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        miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子的影響*

        2021-02-26 13:54:24姜楠陳鈺王卓娜于曉瑜
        西部醫(yī)學(xué) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:實驗

        姜楠 陳鈺 王卓娜 于曉瑜

        (葫蘆島市中心醫(yī)院龍灣院區(qū)血液透析室,遼寧 葫蘆島 125001)

        系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulo nephritis, MsPGN)是威脅公眾健康的常見疾病,其中炎癥在MsPGN中起著至關(guān)重要的作用[1],其中腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells, GMC)增生是MsPGN、糖尿病腎小球硬化等多種人類腎臟疾病的主要病變[2]。微小RNA(miRNA)是短的非編碼RNA,已被確定為一類新的內(nèi)源調(diào)節(jié)因子[3]。研究發(fā)現(xiàn),許多miRNA在腎臟中高表達(dá),異常表達(dá)可導(dǎo)致許多腎臟疾病,包括糖尿病腎病和腎癌。研究顯示,miR-148a-3p在狼瘡性腎炎小鼠模型及腎小球中細(xì)胞均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),減少miR-148a-3p表達(dá)能改善狼瘡性腎炎小鼠的腎功能[4]。本研究旨在探討miR-148a-3p是否對LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子的產(chǎn)生影響,為臨床上治療系膜增生性腎小球腎炎提供新的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)系購自中科院細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和TRIzol試劑均購自美國Gibco公司。LPS購自美國Biosharp公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自promega公司。TB GreenTMPremix Ex Taq II試劑盒購自TaKaRa公司。RIPA裂解液購自北京索萊寶公司。NF-κB p65、IκB和GAPDH抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。miR-148a-3p inhibitor由Genepharma(中國上海)合成。LipofectamineTM2000購自上海吉瑪公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京Vazyme公司。酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國BOSTER公司。PVDF膜購自Millipore公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBZY-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代時用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,2天更換一次培養(yǎng)基,以保證細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分。

        1.2.2 細(xì)胞分組 根據(jù)培養(yǎng)基是否添加miR-148a-3p inhibitor和LPS,可以分為3組:①對照組(簡稱control組):加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基;②LPS組[5]:加入LPS和含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,LPS的終濃度為10 μg/mL;③LPS+miR-148a-3p inhibitor組(簡稱miR-148a-3p inhibitor):轉(zhuǎn)染100 nmol/L miR-148a-3p inhibitor后加入10 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞。24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。

        1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HBZY-1細(xì)胞以1×105個/孔接種于24孔板,待細(xì)胞生長匯合率至70 %左右時,按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。各組細(xì)胞在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后,更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.2.4 克隆形成實驗 培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞以1×103個/孔接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。10天后,用結(jié)晶紫染色溶液染色細(xì)胞,并計數(shù)含有≥ 50個細(xì)胞的集落,用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡拍攝具有代表性集落并統(tǒng)計。實驗獨立重復(fù)3次。

        1.2.5 細(xì)胞凋亡實驗 培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞用冷的PBS清洗兩次,然后在結(jié)合緩沖液中重懸并稀釋至每1 mL液體中含1×105個細(xì)胞。嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗獨立重復(fù)3次。

        1.2.6 Hoeschst染色 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,棄去上清液,用緩沖液清洗細(xì)胞3次,加入適量的Hoechst染色液,全部覆蓋底部細(xì)胞,并將各組細(xì)胞置于培育箱中培養(yǎng)30 min,用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況,計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

        1.2.7 qPCR 使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA,用Nanodrop 2000儀器檢測樣品RNA濃度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照qPCR試劑盒說明書配置相應(yīng)的體系,每組設(shè)置3個復(fù)孔。使用TB GreenTMPremix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行qPCR。qPCR的條件如下:95℃ 30s(1循環(huán)),95℃ 5s、60℃ 30s(40循環(huán))。使用StepOnePlus儀器完成實驗后,采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。實驗獨立重復(fù)3次。其中使用的引物見表1。

        表1 引物序列

        1.2.8 Western blot 培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞用蛋白酶抑制劑裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白,用BCA法測定總蛋白含量。取等量蛋白質(zhì)樣品上樣,SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜,用5 %脫脂奶粉封閉1 h,之后加入稀釋后的NF-κB p65、IκB和GAPDH一抗,4℃搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次,每次10 mim,加入對應(yīng)于一抗種屬來源的稀釋后HRP標(biāo)記的二抗,在室溫?fù)u床上孵育1 h,用TBST洗膜3次,每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析

        1.2.9 酶聯(lián)免疫檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10的含量 培養(yǎng)結(jié)束后收集各組細(xì)胞于離心管中,1000 r/min 離心5min,收集上清液,按酶聯(lián)免疫試劑盒操作說明檢測細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-10含量。

        1.2.10 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)流程圖

        2 結(jié)果

        2.1 miR-148a-3p在LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)水平 與control組相比,LPS組中miR-148a-3p的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001);與LPS組比較,miR-148a-3p inhibitor組中miR-148a-3p的表達(dá)下調(diào)(P<0.001)。見圖2。

