組通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選了4個(gè)響應(yīng)半夏高溫脅迫的基因，分別為細(xì)胞質(zhì)Ⅰ型小分子熱激蛋白（C1HSP）、細(xì)胞質(zhì)Ⅱ型小分子熱激蛋白（C2HSP）、線粒體型小分子熱激蛋白（MitH?SP）和富含甘氨酸的RNA 結(jié)合蛋白（GRRBP），上述4 個(gè)基因在40℃高溫下表達(dá)量均顯著增加。本研究分析了外源茉莉酸甲酯對高溫脅迫下半夏中上述4個(gè)基因表達(dá)量的影響，由圖2可見，4個(gè)基因的表達(dá)量均在高溫處理下顯著增加，而MeJA 的噴施對其表達(dá)量的影響各有不同。MeJA 能使2個(gè)細(xì)胞質(zhì)型小分子熱激蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步大幅提高，且在2 h 時(shí)達(dá)到最高。MeJA 處理也增加了GRRBP 的表達(dá)量，但表達(dá)量的高峰出現(xiàn)在12 h時(shí)，上述3 個(gè)基因均表現(xiàn)出明顯的劑量累計(jì)效應(yīng)。MitHSP 在噴施MeJA 后，表達(dá)量顯著降低，可能是由于MeJA 噴施后，降低了半夏植株的呼吸作用，從而降低了線粒體中酶的活性，使得分子伴侶作用的MitHSP的表達(dá)量也降低。

3 討論

在適宜生長環(huán)境下，植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧的含量處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)［12］，過多的活性氧會被及時(shí)清除，因此不會對植株造成傷害。植物體內(nèi)的活性氧清除系統(tǒng)主要是抗氧化酶（SOD、POD、APX等）和抗氧化物質(zhì)，其抗氧化能力取決于抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的協(xié)同作用［13］。逆境會引起活性氧大量積累，使膜脂過氧化，最終導(dǎo)致植物的代謝紊亂。超氧化物歧化酶（SOD）可防止自由基的積累，保持膜穩(wěn)定性，繼而增強(qiáng)植株的抗逆性。過氧化物酶（POD）具有清除活性氧，緩解植株的高溫脅迫作用，是植物膜脂過氧化酶促防御體系中重要的保護(hù)酶。丙二醛（MDA）的含量是膜過氧化程度的指標(biāo)，是膜脂過氧化的產(chǎn)物，表示細(xì)胞膜的過氧化程度和植物對逆境條件反映的強(qiáng)弱。游離脯氨酸（Pro）是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可通過束縛更多的水分子達(dá)到滲透調(diào)節(jié)的目的［14］，從而避免植株受到更深的傷害。

本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的抗氧化防護(hù)酶活性普遍高于空白組，說明半夏在高溫脅迫下，噴施MeJA可以增強(qiáng)半夏植株中部分抗氧化酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)半夏的抗熱性。實(shí)驗(yàn)組的脯氨酸含量最高，脯氨酸的積累多，說明噴施MeJA 可以保護(hù)半夏的細(xì)胞膜，使其避免過氧化，且可以協(xié)調(diào)半夏與外界的滲透壓平衡。劉霞等［15］的研究發(fā)現(xiàn)噴施外源MeJA 可以提高水稻早期苗在高溫脅迫下POD 和SOD 酶的活性，降低MDA 的含量，舒緩高溫對水稻幼苗帶來的傷害。這與本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果相一致。

當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，JAs 的積累或外源的JAs處理都能使植物產(chǎn)生抗逆反應(yīng)，包括合成特殊功能的蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)或激活有關(guān)的酶，產(chǎn)生次生活性物質(zhì)等，達(dá)到抵御逆境傷害的目的［16～19］。小分子熱激蛋白（sHSP）可以提高植物的耐熱性，且sHSP的合成量與生物的耐熱能力呈正相關(guān)［20］。富含甘氨酸的RNA 結(jié)合蛋白（GRRBP）是植物中普遍存在的蛋白，研究表明，GRRBPs 參與了植物對多種逆境條件的反應(yīng)調(diào)節(jié)［21］，如冷害、干旱、水澇、傷害、鹽壓、外源脫落酸（ABA）或水楊酸（SA）處理等。本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)細(xì)胞質(zhì)型小分子熱激蛋白和GRRBP 蛋白，在MeJA 處理后表達(dá)量顯著增加。且在相關(guān)的研究中也發(fā)現(xiàn)對于外源MeJA 的應(yīng)答在長春花植物細(xì)胞壁的穩(wěn)定、植物逆境脅迫等方面具有重要作用［22］，與本文研究結(jié)果相一致。由此我們可以推測，MeJA 可能通過提高半夏抗氧化酶活性，增加半夏高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)在半夏抗高溫反應(yīng)中起到的作用，從而提高半夏的耐熱性。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，噴施外源MeJA 可通過提高半夏植株抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)活性，調(diào)控高溫脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，從而在一定程度上緩解高溫對半夏植株造成的危害，在之前并未見其相關(guān)研究。這為解決半夏不耐高溫、易倒苗的問題提出了新的解決思路與方法，并提供了一定的理論依據(jù)。