腐植酸類物質(zhì)（或譯為“腐殖物質(zhì)”）存在于海洋、河流、湖泊和土壤表層等所有生態(tài)系統(tǒng)中。這些系統(tǒng)中存在的腐植酸類物質(zhì)的量化處理，對于學(xué)術(shù)研究和商業(yè)運(yùn)作，特別是對農(nóng)業(yè)土壤和作物管理來說都是至關(guān)重要的。

農(nóng)業(yè)中腐植酸類物質(zhì)使用量的增加，促使生產(chǎn)者、消費(fèi)者和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對采用一種可靠的方法來定量腐植酸類物質(zhì)原礦和商業(yè)肥料產(chǎn)品中的活性成分，特別是對腐植酸和黃腐酸的定量產(chǎn)生了濃厚的興趣。腐植酸類產(chǎn)品的商業(yè)貿(mào)易和管理都是以腐植酸和黃腐酸在產(chǎn)品中的百分比為基礎(chǔ)的（授權(quán)使用的單位是%，而不是SI），故將其納入本標(biāo)準(zhǔn)中。

本標(biāo)準(zhǔn)文本制定了腐植酸和酸性疏水性黃腐酸的測定方法。該方法是在國際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)（IHSS）使用的從土壤樣品中萃取高純度腐植酸和疏水性黃腐酸的一種現(xiàn)行制備程序基礎(chǔ)上，由Stevenson詳細(xì)描述過的改進(jìn)型“經(jīng)典”技術(shù)。該“經(jīng)典”方法和IHSS法都是作為土壤有機(jī)質(zhì)分級制備方法研發(fā)出來的；它們并不是刻意用作定量分析方法的。從土壤腐殖質(zhì)中萃取腐植酸和黃腐酸的經(jīng)典方法，是用“強(qiáng)堿”萃取堿可溶物質(zhì)，然后將堿萃取液酸化，使腐植酸絮凝，將其從溶液中沉淀出來。用堿和酸處理后留在溶液中的物質(zhì)被稱作黃腐酸。

本方法對“經(jīng)典”技術(shù)作了如下幾方面的改進(jìn)：（1）腐植酸類物質(zhì)以“無灰”（即扣除無機(jī)鹽）為基礎(chǔ)來定量。（2）堿萃取過程在缺氧條件下進(jìn)行，以減少分析樣品的氧化。（3）將既溶于堿溶液又溶于酸溶液的物質(zhì)定義為黃腐酸級分。（4）可以對某些廠商聲稱的含腐植酸類物質(zhì)的材料中鑒別出非腐植酸類物質(zhì)。（5）進(jìn)一步將疏水性黃腐酸定義為“在pH=1情況下可與疏水樹脂結(jié)合的低硫物質(zhì)”，取代那種“黃腐酸是既溶于堿溶液又溶于酸溶液的物質(zhì)”的傳統(tǒng)的、或更通用的定義。這一更為嚴(yán)格的定義，對于將疏水性黃腐酸與無機(jī)鹽、多糖、氨基糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、酸類及碳水化合物區(qū)分開來是非常必要的，而這些物質(zhì)在采用“傳統(tǒng)”方法時(shí)都隨著腐植酸類物質(zhì)一起被萃取出來。

有關(guān)ISO/CD 19822的國際實(shí)驗(yàn)室的研究資料見附件B。

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用于商品肥料、土壤調(diào)理劑及地質(zhì)沉積物的干燥物料和液體物料中腐植酸和疏水性黃腐酸的分析規(guī)程。

2 標(biāo)準(zhǔn)文件

本文本無標(biāo)準(zhǔn)文件。

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文本。

ISO（國際標(biāo)準(zhǔn)化組織）和IEC（國際電工委員會(huì)）支持下列用于標(biāo)準(zhǔn)化術(shù)語數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址：

——ISO在線瀏覽平臺(tái)：https://www.iso.org/obp

——IEC電子百科：https://www.electropedia.org/

3.1 疏水性黃腐酸（hydrophobic fulvic acids）

元素硫（S）含量低于0.75%、可溶于堿溶液和酸溶液并在pH=1情況下被中等極性的高分子吸附樹脂吸附的物質(zhì)。該樹脂是專為吸附具有黃腐酸類典型分子量的兩性化合物而設(shè)計(jì)的一種吸附樹脂。

3.2 黃腐酸級分（fulvic fracition）

腐植酸類物質(zhì)的堿萃取物中既溶于堿溶液又溶于酸溶液的部分。

3.3 腐植酸（humic acids）

不溶于強(qiáng)酸、并在pH=1的酸溶液中從堿萃取物中沉淀出來的腐植酸類物質(zhì)。

3.4腐植酸類物質(zhì)（humic substances）

天然有機(jī)物質(zhì)的主要有機(jī)組分，是由植物和微生物殘?bào)w通過生物化學(xué)反應(yīng)、經(jīng)腐朽和轉(zhuǎn)化而形成的一類非均一復(fù)雜混合物組成的碳基物質(zhì)。