        圖1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)流程圖。

        圖2 miR-148a-3p在LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)情況

        2.2 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 與control組相比,LPS組HBZY-1細(xì)胞增殖能力顯著提高(P<0.001);與LPS組比較,miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞增殖能力下降(P=0.004),見圖3。

        圖3 克隆形成實驗檢測LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的情況

        2.3 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞流式術(shù)檢測結(jié)果和Hoechst染色實驗結(jié)果顯示:與control組相比,LPS組HBZY-1細(xì)胞凋亡能力顯著下降(P=0.036);與LPS組比較,miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞凋亡能力提高(P<0.001),見圖4。

        圖4 細(xì)胞流式術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

        2.4 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中NF-κB、IκB表達(dá)的影響 與control組相比,LPS組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(P=0.003,P=0.004),且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)(P=0.004,P<0.001);與LPS組比較,miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)(P=0.031),且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(P=0.037,P=0.005),見圖5。

        圖5 qPCR和Western blot檢測LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中NF-κB、IκB的表達(dá)情況

        2.5 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響 與control組比較,LPS組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量增加(P=0.003,P=0.035),IL-10含量減少(P<0.001);與LPS組比較,miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量減少(P=0.025,P=0.032),IL-10含量增加(P=0.038),見圖6。

        圖6 酶聯(lián)免疫法檢測LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量變化

        3 討論

        系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulo nephritis, MsPGN)是臨床常見的腎小球疾病,主要癥狀表現(xiàn)為系膜基質(zhì)增多及腎小球系膜細(xì)胞增生[6-7]。MsPGN的發(fā)病機制復(fù)雜,主要與免疫功能紊亂、凝血機制異常、遺傳、環(huán)境等因素相關(guān)[8]。腎小球細(xì)胞過度增生是腎小球硬化從而造成腎損傷最關(guān)鍵進(jìn)程[9]。目前西醫(yī)治療MsPGN的主要手段是激素、免疫抑制劑等,至今仍然沒有確切的藥物來治療該疾病。

        脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是內(nèi)毒素的一種,能夠促進(jìn)細(xì)胞因子釋放、趨化炎癥細(xì)胞[10-11]。研究證實,LPS可以誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖[12],已成為腎小球系膜細(xì)胞與腎纖維化研究的常用刺激物[13]。本實驗中,我們使用LPS誘導(dǎo)誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力增強,與上述文獻(xiàn)報道一致。

        微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度為 21~26個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA片段,主要通過抑制蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)節(jié)mRNA的剪切方式來調(diào)控靶基因[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、脂類代謝、等多種生理過程中發(fā)揮作用[16]。也有研究表明miRNA對炎癥及其相關(guān)反應(yīng)的發(fā)生具有一定的影響[17]。研究發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p在狼瘡性腎炎小鼠模型及腎小球中細(xì)胞均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[4],本實驗中我們先確定了miR-148a-3p在系膜增生性腎小球腎炎的表達(dá)情況,結(jié)果表明LPS組中miR-148a-3p的表達(dá)顯著上調(diào),與上述文獻(xiàn)報道一致。為了進(jìn)一步研究miR-148a-3p是否對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的增殖與凋亡產(chǎn)生影響,我們轉(zhuǎn)染了miR-148a-3p inhibitor,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p inhibitor使HBZY-1細(xì)胞增殖能力下降,凋亡能力提高。

        NF-κB是近年來研究較多的核轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控細(xì)胞因子、免疫分子等多種基因的表達(dá)[18-19]。正常情況下NF-κB磷酸化位點被IκB封閉,處于無活性狀態(tài)。在各種炎性損傷時,上游IKK激酶降解IκB后,使P65迅速轉(zhuǎn)移至核內(nèi),P65能識別特定的DNA序列,與某些炎癥因子基因啟動區(qū)或增強子上的IκB位點結(jié)合,啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子過量表達(dá),進(jìn)一步反饋激活NF-κB,從而放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)[20]。在炎癥發(fā)生中NF-κB可誘導(dǎo)炎癥因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6等在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)的表達(dá)[21-22]。我們進(jìn)一步探討了miR-148a-3p與炎性因子表達(dá)的關(guān)系,進(jìn)行了如下實驗:qPCR和Western blot結(jié)果顯示,與control組相比,LPS組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào),且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào),與LPS組比較,miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào),且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào);ELISA結(jié)果顯示,與control組比較,LPS組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量均增加,IL-10含量減少,與LPS組比較,miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量均減少,IL-10含量增加。因此,下調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

        4 結(jié)論

        miR-148a-3p在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中高表達(dá),下調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)可能抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其的凋亡,并調(diào)控炎性因子表達(dá),其可能的機制與炎性因子的表達(dá)活性調(diào)控有關(guān)。因此,miR-148a-3p可能成為有效治療系膜增生性腎小球腎炎的潛在治療靶點。

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