劉智媛 曾 麗 杜習(xí)武 彭勇政 陶懿偉 李雨清 秦 俊

（1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2. 上海辰山植物園，上海 201602；3. 上海城市樹(shù)木生態(tài)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200020）

藤本月季“安吉拉”（Rosa cv.‘Angela’）為多年生薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，因其觀賞性及抗性強(qiáng)廣泛應(yīng)用于城市園林綠化中，是優(yōu)良的城市垂直綠化植物材料［1］。狹義的花芽分化指的是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)，進(jìn)而發(fā)育成花器官原基雛形的過(guò)程［2～3］，而廣義的花芽分化則將其分為生理分化階段、形態(tài)分化階段和性細(xì)胞分化成熟階段3 個(gè)階段［4］。植物的花芽分化過(guò)程受到內(nèi)部及外部環(huán)境的影響，主要包括基因調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、內(nèi)源激素及外界環(huán)境等因素［5］。內(nèi)源激素與花的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，在植物花芽分化過(guò)程中起到重要作用，也是前人研究花芽分化的主要途徑之一。前人在植物花芽分化及內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化研究較多，主要集中在梨、桃、柑橘、葡萄、杏、荔枝等果樹(shù)方面的研究［6］；有關(guān)薔薇科薔薇屬植物的相關(guān)研究，主要對(duì)小姊妹月季花、玫瑰、單葉薔薇及月季“芬得拉”的花芽分化的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究［7～10］，但有關(guān)藤本月季“安吉拉”花芽分化及內(nèi)源激素的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以藤本月季“安吉拉”為試驗(yàn)材料，通過(guò)石蠟切片和體視顯微鏡觀察花芽分化不同階段形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)通過(guò)聯(lián)酶免疫法測(cè)定其內(nèi)源激素，研究花芽分化過(guò)程的形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)源激素的變化，為調(diào)控藤本月季“安吉拉”開(kāi)花數(shù)量、開(kāi)花質(zhì)量和開(kāi)花時(shí)間提供理論數(shù)據(jù)，為藤本月季在園林景觀中進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藤本月季“安吉拉”，來(lái)自上海辰山植物園，進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1花芽分化形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

體視顯微鏡觀察：從2019 年3 月20 日開(kāi)始每5 d采取藤本月季“安吉拉”新梢頂芽，隨機(jī)取20個(gè)新梢頂芽，利用鑷子剝?nèi)テ渫獠坑兹~，放于Olym?pus SZX16 體視顯微鏡下進(jìn)行解剖觀察，對(duì)其花芽分化不同時(shí)期進(jìn)行拍照記錄。

石蠟切片法觀察：新生枝條中選擇10～20 個(gè)新梢頂芽放于FAA 溶液中固定24 h，進(jìn)行脫水，透明，浸蠟，包埋，修塊等步驟后，用萊卡Leica2245切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為8～10 μm，切片后放置于萊卡H1220 烘片臺(tái)烘片，至條帶完全展開(kāi)后，用蘇木精/伊紅溶液進(jìn)行染色，置于Olmypus BX41生物顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.2聯(lián)酶免疫法測(cè)定內(nèi)源激素

采集不同花發(fā)育時(shí)期新梢頂芽，首先在體視顯微鏡下觀察判斷不同花芽分化時(shí)期，再分別將不同花芽分化時(shí)期的花芽放入冰盒中，用液氮速凍，置于-80℃冰箱中。分別稱取不同花芽分化時(shí)期的去除幼葉的頂芽0.1 g，加1 mL 樣品提取液（磷酸緩沖溶液，pH7.4），2 000～3 000 r·min-1離心20 min，收集上清液于4℃冰箱待測(cè)。

試劑盒及試驗(yàn)方法由上海酶聯(lián)生物公司提供，用純化的植物內(nèi)源激素捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被的微孔中分別加入不同花芽分化時(shí)期的待測(cè)液10 μL，加入稀釋液40 μL。隨后加入辣根過(guò)氧化物（HRP）酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，形成抗體—抗原—酶標(biāo)抗體復(fù)合物，置37℃烘箱中培育60 min。經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物A 液和B 液各50 μL 顯色，37℃避光顯色15 min。加入顯色劑HRP 酶50 μL 轉(zhuǎn)化成黃色后用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品內(nèi)源激素含量（ng·g-1FW）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用SigmaPlot 14.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤本月季“安吉拉”花芽分化過(guò)程