3.5 木質(zhì)素磺酸鹽（lignosulfonates）

由軟木材亞硫酸鹽制漿中提取出來的淺色至深褐色無定型粉末或液體。該木質(zhì)素骨架是三種芳香醇類（松柏醇、p-香豆醇和芥子醇）構(gòu)成的磺化無規(guī)聚合物，其中松柏醇是其基本單元。

4 原理

4.1 本方法規(guī)定，從原料中分離出來的腐植酸和疏水性黃腐酸的數(shù)量以無灰基表達(dá)。

4.2 提取腐植酸和疏水性黃腐酸的方法是，用強(qiáng)堿萃取堿可溶物，然后脫除不溶物，將堿溶液酸化，使腐植酸絮凝出來。

4.3 脫除腐植酸后留下的上清液被稱作黃腐酸級分。該黃腐酸級分中可能還有疏水性黃腐酸，可通過一種專用的甲基丙烯酸酯樹脂進(jìn)行選擇性吸附，將疏水性黃腐酸和非腐植酸化合物分開，以確定黃腐酸級分中的疏水性黃腐酸數(shù)量。

5 警告

5.1 要求

以液化概率50%作為液化和非液化的判別界限，{q，lnRcs}得到的模型的訓(xùn)練和預(yù)測的混淆矩陣如表2所示，當(dāng)實(shí)際類別和預(yù)測類別一致時(shí)為正確判別，否則為錯(cuò)判。可以看到更多的非液化被錯(cuò)判為液化，這對工程實(shí)踐而言是有利的，因?yàn)閷?shí)際液化而錯(cuò)判為非液化的后果要比實(shí)際非液化而錯(cuò)判為液化的后果嚴(yán)重。訓(xùn)練和預(yù)測的準(zhǔn)確率分別為85.7%和87.7%，這與Juang等[13]和潘建平等[18]的結(jié)果相近。雖然準(zhǔn)確率是個(gè)非連續(xù)變量，但仍可作一定的參考。

5.1.1 良好的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范

應(yīng)該始終遵守有關(guān)人身安全保護(hù)裝置的標(biāo)準(zhǔn)（如ISO/IEC 17025）規(guī)定（在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿操作時(shí)佩戴防護(hù)眼鏡）。

5.1.2 濕度控制

腐植酸和黃腐酸是吸潮材料。在處理干物料時(shí)，防止其吸潮是至關(guān)重要的。

5.2 木質(zhì)素磺酸鹽

木質(zhì)素磺酸鹽會(huì)損壞樹脂。本分析方法不能區(qū)分木質(zhì)素磺酸鹽和疏水性黃腐酸，因此，建議事先排除未知來源液體產(chǎn)品中存在的木質(zhì)素磺酸鹽。詳見附錄A。

5.3 溫度的控制

在干燥腐植酸和黃腐酸分析樣品時(shí)，溫度不能超過65 ℃。在高溫下樣品會(huì)分解。

6 試劑

6.1 0.1 M NaOH溶液：稱取純度為99.99%的NaOH 3.99 g，溶于1 L去離子水中。

6.2 0.5 M NaOH溶液：稱取純度為99.99%的NaOH 19.99 g，溶于1 L去離子水中。

6.3 6 M HCl溶液：用等體積的去離子水稀釋12 M的HCl。

6.4 1 M HCl溶液：用1 L去離子水稀釋83.3 mL 12 M的HCl。

6.5 0.1 M HCl溶液：用去離子水按1∶10的比例將6.4制備的1 M HCl稀釋，最終體積達(dá)到1 L。

6.6 氮?dú)饧兌葹?9.9%（UN1066）。

6.7 甲基丙烯酸酯樹脂：40～60目，孔體積約0.9 mL/g，平均孔徑225，表面積160 mL/g，可吸附分子量高達(dá)150000 MW的物質(zhì)，例如選擇Supelite DAX-8樹脂，或滿足同等條件的任何其他樹脂。

6.8 Amberlite IR-120強(qiáng)陽離子交換樹脂：氫型。

6.9 去離子水。

6.10 丙酮。

7 儀器

7.1 帶濕氣保護(hù)裝置的分析天平：稱量能力210 g，可讀數(shù)±0.0001 g。

7.2 干燥箱：120 ℃可控，精度±3 ℃。

7.3 離心機(jī)：最小分離因素（相對離心力）1500 xg，容許能力3900 xg。

7.4 4～50 mL或250 mL聚乙烯（或高密度聚乙烯）離心管，或可耐600 ℃高溫的重型耐溫離心管（如：Kimble Chase產(chǎn)，標(biāo)號為45212-50的KIMAX玻璃試管）。

