姜楠 陳鈺 王卓娜 于曉瑜

(葫蘆島市中心醫(yī)院龍灣院區(qū)血液透析室，遼寧 葫蘆島 125001)

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulo nephritis, MsPGN)是威脅公眾健康的常見疾病，其中炎癥在MsPGN中起著至關(guān)重要的作用[1]，其中腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells, GMC)增生是MsPGN、糖尿病腎小球硬化等多種人類腎臟疾病的主要病變[2]。微小RNA(miRNA)是短的非編碼RNA，已被確定為一類新的內(nèi)源調(diào)節(jié)因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA在腎臟中高表達(dá)，異常表達(dá)可導(dǎo)致許多腎臟疾病，包括糖尿病腎病和腎癌。研究顯示，miR-148a-3p在狼瘡性腎炎小鼠模型及腎小球中細(xì)胞均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，減少miR-148a-3p表達(dá)能改善狼瘡性腎炎小鼠的腎功能[4]。本研究旨在探討miR-148a-3p是否對LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子的產(chǎn)生影響，為臨床上治療系膜增生性腎小球腎炎提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)系購自中科院細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和TRIzol試劑均購自美國Gibco公司。LPS購自美國Biosharp公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自promega公司。TB GreenTMPremix Ex Taq II試劑盒購自TaKaRa公司。RIPA裂解液購自北京索萊寶公司。NF-κB p65、IκB和GAPDH抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。miR-148a-3p inhibitor由Genepharma(中國上海)合成。LipofectamineTM2000購自上海吉瑪公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京Vazyme公司。酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國BOSTER公司。PVDF膜購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBZY-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代時用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，2天更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分。

1.2.2 細(xì)胞分組 根據(jù)培養(yǎng)基是否添加miR-148a-3p inhibitor和LPS，可以分為3組：①對照組(簡稱control組)：加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；②LPS組[5]：加入LPS和含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，LPS的終濃度為10 μg/mL；③LPS+miR-148a-3p inhibitor組(簡稱miR-148a-3p inhibitor)：轉(zhuǎn)染100 nmol/L miR-148a-3p inhibitor后加入10 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞。24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HBZY-1細(xì)胞以1×105個/孔接種于24孔板，待細(xì)胞生長匯合率至70 %左右時，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。各組細(xì)胞在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 克隆形成實驗 培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞以1×103個/孔接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。10天后，用結(jié)晶紫染色溶液染色細(xì)胞，并計數(shù)含有≥ 50個細(xì)胞的集落，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡拍攝具有代表性集落并統(tǒng)計。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實驗 培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞用冷的PBS清洗兩次，然后在結(jié)合緩沖液中重懸并稀釋至每1 mL液體中含1×105個細(xì)胞。嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6 Hoeschst染色 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用緩沖液清洗細(xì)胞3次，加入適量的Hoechst染色液，全部覆蓋底部細(xì)胞，并將各組細(xì)胞置于培育箱中培養(yǎng)30 min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 qPCR 使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，用Nanodrop 2000儀器檢測樣品RNA濃度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照qPCR試劑盒說明書配置相應(yīng)的體系，每組設(shè)置3個復(fù)孔。使用TB GreenTMPremix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行qPCR。qPCR的條件如下：95℃ 30s(1循環(huán))，95℃ 5s、60℃ 30s(40循環(huán))。使用StepOnePlus儀器完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。實驗獨立重復(fù)3次。其中使用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.8 Western blot 培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞用蛋白酶抑制劑裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜，用5 %脫脂奶粉封閉1 h，之后加入稀釋后的NF-κB p65、IκB和GAPDH一抗，4℃搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 mim，加入對應(yīng)于一抗種屬來源的稀釋后HRP標(biāo)記的二抗，在室溫?fù)u床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析

1.2.9 酶聯(lián)免疫檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10的含量 培養(yǎng)結(jié)束后收集各組細(xì)胞于離心管中，1000 r/min 離心5min，收集上清液，按酶聯(lián)免疫試劑盒操作說明檢測細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-10含量。

1.2.10 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)流程圖

2 結(jié)果

2.1 miR-148a-3p在LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)水平 與control組相比，LPS組中miR-148a-3p的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)；與LPS組比較，miR-148a-3p inhibitor組中miR-148a-3p的表達(dá)下調(diào)(P<0.001)。見圖2。

圖1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)流程圖。

圖2 miR-148a-3p在LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 與control組相比，LPS組HBZY-1細(xì)胞增殖能力顯著提高(P<0.001)；與LPS組比較，miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞增殖能力下降(P=0.004)，見圖3。