采用體視顯微鏡和石蠟切片觀察藤本月季“安吉拉”花芽分化的過(guò)程（見(jiàn)表1，圖1～2）可分為5個(gè)時(shí)期，共歷時(shí)30 d。2019年3月20日仍處于形態(tài)分化期（Ⅰ），5 d 后開(kāi)始進(jìn)入萼片原基分化期（Ⅱ），在生長(zhǎng)錐邊緣開(kāi)始出現(xiàn)萼片原基分化，隨后分別進(jìn)入花瓣原基分化期（Ⅲ）和雄蕊原基分化期（Ⅳ），花瓣原基與雄蕊原基幾乎同時(shí)圍繞生長(zhǎng)錐進(jìn)行輪狀分化，最后進(jìn)入雌蕊原基分化期（Ⅴ），扁平的生長(zhǎng)錐頂端突起分化出多個(gè)雌蕊原基，2019年4 月20 日左右完成花器官原基雛形成過(guò)程。不同花芽分化時(shí)期形態(tài)特征如下：

形態(tài)分化期：3 月中下旬，通過(guò)石蠟切片在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)幼葉包裹的圓錐狀突起結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2A），即為生長(zhǎng)錐，此時(shí)葉芽和花芽從外觀結(jié)構(gòu)上無(wú)明顯差別。在體視顯微鏡下解剖該時(shí)期新梢頂芽，也可見(jiàn)明顯綠色的凸起（見(jiàn)圖1A）。

表1 藤本月季“安吉拉”花芽分化進(jìn)程Table 1 Process flower bud differentiation in Rosa‘An‐gela’

萼片原基分化期：為3月底至4月初，生長(zhǎng)錐變扁平，并于生長(zhǎng)錐周圍產(chǎn)生5個(gè)小突起，為萼片原基（見(jiàn)圖1B～C，圖2B），不同萼片原基形成時(shí)期及大小不一致，分化完成后5個(gè)萼片原基大小基本一致。

花瓣原基分化期：為4月上旬，已分化出的5個(gè)萼片原基不斷向上伸長(zhǎng)變寬，同時(shí)萼片原基內(nèi)方開(kāi)始出現(xiàn)花瓣原基的突起（見(jiàn)圖1D，圖2C），且突起數(shù)目不斷增多，以輪狀形式排列（見(jiàn)圖1E，圖2D）。

雄蕊原基分化期：為4月上、中旬，花瓣原基內(nèi)側(cè)開(kāi)始產(chǎn)生突起（見(jiàn)圖1F，圖2E）即為雄蕊原基，萼片原基和花瓣原基不斷伸長(zhǎng)，雄蕊原基數(shù)目增多（見(jiàn)圖1G），在外輪雄蕊原基的下方繼續(xù)分化成數(shù)輪雄蕊原基（見(jiàn)圖1H）。

雌蕊原基分化期：為4 月下旬，雌蕊原基分化較雄蕊分化時(shí)期晚，雄蕊原基大量分化后，雄蕊原基頂部分化形成花藥，中下部分化成為花絲，生長(zhǎng)錐頂端繼續(xù)變寬平，其上開(kāi)始產(chǎn)生多個(gè)突起（見(jiàn)圖1I～J，圖2F），即雌蕊原基開(kāi)始分化，隨后生長(zhǎng)錐向下凹陷，花托邊緣向上伸長(zhǎng)，雌蕊原基位于花托中，且彼此分離（見(jiàn)圖2G），完成了花器官原基雛形的分化。

隨花發(fā)育雄蕊原基逐漸伸長(zhǎng)（見(jiàn)圖1J），花絲著生于花托邊緣，形成具多個(gè)雄蕊的雄蕊群。雌蕊原基頂端也逐漸分化成柱頭，中部延長(zhǎng)形成花柱，基部膨脹為子房，形成多個(gè)彼此分離的雌蕊群，著生于瓶裝花托中（見(jiàn)圖2H）。

2.2 花芽分化過(guò)程內(nèi)源激素的變化

由圖3可看出，花芽分化過(guò)程中脫落酸（ABA）濃度總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，萼片原基分化期ABA 濃度最高，為25.41 ng·g-1FW，但與花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期無(wú)顯著差異；雌蕊原基分化期ABA 濃度最低，為19.77 ng·g-1FW，且顯著低于其他時(shí)期。

赤霉素（GA）濃度隨花芽分化呈逐漸下降的趨勢(shì)，形態(tài)分化期GA 濃度最高，為12.28 ng·g-1FW。萼片原基分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期GA 濃度無(wú)顯著差異。雌蕊分化期時(shí)GA濃度最低，為9.20 ng·g-1FW，顯著低于其他時(shí)期。