7.5 4～100 mL寬型坩堝（如標(biāo)號為FB-965-M的Fisher Scientific產(chǎn)品）。

7.6 400 mL容量的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

7.7 磁攪拌器和5～7 cm的磁攪拌棒。

7.8 pH計(jì)與電極。

7.9 帶探測器的電導(dǎo)儀：按標(biāo)準(zhǔn)條款測定的校正單元常數(shù)約為1。

7.10 分光光度計(jì)：350 nm下的測量能力為±0.005個(gè)吸光單元。

7.11 蠕動(dòng)泵，最小流速1.2 mL/min，附帶配管。7.12 馬弗爐。

7.13 旋轉(zhuǎn)振動(dòng)混合機(jī)。

7.14 干燥器，內(nèi)裝硅膠（或等效替代物）作干燥劑。

7.15 錐形瓶，1000 mL。

7.16 燒杯，4 L。

7.17 量筒，1000 mL。、

7.18 玻璃色譜柱，4 cm×25 cm，用于DAX-8樹脂。

7. 19玻璃色譜柱，5 cm×60 cm，用于IR120 H+交換樹脂。

7.20 陶瓷研缽和杵。

7.21 篩子，74 μm（200 US目）。

7.22封口膜（Parafilm?）。

注：Parafilm?是美國威斯康星州尼納Bemis NA公司的一個(gè)商標(biāo)名。提供這一信息是為了便于本標(biāo)準(zhǔn)文本的使用，但并不構(gòu)成ISO對該命名產(chǎn)品的認(rèn)可。如果證明等價(jià)的產(chǎn)品也具有同樣的效果，就可以使用。它是一種柔軟的、有塑性的、無味的、半透明的黏性熱塑性塑料，通常用于密封或保護(hù)容器。

8 坩堝的準(zhǔn)備及樣品的干燥和稱重

8.1 坩堝的準(zhǔn)備

8.1.1 如果使用新坩堝，應(yīng)首先用丙酮洗滌，然后在105 ℃的干燥箱中烘2 h。

8.1.2 對以前用過的舊坩堝，應(yīng)先用丙酮洗滌，然后在500 ℃的馬弗爐中灼燒2 h。將坩堝放入干燥器中冷卻至室溫。從干燥器中取出坩堝，記錄其重量至小數(shù)后4位。

8.2 固體分析樣品的干燥和稱重

8.2.1 如果分析樣品是固體物質(zhì)，應(yīng)粉碎至≤75 μm，并縮分出約5 g試樣，以確保其更加均質(zhì)。

8.2.2 將5 g左右的樣品轉(zhuǎn)入按8.1程序準(zhǔn)備好的100 mL坩堝中。

8.2.3 將分析樣品放入干燥箱中，在62±3 ℃（不超過65 ℃）下烘24 h。如果在干燥過程中出現(xiàn)任何結(jié)塊，應(yīng)用玻璃棒打碎。繼續(xù)干燥，直到將樣品干燥到恒重。此過程可能要長達(dá)24 h。

8.2.4 達(dá)到恒重后，將樣品從干燥箱中取出，立即放入干燥器中冷卻。

注：腐植酸和黃腐酸是吸濕性物料，在處理這類物料時(shí)，防止其吸潮是至關(guān)重要的。

8.2.5 從干燥的分析樣品中稱出約2.5 g測試樣于按8.1程序預(yù)干燥過的坩堝中，在此操作過程中，要注意防止吸潮。稱出測試樣重+坩堝重，準(zhǔn)確到小數(shù)后4位。立即執(zhí)行9.1步驟，或者將含有測試樣品的坩堝放回干燥器。

8.2.6 從“測試樣重+坩堝重”減去坩堝重，算出測試樣重，記錄結(jié)果以“測試樣干重”表示。

8.3 液體樣品的干燥和稱重

8.3.1 對于液體樣品來說，應(yīng)將其放入可震蕩的容器中震蕩1 min，以使樣品充分均質(zhì)化。從分析樣品中稱出5 g左右測試樣（準(zhǔn)確至小數(shù)后4位），將其記錄為“液體測試樣”。

對于預(yù)計(jì)疏水性黃腐酸含量＜1%的液體分析樣品，需稱取10 g測試樣。

8.3.2 按8.2.2至8.2.6步驟對測試樣進(jìn)行干燥和稱重。

9 萃取程序

9.1 就這一步驟來說，固體和液體樣品的處理方法是相同的。

將制備好的測試樣轉(zhuǎn)到帶有5～7 cm長攪拌棒的1 L錐形瓶中。在連續(xù)攪拌下加入0.1 M NaOH，最終加到1 L。往瓶子上部空間充N2氣，再用封口膜覆蓋（或用類似的材料密封瓶口）。然后，在磁攪拌器上進(jìn)行強(qiáng)混合（即300～400 r/min）。液體樣品攪拌1 h，固體樣品攪拌16～18 h。