圖3 克隆形成實驗檢測LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的情況

2.3 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞流式術(shù)檢測結(jié)果和Hoechst染色實驗結(jié)果顯示：與control組相比，LPS組HBZY-1細(xì)胞凋亡能力顯著下降(P=0.036)；與LPS組比較，miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞凋亡能力提高(P<0.001)，見圖4。

圖4 細(xì)胞流式術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

2.4 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中NF-κB、IκB表達(dá)的影響 與control組相比，LPS組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(P=0.003，P=0.004)，且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)(P=0.004，P<0.001)；與LPS組比較，miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)(P=0.031)，且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(P=0.037，P=0.005)，見圖5。

圖5 qPCR和Western blot檢測LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中NF-κB、IκB的表達(dá)情況

2.5 miR-148a-3p對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響 與control組比較，LPS組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量增加(P=0.003，P=0.035)，IL-10含量減少(P<0.001)；與LPS組比較，miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量減少(P=0.025，P=0.032)，IL-10含量增加(P=0.038)，見圖6。

圖6 酶聯(lián)免疫法檢測LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量變化

3 討論

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulo nephritis, MsPGN)是臨床常見的腎小球疾病，主要癥狀表現(xiàn)為系膜基質(zhì)增多及腎小球系膜細(xì)胞增生[6-7]。MsPGN的發(fā)病機制復(fù)雜，主要與免疫功能紊亂、凝血機制異常、遺傳、環(huán)境等因素相關(guān)[8]。腎小球細(xì)胞過度增生是腎小球硬化從而造成腎損傷最關(guān)鍵進(jìn)程[9]。目前西醫(yī)治療MsPGN的主要手段是激素、免疫抑制劑等，至今仍然沒有確切的藥物來治療該疾病。

脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是內(nèi)毒素的一種，能夠促進(jìn)細(xì)胞因子釋放、趨化炎癥細(xì)胞[10-11]。研究證實，LPS可以誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖[12]，已成為腎小球系膜細(xì)胞與腎纖維化研究的常用刺激物[13]。本實驗中，我們使用LPS誘導(dǎo)誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力增強，與上述文獻(xiàn)報道一致。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為 21～26個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA片段，主要通過抑制蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)節(jié)mRNA的剪切方式來調(diào)控靶基因[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、脂類代謝、等多種生理過程中發(fā)揮作用[16]。也有研究表明miRNA對炎癥及其相關(guān)反應(yīng)的發(fā)生具有一定的影響[17]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p在狼瘡性腎炎小鼠模型及腎小球中細(xì)胞均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[4]，本實驗中我們先確定了miR-148a-3p在系膜增生性腎小球腎炎的表達(dá)情況，結(jié)果表明LPS組中miR-148a-3p的表達(dá)顯著上調(diào)，與上述文獻(xiàn)報道一致。為了進(jìn)一步研究miR-148a-3p是否對LPS誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的增殖與凋亡產(chǎn)生影響，我們轉(zhuǎn)染了miR-148a-3p inhibitor，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p inhibitor使HBZY-1細(xì)胞增殖能力下降，凋亡能力提高。

NF-κB是近年來研究較多的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞因子、免疫分子等多種基因的表達(dá)[18-19]。正常情況下NF-κB磷酸化位點被IκB封閉，處于無活性狀態(tài)。在各種炎性損傷時，上游IKK激酶降解IκB后，使P65迅速轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，P65能識別特定的DNA序列，與某些炎癥因子基因啟動區(qū)或增強子上的IκB位點結(jié)合，啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子過量表達(dá)，進(jìn)一步反饋激活NF-κB，從而放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)[20]。在炎癥發(fā)生中NF-κB可誘導(dǎo)炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)的表達(dá)[21-22]。我們進(jìn)一步探討了miR-148a-3p與炎性因子表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)行了如下實驗：qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，LPS組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)，與LPS組比較，miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)，且IκB mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)；ELISA結(jié)果顯示，與control組比較，LPS組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量均增加，IL-10含量減少，與LPS組比較，miR-148a-3p inhibitor組HBZY-1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量均減少，IL-10含量增加。因此，下調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

miR-148a-3p在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-148a-3p的表達(dá)可能抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其的凋亡，并調(diào)控炎性因子表達(dá)，其可能的機制與炎性因子的表達(dá)活性調(diào)控有關(guān)。因此，miR-148a-3p可能成為有效治療系膜增生性腎小球腎炎的潛在治療靶點。