細(xì)胞分裂素（CTK）濃度變化與ABA 相似，總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，萼片原基分化期CTK濃度最高，為15.04 ng·g-1FW，與花瓣原基分化期以及雄蕊原基分化期無(wú)顯著差異。CTK 濃度在雌蕊原基分化期達(dá)到最低，為12.70 ng·g-1FW，顯著低于其他分化時(shí)期。

生長(zhǎng)素（IAA）濃度變化呈逐漸上升趨勢(shì)，形態(tài)分化期最低，為660.74 ng·g-1FW；萼片原基分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期IAA濃度逐漸升高，但彼此無(wú)顯著差異；雌蕊原基分化期IAA濃度最高，為964.18 ng·g-1FW，顯著高于其他分化時(shí)期。

2.3 激素平衡與花芽分化的關(guān)系

圖4 可看出，CTK/GA 形態(tài)分化期時(shí)比值最低，為1.01，萼片原基分化期時(shí)比值顯著升高，與形態(tài)分化期差異顯著，與花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期無(wú)顯著性差異，雌蕊原基分化期時(shí)比值最高，為1.65，顯著高于其他分化時(shí)期。

IAA/GA 比值呈逐漸上升的趨勢(shì)，在形態(tài)分化期最低，為54.03，顯著低于雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。在雌蕊原基分化期時(shí)顯著增高，且高于其他時(shí)期，比值為106.24。

IAA/ABA 的比值總體呈逐漸上升的趨勢(shì)，在萼片原基分化期最低，但與形態(tài)分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期無(wú)顯著性差異。在雌蕊原基分化期時(shí)顯著增高，且高于其他時(shí)期，比值分別49.23。

（CTK+ABA）/GA 比值在形態(tài)分化前期時(shí)最低，為2.84，萼片原基分化期時(shí)比值顯著升高，與形態(tài)分化期差異顯著，與花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期無(wú)顯著性差異，雄蕊原基分化期時(shí)比值最高，為3.83。

3 討論

3.1 月季花芽分化形態(tài)結(jié)構(gòu)研究

前人研究發(fā)現(xiàn)月季的花芽分化呈螺旋狀，即先萼片，再花瓣、其次是雄蕊，最后是雌蕊的順序，且花瓣幾乎與最初的雄蕊同時(shí)開(kāi)始分化［8，11］。本研究發(fā)現(xiàn)藤本月季“安吉拉”花芽各部分分化順序由外向內(nèi)進(jìn)行，花芽分化分為5 個(gè)時(shí)期，生長(zhǎng)錐呈圓錐狀突起為形態(tài)分化期；生長(zhǎng)錐逐漸變寬圓，在生長(zhǎng)錐周圍出現(xiàn)5個(gè)萼片原基分化期；萼片原基內(nèi)方分化出花瓣原基，即為花瓣原基分化期；花瓣原基內(nèi)方分化出多個(gè)雄蕊原基，為雄蕊原基分化期；生長(zhǎng)錐繼續(xù)變寬，從扁平的生長(zhǎng)錐頂端形成多個(gè)突起為雌蕊原基，即為雌蕊原基分化期，花芽分化過(guò)程歷時(shí)30 d，藤本月季“安吉拉”花芽分化順序與前人研究結(jié)果一致。關(guān)于月季花芽分化過(guò)程的分期研究，馬子俊根據(jù)花芽的形態(tài)變化，將苦水玫瑰分化過(guò)程分為3 個(gè)階段［8］；王瑞勤等認(rèn)為玫瑰的花芽分化開(kāi)始于混合芽完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段之后，并將玫瑰的分化過(guò)程分為8個(gè)時(shí)期［12］；賀海洋等利用石蠟切片方法將單葉薔薇的花芽形態(tài)劃分為6個(gè)時(shí)期，分別為形態(tài)分化前、苞葉原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期［7］。胡祖坤通過(guò)石蠟切片觀察，將小姊妹月季花芽分化時(shí)期詳細(xì)分為了16 個(gè)時(shí)期［10］；Maas等通過(guò)掃描電鏡和光學(xué)顯微鏡研究Ro?sa‘Mercedes’的花芽分化時(shí)期，將其分為9 個(gè)時(shí)期［13］；范天剛等將月季‘芬得拉”花芽分化進(jìn)程劃分為5 個(gè)階段，分別為萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期和分化完成期［9］，本研究結(jié)果與范天剛研究結(jié)果相似。