注：對固體樣品來說，可在當(dāng)天稍晚些時(shí)候開始攪拌。這樣，可以攪拌過夜。

9.1.1 攪拌后，將瓶子從攪拌器上取下，轉(zhuǎn)移到合適的離心管中，整體在3900 xg的分離因素下離心30 min，以便從堿萃取液中脫除任何不溶物。小心地將堿萃取液轉(zhuǎn)移至裝有磁攪拌棒的1 L干凈錐形瓶中，丟棄不溶物。

9.1.2 在輕輕攪拌溶液的情況下，向堿萃取液中滴加6 M（1∶1）HCl，以調(diào)節(jié)堿萃取液的pH，直到pH達(dá)到1±0.1，以便將腐植酸從酸溶液中絮凝出來。

9.1.3 用封口膜覆蓋瓶子，攪拌混均1 h。1 h后核查pH值，有必要時(shí)，再用6 M HCl將pH調(diào)到1±0.05。如果pH低于0.95，則用0.5 M NaOH溶液調(diào)回到pH=1±0.05。連續(xù)混勻酸化的萃取液，直到在5 min時(shí)觀察其pH穩(wěn)定在1±0.05為止。pH穩(wěn)定后，不應(yīng)使酸化了的萃取液放置超過5 min。取下pH電極。

9.2 腐植酸的分離

9.2.1 pH一旦穩(wěn)定后，將瓶子從混合機(jī)上取下，用封口膜覆蓋瓶口。將調(diào)節(jié)好pH的萃取液靜置4 h±5 min（不超過4 h）。這個(gè)階段對阻止腐植酸與疏水性黃腐酸的繼續(xù)分離是很關(guān)鍵的。被絮凝的腐植酸會(huì)從溶液中脫離出來。

9.2.2 立即用已稱重的50 mL離心管在3900 xg下離心30 min，以回收絮凝出來的腐植酸。輕輕地潷出上清液（黃腐酸級分），小心不要讓任何絮凝出的腐植酸攜帶出來。一般情況下，可傾倒出大約500 mL不夾帶絮凝腐植酸的清澈萃取液。如果進(jìn)行疏水性黃腐酸分析的話，應(yīng)將其傾倒于1 L錐形瓶中（或者：采用重型高溫離心杯代替塑料離心杯，即取消將絮凝腐植酸向坩堝轉(zhuǎn)移的必需步驟，以減少勞動(dòng)量，提高精確度）。

9.2.3 將盛有絮凝腐植酸的離心管再于1500 xg下離心20～30 min，以進(jìn)一步將殘余的腐植酸沉淀從液體黃腐酸級分中分離出來。如果還準(zhǔn)備分析疏水性黃腐酸，需將此上清液也慢慢倒入9.2.2得到的黃腐酸級分清液中。

9.2.4 如果使用高溫離心管，需將盛有絮凝腐植酸的離心管放入62±3 ℃的干燥箱中。如果使用塑料或低溫離心管，需仔細(xì)地將杯中的絮凝腐植酸全部刮入按8.1準(zhǔn)備好的100 mL寬型坩堝中。刮出絮凝腐植酸后，往離心杯中注入少量去離子水，擰緊管蓋，使勁搖動(dòng)帶蓋的離心管，將去離子水/絮凝腐植酸混合物全部轉(zhuǎn)入坩堝中。無論是用重型離心管還是用坩堝，都需在62±3 ℃的干燥箱中將絮凝腐植酸干燥到恒重（一般需過夜）。用玻璃棒打碎干燥時(shí)形成的任何結(jié)塊，要注意避免任何物料從管中掉出去。干燥過程可能延長到24 h，這取決于腐植酸的來源。

注：高溫離心管可放置在幾個(gè)50 mL燒杯中，再放入干燥箱。

9.2.5 絮凝腐植酸一旦干燥到恒重，從干燥箱中取出管子/坩堝，立即放入干燥器中冷卻。冷卻到室溫后，再對盛有絮凝腐植酸的管子/坩堝稱重。此操作過程要注意減少吸潮。記錄干燥的絮凝腐植酸+管子/坩堝的總重量，扣除管子/坩堝的重量，得到干燥的絮凝腐植酸的重量。

10 灰分的測定

10.1 在這一階段，干燥的絮凝腐植酸會(huì)殘留一定量的灰分。無論是重型離心管中，還是坩堝（按8.1制備的）中，干燥絮凝腐植酸的灰分的測定都是在500 ℃的馬弗爐中灼燒4 h，直到恒重。如果在灰化時(shí)形成任何固體團(tuán)塊，應(yīng)小心地用玻璃棒擊碎。不能使用金屬棒。

