周劍 張香 劉林 梁濤

(自貢市第三人民醫(yī)院 1.骨科；2.藥劑科，四川 自貢 643020)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一種易發(fā)于青少年的原發(fā)于骨組織的惡性腫瘤，雖然手術(shù)聯(lián)合化療的綜合治療取得一定的進(jìn)步，但其易復(fù)發(fā)且易轉(zhuǎn)移，致殘率和死亡率依然很高，治療效果不理想[1]。從分子水平研究骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展已成為研究熱點，全新的特異性分子靶向治療為提高骨肉瘤的治療效果和方向提供了新思路[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA(long non-coding RNA)在骨肉瘤中異常表達(dá)，其通過與蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等相互作用影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[3]。通過研究在lncRNA骨肉瘤治療中的作用靶點可以為其治療提供一種新手段。腫瘤易感候選基因19(cancer susceptibility candidate 19，CASC19)是一種lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC19在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[4]。研究發(fā)現(xiàn)miR-490-3p通過靶向HMGA2抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。而lncRNA CASC19對骨肉瘤增殖、遷移和侵襲及其機(jī)制是否與miR-490-3p有關(guān)還尚未見報道，本實驗旨在研究lncRNA CASC19與miR-490-3p的關(guān)系及其對骨肉瘤增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤細(xì)胞系MG63、U2-OS、OS187和健康人成骨細(xì)胞hFOB1.19購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、DMSO、BCA試劑盒、PBS緩沖液購自Sigma公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 骨肉瘤細(xì)胞系MG63、U2-OS、OS187和健康人成骨細(xì)胞hFOB1.19使用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天換液一次，待細(xì)胞融和至80%左右時，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取常規(guī)培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞MG63用0.25 %胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、si-CASC19組(轉(zhuǎn)染si-CASC19)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-CASC19組(轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC19)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-490-3p組(轉(zhuǎn)染miR-490-3p mimics)、si-CASC19+anti-miR-con組(共轉(zhuǎn)染si-CASC19和anti-miR-con)、si-CASC19+ anti-miR-490-3p組(共轉(zhuǎn)染si-CASC19和anti-miR-490-3p)，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-490-3p和CASC19表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。miR-490-3p和CASC19分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，miR-490-3p上游引物序列：5′-GCAAACAACCATTCGGCTGTC-3′；下游引物序列：5′-CGCAGGTCCGGAGTAGGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGT GTCAT-3′；CASC19上游引物序列：5′-GAGGAAGG CAGCACAATGATG-3′；下游引物序列：5′-CTTGCC AGTGTCTTCTCCTGA-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 Western blot檢測蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，12000 g離心15min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 % 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)。

1.2.5 MTT檢測細(xì)胞增殖 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24h、48h、72h時加入20 μL(5 g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100%。

1.2.6 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 在各組細(xì)胞，胰酶消化后使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×104個/mL。細(xì)胞遷移實驗：取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室中，并置于含完全培養(yǎng)基的下室中，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)24h，取出小室，去除培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定30min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取5個視野拍照，計算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：以1:5比例加入RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，室溫下干燥后，按照細(xì)胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測CASC19對miR-490-3p的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示CASC19 3′UTR區(qū)域有miR-490-3p結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點CASC19的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-CASC19和MUT-CASC19)，取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細(xì)胞生長至80 %融合時，用LipofectamineTM2000將WT-CASC19和MUT-CASC19組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-con和miR-490-3p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤細(xì)胞系中CASC19和miR-490-3p的表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果(圖1)顯示，與健康人成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，骨肉瘤細(xì)胞系MG63、U2-OS、OS187中miR-490-3p的表達(dá)水平顯著降低，CASC19 的表達(dá)水平顯著升高(P< 0.05)。

圖1 骨肉瘤細(xì)胞系中CASC19和miR-490-3p的表達(dá)

2.2 干擾CASC19表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果(圖2A)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)；qRT-PCR檢測結(jié)果(圖2B)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組CASC19 的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果(圖2C，D)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞MG63中CDK1、Cyclin D1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)?？梢?，干擾CASC19表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖。

圖2 干擾CASC19表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖的影響

2.3 干擾CASC19表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63遷移和侵襲的影響 Transwell 法檢測結(jié)果(圖3A，B)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞MG63遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果(圖3C，D)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞MG63中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。可見，干擾CASC19表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63遷移和侵襲。