3.2 花芽分化過(guò)程內(nèi)源激素含量變化

ABA 可加快有機(jī)物在地上部分的積累及植物的分化速度，有利于花芽分化［14］。本研究發(fā)現(xiàn)萼片原基分化時(shí)期ABA 含量達(dá)最高，顯著高于形態(tài)分化期，到雌蕊原基分化期其含量則為最低，顯著低于雄蕊原基分化期及花瓣原基分化期，與前人研究相似，說(shuō)明ABA 對(duì)藤本月季“安吉拉”的花芽分化具促進(jìn)作用。

CTK 能促進(jìn)花芽形態(tài)分化，較高的CTK 水平能促進(jìn)細(xì)胞分裂，打破生長(zhǎng)錐的頂端優(yōu)勢(shì)，解除腋芽的抑制，促進(jìn)生長(zhǎng)錐的分化［15～16］。本研究中CTK變化與ABA 變化相似，萼片原基分化時(shí)期含量最高，顯著高于形態(tài)分化期，雌蕊原基分化期其含量顯著低于雄蕊原基分化期及花瓣原基分化期，與前人研究相似，說(shuō)明較高的CTK 含量有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化。

GA 有效抑制RNA 合成，抑制成花基因的表達(dá)，從而減緩植物花芽分化進(jìn)程［17］。本文研究結(jié)果表明GA 在藤本月季“安吉拉”形態(tài)分化期含量最高，顯著高于其他分化時(shí)期，隨花芽分化進(jìn)程GA 不斷下降，雌蕊原基分化期其含量最低，GA 含量的降低有利于藤本月季“安吉拉”花芽的分化。

IAA 的相關(guān)研究一直存在爭(zhēng)議，樊衛(wèi)國(guó)等認(rèn)為較低IAA含量有利于刺梨的花芽分化［18］，而Costanti?ni，E通過(guò)基因轉(zhuǎn)入手段證實(shí)IAA促進(jìn)葡萄品種“湯姆遜無(wú)核”的花序形成［19］。本研究發(fā)現(xiàn)IAA的濃度在形態(tài)分化期時(shí)顯著低于其他時(shí)期，隨后IAA含量逐漸上升，并在雌蕊原基分化達(dá)到最高，說(shuō)明較低IAA濃度有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化。

3.3 內(nèi)源激素平衡與花芽分化的關(guān)系

Nooden 等認(rèn)為激素保持一定的平衡狀態(tài)才能有效調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及花芽分化［20］。目前，越來(lái)越多的學(xué)者把關(guān)注點(diǎn)放在激素平衡與花芽分化關(guān)系中，提出了CTK/GA、IAA/ABA、（ZR+ABA）/GA、IAA/GA 等激素之間的平衡關(guān)系，花序誘導(dǎo)中需要較低的IAA/GA 比值，較高的IAA/ZR含量有利于花序形成，ZR/GA 和（ZR＋ABA）/GA比值上升，可促進(jìn)植物花芽分化進(jìn)程［21～22］。本研究結(jié)果顯示，CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值在形態(tài)分化期時(shí)最低，萼片原基分化期顯著高于形態(tài)分化期，說(shuō)明萼片原基分化期CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值升高與花芽分化誘導(dǎo)有關(guān)，使植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變，進(jìn)入花芽分化階段；IAA/GA 和IAA/ABA 比值在形態(tài)分化期最低，隨花芽分化進(jìn)程逐漸升高，在雌蕊原基分化期增加顯著，且高于其他時(shí)期，說(shuō)明IAA/ABA 和IAA/ABA的升高可促進(jìn)花器官原基的進(jìn)一步發(fā)育，這與前人研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

本文通過(guò)體視顯微鏡及石蠟切片法將藤本月季“安吉拉”花芽分化過(guò)程共分為5 個(gè)時(shí)期，歷時(shí)30 d，分別為形態(tài)分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。不同花芽分化時(shí)期內(nèi)源激素的測(cè)定結(jié)果表明，ABA、CTK 濃度在萼片原基分化期顯著升高與花芽分化誘導(dǎo)有關(guān)，較低的IAA 濃度以及GA 濃度的降低有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化；萼片原基分化期CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值升高與花芽分化誘導(dǎo)有關(guān)，高水平的IAA/ABA 和IAA/GA比值與花器官原基的進(jìn)一步發(fā)育相關(guān)。

月季花芽分化是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，環(huán)境變化、基因調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累、外源激素的施用均會(huì)影響月季花芽分化，但具體的調(diào)控機(jī)制及相關(guān)影響因子還有待進(jìn)一步研究。