10.2 當(dāng)達(dá)到恒重后，將盛有絮凝腐植酸灰的管子/坩堝從馬弗爐中取出，放入干燥器中冷卻到室溫。

10.3 冷卻后，稱出管子/坩堝+灰的總重量減去管子/坩堝的重量，得到灰的重量，記錄為“絮凝腐植酸灰重”。

11 疏水性黃腐酸的分離

11.1 疏水性黃腐酸是用酸性疏水樹脂（即Supelite XAD-8）從黃腐酸級分中選擇性吸附的另一類酸性可溶物，親水性的酸性可溶物則不與樹脂結(jié)合而被排除在外。成熟的技術(shù)是，將該樹脂事先在防空氣袋中用去離子水浸潤，往4 cm×25 cm的玻璃色譜柱中部分填充280 mL樹脂，由濕樹脂頂部到柱子頂部應(yīng)保留大約2.5 cm的空間（圖1）。留有充足空間的目的是便于監(jiān)控通過柱子的液體流速。如果使用新樹脂，應(yīng)事先采用14.1的方法凈化。色譜柱中的樹脂使用后，需按14.1.3的方法再生。當(dāng)天使用完的樹脂，應(yīng)在甲醇中保存。再次使用前，應(yīng)在大燒杯中通過懸浮法用去離子水沖洗樹脂，直到將甲醇全部脫除（可溶有機(jī)碳低于2 mg/L）。如果樹脂變色，或使用了15次左右，應(yīng)該采用監(jiān)控材料進(jìn)行一次質(zhì)量控制試驗(yàn)。必要時(shí)，可用14.1的方法清洗樹脂，或者將其丟棄，換用新樹脂。

11.2 黃腐酸級分溶液被一個(gè)蠕動(dòng)泵送到柱子頂部并穿過整個(gè)柱子，該泵設(shè)置了一定的壓力，以保證足夠的流速將液體覆蓋住柱子中的樹脂，使其既不溢出柱子又不使樹脂暴露在空氣中。建議流速為4～5 mL/min。不可使溶液的水平面低于樹脂的頂部。將流出廢液丟棄。

11.3 隨后，通過蠕動(dòng)泵在足夠的壓力下用去離子水沖洗柱子，此流速（4～5 mL/min）足以保證覆蓋樹脂。連續(xù)洗滌直到流出液的紫外光吸收率A=0.015（350 nm），或流出液達(dá)柱體積的2倍（不超過2倍）為止。以上兩點(diǎn)，以先發(fā)生者為準(zhǔn)。丟棄廢液。

11.4 然后，通過蠕動(dòng)泵用0.1 M NaOH將疏水性黃腐酸從樹脂中反洗脫（即洗脫液從柱子底部導(dǎo)入）出來（流速4～5 mL/min），收集含疏水性黃腐酸的流出液。用分光光度計(jì)檢測其流出液的吸光率A=0.03（350 nm），或流出液達(dá)柱體積的3倍（不超過3倍）為止。以上兩點(diǎn)，以先發(fā)生者為準(zhǔn)。

圖1 從黃腐酸級分中分離疏水性黃腐酸的裝置示例

12 氫離子交換

12.1 按14.2的方法制備氫型（H+）離子交換樹脂。按14.2.1的方法往5 cm×50 cm色譜柱中注入500 mL制備好的H+交換樹脂。將含疏水性黃腐酸的溶液泵到柱子頂部，僅靠溶液重力使其穿過柱子。重復(fù)該步驟，總共兩次通過柱子。這一步驟的目的是用H+置換疏水性黃腐酸上的Na+，使疏水性黃腐酸質(zhì)子化。

12.2 用500 mL去離子水洗滌柱子。將流出的洗滌水添加到12.1的質(zhì)子化疏水性黃腐酸溶液中。

12.3 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在65 ℃下（不超過65 ℃）將疏水性黃腐酸濃縮到50～60 mL。

12.4 用8.1準(zhǔn)備好的坩堝干燥疏水性黃腐酸濃縮液，記錄坩堝的重量。將蒸發(fā)剩余的疏水性黃腐酸濃縮液轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的坩堝中。在干燥箱中62±3 ℃（不超過65 ℃）下將疏水性黃腐酸濃縮液干燥到恒重，并破碎所形成的任何團(tuán)塊。