圖3 下調(diào)CASC19表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移、侵襲的影響

2.4 CASC19靶向調(diào)控miR-490-3p的表達(dá) 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到CASC19與miR-490-3p存在結(jié)合位點(圖4A)。熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果(圖4B)顯示，轉(zhuǎn)染野生型CASC19基因表達(dá)載體WT-CASC19后，相較于miR-con組，miR-490-3p組WT-CASC19骨肉瘤細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型CASC19基因表達(dá)載體MUT-CASC19后，相較于miR-con組，miR-490-3p組MUT-CASC19骨肉瘤細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著。Western blot檢測結(jié)果(圖4C)顯示，相較于si-con組，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞中miR-490-3p的表達(dá)水平顯著升高；相較于pcDNA組，pcDNA-CASC19組乳骨肉瘤細(xì)胞中miR-490-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)?？梢?，CASC19可靶向調(diào)控miR-490-3p的表達(dá)。

圖4 CASC19靶向調(diào)控miR-490-3p的表達(dá)

2.5 過表達(dá)miR-490-3p對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果(圖5A)顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組中miR-490-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果(圖5B，C，E，F(xiàn))顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組骨肉瘤細(xì)胞MG63中CDK1和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果(圖5D)顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組骨肉瘤細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果(圖5G)顯示，與miR-con組相比，miR-490-3p組骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)?？梢?，過表達(dá)miR-490-3p抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖。

圖5 上調(diào)miR-490-3p表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移、侵襲的影響

2.6 miR-490-3p抑制物部分逆轉(zhuǎn)沉默CASC19表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR檢測結(jié)果(圖6A)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組中miR-490-3p的表達(dá)水平顯著升高；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組中miR-490-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果(圖6C，D)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞MG63中CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組骨肉瘤細(xì)胞MG63中CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果(圖6B)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞活性顯著降低；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組骨肉瘤細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果(圖6E)顯示，與si-con組相比，si-CASC19組骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低；與si-CASC19+anti-miR-con組相比，si-CASC19+anti-miR-490-3p組骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)?？梢?，抑制miR-490-3p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)沉默CASC19表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

圖6 抑制miR-490-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默CASC19表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移、侵襲的抑制作用

3 討論

骨肉瘤在臨床骨科腫瘤中發(fā)病率最高，嚴(yán)重危害人類健康，其治療總體難度較大，隨著新的化療方式的出現(xiàn)，患者生存率和預(yù)后獲得了較大的改善，但骨肉瘤耐藥的出現(xiàn)導(dǎo)致其效果不佳[6]。分子靶向藥物在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，尋找可能的靶點對骨肉瘤治療提供了新途徑和前期的理論基礎(chǔ)[7]。長鏈非編碼RNA作為非編碼RNA的一種，其對骨肉瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移、侵襲以及骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥性和預(yù)后具有重要的調(diào)控作用，可作為骨肉瘤發(fā)病診斷和臨床治療潛在的生物標(biāo)志物[8]。研究發(fā)現(xiàn)CASC2在骨肉瘤中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[9]。CASC2通過miR-362-5p/Nf-κB調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的發(fā)生[10]。CASC2通過miR-18a抑制結(jié)腸癌的增殖[11]；CASC19可促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[4]；CASC11通過激活WNT/β-catenin通路以促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[12]；CASC15可通過調(diào)節(jié)miR-4310/LGR5/Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[13]；CASC15還通過靶向miR-33a-5p促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[14]。本研究結(jié)果顯示，CASC19在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，干擾CASC19表達(dá)均可抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移和侵襲；抑制CDK4、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)。

研究表明miRNA在骨肉瘤中差異性表達(dá)，miRNA可作為骨肉瘤診斷及預(yù)后的特異性無創(chuàng)生物學(xué)指標(biāo)[15]。研究發(fā)現(xiàn)miR-490-3p在骨肉瘤細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)[16]，miR-490-3p通過在骨肉瘤中靶向HMGA2來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡[17]；lncRNA CCAT1通過miR-490-3p上調(diào)TGFβR1，促進(jìn)TGFβ1誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞EMT[18]；CircSLC3A2通過miR-490-3p調(diào)節(jié)PPM1F表達(dá)在肝癌中起致癌因子的作用[19]。miR-490-3p可通過轉(zhuǎn)錄因子Smad2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移的功能[20]。TTTY10通過靶向調(diào)節(jié)miR-490-3p，并通過HMGB1信號通路影響宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[21]。本實驗結(jié)果顯示，在骨肉瘤細(xì)胞中miR-490-3p的表達(dá)水平顯著降低，過表達(dá)miR-490-3p可抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移和侵襲；抑制CDK4、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)。而且本實驗結(jié)果表明CASC19可靶向調(diào)控miR-490-3p的表達(dá)，抑制miR-490-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)干擾CASC19對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

4 結(jié)論

干擾lncRNA CASC19可能通過上調(diào)miR-490-3p的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這為骨肉瘤的防止治提供了新的靶點。