12.5 恒重后，將盛有疏水性黃腐酸濃縮物的坩堝放入干燥器，使其冷卻到室溫。記錄坩堝+疏水性黃腐酸濃縮物總重量。減去坩堝重量，即得干燥疏水性黃腐酸的重量。

12.6 測定疏水性黃腐酸中殘留的灰分?；曳譁y定程序與10腐植酸灰分的測定相同，采用準(zhǔn)備好的坩堝或重型離心管均可。

12.7 通過13.2～13.4的方法計(jì)算疏水性黃腐酸的百分含量（%）。

13 計(jì)算

13.1 無灰腐植酸重量的確定

灰分%=（絮凝腐植酸的灰重÷干燥后絮凝腐植酸重）×100

無灰腐植酸重量=干燥后絮凝腐植酸重×（1-灰分%）

13.2 無灰疏水性黃腐酸重量的確定

灰分%=（疏水性黃腐酸的灰重÷干燥后疏水性黃腐酸重）×100

無灰疏水性黃腐酸重量=干燥后疏水性黃腐酸重×（1-灰分%）

13.3 固體分析樣品%的確定

固體分析樣品%=（無灰分析樣品重÷干燥的試樣重）×100

13.4 液體分析樣品%的確定

液體分析樣品%=（無灰分析樣品重÷液體試樣重）×100

14 樹脂的再生及柱子的制備

14.1 概述

14.1.1 色譜樹脂的制備

無論用新樹脂還是用變了色的舊樹脂，其制備程序都是很重要的。要用甲醇、乙醚、乙腈和甲醇依次連續(xù)進(jìn)行索氏萃取8 h（分別2 h）。如果制備后的樹脂不立即使用，應(yīng)浸泡在甲醇中保存。

14.1.2 色譜柱的制備

在裝填柱子之前，應(yīng)該在大燒杯中通過懸浮法用去離子水沖洗樹脂上的甲醇，直到去掉甲醇為止（可溶有機(jī)碳不超過2 mg/L）。往柱子中裝填280 mL樹脂后，先用0.1 N NaOH、再用0.1 N HCl交替沖洗3次，以脫除樹脂中可能包含的其他雜質(zhì)。

14.1.3 色譜樹脂的再生

再生是在裝有280 mL樹脂的4 cm×25 cm的色譜柱上進(jìn)行的，用蠕動(dòng)泵將其2倍柱體積的去離子水泵到柱子頂部，使水僅靠重力流下來。然后通入1倍柱體積的0.1 M HCl，使其穿過柱子底部。

14.2 氫型（H+）交換樹脂的再生

14.2.1 H+交換樹脂的再生是按批量過程進(jìn)行的，在一個(gè)4 L的燒杯中，一次至少放入500 mL樹脂，倒出樹脂中存在的任何液體，用1 M HCl覆蓋，至少放置30 min，每隔5 min攪拌1次。用傾瀉法將多余的HCl倒出，用去離子水覆蓋樹脂。用攪拌棒使勁攪拌15 s，然后靜置5 min。倒出水，再用去離子水覆蓋，使勁攪拌。

14.2.2 在5 cm×50 cm的柱子中裝填500 mL再生過的H+交換樹脂。裝填完畢后，用去離子水洗滌，直到用AgNO3檢測流出水中無Cl-為止。

附錄A（實(shí)用性資料）確認(rèn)存在木質(zhì)素磺酸鹽的程序

A.1 概述

按經(jīng)典定義，從腐殖化的物料中萃取出來的可溶于酸和堿的物質(zhì)是黃腐酸。但本文將可溶于酸和堿的物質(zhì)定義為“黃腐酸級分”，因?yàn)樵S多物質(zhì)都適用于廣義的操作性定義。該黃腐酸級分可能會(huì)、也可能不會(huì)含有我們感興趣的分析物質(zhì)——疏水黃腐酸。由于市場上將某些物質(zhì)，特別是木質(zhì)素磺酸鹽也稱作黃腐酸，因此有必要事先鑒別木質(zhì)素磺酸鹽存在的可能性。

警告——用于本文的疏水性吸附樹脂與木質(zhì)素磺酸鹽是不兼容的。木質(zhì)素磺酸鹽不能定量地從樹脂中解吸，并可能永久性損壞樹脂。

A.1.1 腐植酸類物質(zhì)是無味的，或有輕微的石油類氣味。木質(zhì)素磺酸鹽具有亞硫酸鹽特有的味道，因?yàn)樗鼈兪怯脕喠蛩猁}處理過的木材木質(zhì)素衍生物。由于感官檢查是不能確定的，故木素磺酸鹽的預(yù)篩查首先是通過分析元素硫（S）來完成。

A.2 硫的濃度

木質(zhì)素磺酸鹽中的總硫濃度通?！?%。腐植酸類物質(zhì)中的硫一般＜1%，平均0.6%。用傅立葉變換紅外光譜（FTIR）可以檢測到總元素硫（S）超過0.75%的任何產(chǎn)品，用以確定是否存在木質(zhì)素磺酸鹽。

A.3 FTIR分析

FTIR基于化學(xué)鍵彎曲或伸展引起的紅外光吸收變化的原理。Mid-FTIR可記錄波數(shù)在4000 cm-1到400 cm-1之間釋放的能量?？捎^察到的物質(zhì)的紅外光譜吸收峰與其組成物質(zhì)原子間鍵合的振動(dòng)頻率相對應(yīng)。由于沒有兩種化合物會(huì)準(zhǔn)確產(chǎn)生同樣的紅外光譜，故FTIR分析一般用于確定的物質(zhì)。許多商業(yè)實(shí)驗(yàn)室都提供FTIR分析并給出解釋報(bào)告。

A.3.1 磺酸鹽鍵的光譜

木質(zhì)素磺酸鹽中硫-氧鍵，是由如下特征吸收峰確定的：1030～1041 cm-1處為亞砜單一S=O鍵對稱振動(dòng)，1150～1200 cm-1為O=S=O對稱振動(dòng)，1330～1430 cm-1附近的峰為磺酸鹽O=S=O的不對稱振動(dòng)。在木質(zhì)素磺酸鹽濃度低于500 mg/kg的復(fù)雜混合物中，Mid-FTIR很難將其檢測出來。但是，木質(zhì)素磺酸鹽缺乏1700～1730 cm-1處出現(xiàn)的脂肪族羧酸C=O伸展振動(dòng)的尖峰，而1680～1710 cm-1處則顯示出芳香族羧酸C=O特有的伸展振動(dòng)弱峰。因此，缺乏這些吸收峰就可以排除疏水性黃腐酸的存在，而不能確定是否存在木質(zhì)素磺酸鹽。見圖1。

圖1 商品木質(zhì)素磺酸鹽的代表性光譜

A.3.2 黃腐酸的光譜

腐植酸和黃腐酸顯示出相似的光譜帶，都在1620 cm-1和1720 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)雙峰。在1600～1710 cm-1范圍的波數(shù)對應(yīng)于芳香族C=O的伸縮振動(dòng)，而1700～1730 cm-1是脂肪族C=O的伸縮振動(dòng)。對于1720 cm-1處的峰來說，黃腐酸比腐植酸更強(qiáng)，因?yàn)榍罢叩聂然–OOH）較多。在木質(zhì)素磺酸鹽中，這些吸收帶都很弱或者沒有。典型的情況是，在1220 cm-1和1400 cm-1附近有兩個(gè)較弱的、但明顯的峰，它們分別是羧酸的C-O伸縮（1210～1320 cm-1）和O-H平面彎曲（1395～1440 cm-1）振動(dòng)吸收。見圖2和圖3。

A.3.3 光譜分析參數(shù)

樣品介質(zhì)：水

光譜波數(shù)范圍：Mid-IR（4500～600 cm-1）

孔障：Happ-Genzel

分辨率：4 cm-1

掃描數(shù)：16～64

溫度：296 K

圖2 國際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)薩旺尼河黃腐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品2S103F的光譜

圖3 國際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)薩旺尼河黃腐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品2S103F的Mid-FTIR光譜600～ 1900 cm-1細(xì)節(jié)

附錄B（實(shí)用性資料）ISO/CD 19822國際實(shí)驗(yàn)室研究

ISO/CD 19822國際實(shí)驗(yàn)室研究的目的是根據(jù)ISO 5725-2：1994《測試方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度） 第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測試方法重復(fù)性和可再現(xiàn)性的基本方法》中的精確度對來自11個(gè)參與的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?！熬_度”指的是各參與實(shí)驗(yàn)室采用同樣的方法對同樣的物料所測定結(jié)果之間的一致性，其產(chǎn)生的偏差可能來源于試驗(yàn)條件的差異。

2016年2月，我們向各個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)出邀請函，請他們參與ISO國際實(shí)驗(yàn)室研究，即對商業(yè)產(chǎn)品中的腐植酸和疏水性黃腐酸進(jìn)行分析。6個(gè)國家的12個(gè)實(shí)驗(yàn)室同意參加該研究，并表示遵守如下準(zhǔn)則：

（1）在開始研究時(shí)，所有必需的儀器、化學(xué)品及方法中指定的其他必需品，都可以在他們的實(shí)驗(yàn)室找到。

（2）對規(guī)定的“時(shí)間”要求，如項(xiàng)目的開始日期、完成日期，應(yīng)該嚴(yán)格執(zhí)行。

（3）分析規(guī)程應(yīng)嚴(yán)格遵守，不能修改。

（4）有資質(zhì)的操作人員才能進(jìn)行分析工作。

（5）各項(xiàng)分析都應(yīng)該在重復(fù)條件下進(jìn)行，即在不同的日期，由同一個(gè)操作員用同一臺(tái)儀器進(jìn)行分析。

（6）要求參與者提供的報(bào)告必須是4次重復(fù)分析的結(jié)果，無論出現(xiàn)任何矛盾數(shù)據(jù)，都不能丟棄或者修改。

國際實(shí)驗(yàn)室于2016年6月開始第一階段的前期研究。

B.1 第一階段

包括采用ISO/CD 19822程序?qū)η捌谘芯康膶?shí)習(xí)樣品進(jìn)行分析。這個(gè)階段是讓各實(shí)驗(yàn)室熟悉本方法，并與本研究主管進(jìn)行任何技術(shù)交流。樣品由美國腐植酸產(chǎn)品貿(mào)易協(xié)會(huì)免費(fèi)提供給各個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

第一階段涉及分析兩種樣品材料：固體礦物和液體商品材料。固體是預(yù)先均質(zhì)化過的，液體產(chǎn)品的均質(zhì)化很簡單，在試樣分取前在它的容器中振蕩即可，因此樣品的偏差性明顯降低。有足夠的試驗(yàn)材料提供給大量的分析工作。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室編碼。各實(shí)驗(yàn)室都向本研究主管報(bào)告了兩種材料的4次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，并附帶說明書和觀察報(bào)告。對前期研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，其數(shù)據(jù)為所有參與實(shí)驗(yàn)室共享。

第一階段前期研究結(jié)果的初步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果出現(xiàn)很高的偏差性。我們復(fù)查了所報(bào)告的固體樣品的水分、兩種樣品中腐植酸和疏水性黃腐酸的灰分、流出液柱體積以及用于各實(shí)驗(yàn)室的DAX-8樹脂的數(shù)量之后，對某些程序進(jìn)行了修訂。修訂版本中已標(biāo)準(zhǔn)化的有：

——固體樣品中水分的測定；

——腐植酸和疏水性黃腐酸中灰分的測定；

——疏水性黃腐酸的分光光度計(jì)吸收率的平均值；

——洗脫液的柱體積數(shù)；

——裝填進(jìn)色譜柱中的DAX-8樹脂的體積；

——Amberlite離子交換樹脂的體積；

——選擇用高溫離心管代替塑料管，以免去物料向耐高溫坩堝轉(zhuǎn)移的必需步驟。

來自各實(shí)驗(yàn)室的說明書已經(jīng)編輯完成，并已分發(fā)給各參與實(shí)驗(yàn)室。對參與者的技術(shù)建議已進(jìn)行過評審，并編入標(biāo)準(zhǔn)草案，以備進(jìn)一步完善分析規(guī)程。

2016年7月15日，國際實(shí)驗(yàn)室第二階段研究啟動(dòng)。

B.2 第二階段

包括對4個(gè)商品腐植酸產(chǎn)品的水分、灰分、腐植酸和疏水性黃腐酸含量的分析。要求參與實(shí)驗(yàn)室由同一分析操作員用同一臺(tái)儀器在不同的日期進(jìn)行4次重復(fù)分析。因?yàn)楣腆w樣品已由研究主管粉碎、篩分和均質(zhì)化，所以各參與者收到固體樣品后不需再制備。液體樣品需在分析前由操作員將樣品振蕩1 min使其均質(zhì)化。

給參與者發(fā)送了4個(gè)不同的樣品：

——與第一階段相同的固體礦物材料（QCM 1.1）；

——采自另一礦點(diǎn)的一個(gè)固體礦物材料（D2），據(jù)報(bào)告，其腐植酸含量比QCM 1.1的低；

——一個(gè)液體萃取物（L2）；

——一個(gè)液體萃取物（L3），據(jù)報(bào)告，其腐植酸和疏水性黃腐酸含量是樣品L2的2倍。

研究主管對各實(shí)驗(yàn)室上報(bào)來的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并將匯總的統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)寄給了參與實(shí)驗(yàn)室，請他們核查。

B.3 結(jié)果

由各參與實(shí)驗(yàn)室上報(bào)來的數(shù)據(jù)，首先用同樣的統(tǒng)計(jì)分析軟件程序像第一階段那樣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定其異常值?？赡艿慕坍惓Ｖ凳怯傻谝粋€(gè)四分點(diǎn)上大于-1.5×IQR的觀察值和第三個(gè)四分點(diǎn)上大于+1.5×IQR的觀察值來確定的。可能的遠(yuǎn)程異常值由這些四分點(diǎn)上大于3.0×IQR的數(shù)據(jù)來確定。通過對比可見，分析樣品的第二階段的濃度數(shù)據(jù)波動(dòng)總體上低于第一階段，這表明分析操作者對此程序更加熟悉了。下面的表1匯總了剔除異常值后的所有試驗(yàn)參數(shù)的平均值。這些數(shù)據(jù)及確定偏差的理由，已于2016年11月15日提交給設(shè)在中國臨沂的ISO第134技術(shù)委員會(huì)（ISO/TC 134）第2工作組。

隨后采用ISO 5725-2對重復(fù)性和可再現(xiàn)性進(jìn)行了計(jì)算。《測式方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測試方法重復(fù)性和可再現(xiàn)性的基本方法》已存入ISO/TC 134第2工作組的電子軟件，統(tǒng)計(jì)分析已于2017年年初用電子郵件發(fā)給了該工作組。由ISO/TC 137第2工作組產(chǎn)生的評價(jià)報(bào)告已于2017年6月11日在巴西Giraju舉行的會(huì)議上討論通過。

表2列出了實(shí)驗(yàn)室研究獲得的分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

表1 4個(gè)樣品材料的水分、灰分及無灰濃縮分析樣品組分的平均含量 %

表2 以r（重復(fù)性）和R（可再現(xiàn)性）表示的準(zhǔn)確度