腐植酸類物質(zhì)（或譯為“腐殖物質(zhì)”）存在于海洋、河流、湖泊和土壤表層等所有生態(tài)系統(tǒng)中。這些系統(tǒng)中存在的腐植酸類物質(zhì)的量化處理，對(duì)于學(xué)術(shù)研究和商業(yè)運(yùn)作，特別是對(duì)農(nóng)業(yè)土壤和作物管理來(lái)說(shuō)都是至關(guān)重要的。

農(nóng)業(yè)中腐植酸類物質(zhì)使用量的增加，促使生產(chǎn)者、消費(fèi)者和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)采用一種可靠的方法來(lái)定量腐植酸類物質(zhì)原礦和商業(yè)肥料產(chǎn)品中的活性成分，特別是對(duì)腐植酸和黃腐酸的定量產(chǎn)生了濃厚的興趣。腐植酸類產(chǎn)品的商業(yè)貿(mào)易和管理都是以腐植酸和黃腐酸在產(chǎn)品中的百分比為基礎(chǔ)的（授權(quán)使用的單位是%，而不是SI），故將其納入本標(biāo)準(zhǔn)中。

本標(biāo)準(zhǔn)文本制定了腐植酸和酸性疏水性黃腐酸的測(cè)定方法。該方法是在國(guó)際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)（IHSS）使用的從土壤樣品中萃取高純度腐植酸和疏水性黃腐酸的一種現(xiàn)行制備程序基礎(chǔ)上，由Stevenson詳細(xì)描述過(guò)的改進(jìn)型“經(jīng)典”技術(shù)。該“經(jīng)典”方法和IHSS法都是作為土壤有機(jī)質(zhì)分級(jí)制備方法研發(fā)出來(lái)的；它們并不是刻意用作定量分析方法的。從土壤腐殖質(zhì)中萃取腐植酸和黃腐酸的經(jīng)典方法，是用“強(qiáng)堿”萃取堿可溶物質(zhì)，然后將堿萃取液酸化，使腐植酸絮凝，將其從溶液中沉淀出來(lái)。用堿和酸處理后留在溶液中的物質(zhì)被稱作黃腐酸。

本方法對(duì)“經(jīng)典”技術(shù)作了如下幾方面的改進(jìn)：（1）腐植酸類物質(zhì)以“無(wú)灰”（即扣除無(wú)機(jī)鹽）為基礎(chǔ)來(lái)定量。（2）堿萃取過(guò)程在缺氧條件下進(jìn)行，以減少分析樣品的氧化。（3）將既溶于堿溶液又溶于酸溶液的物質(zhì)定義為黃腐酸級(jí)分。（4）可以對(duì)某些廠商聲稱的含腐植酸類物質(zhì)的材料中鑒別出非腐植酸類物質(zhì)。（5）進(jìn)一步將疏水性黃腐酸定義為“在pH=1情況下可與疏水樹(shù)脂結(jié)合的低硫物質(zhì)”，取代那種“黃腐酸是既溶于堿溶液又溶于酸溶液的物質(zhì)”的傳統(tǒng)的、或更通用的定義。這一更為嚴(yán)格的定義，對(duì)于將疏水性黃腐酸與無(wú)機(jī)鹽、多糖、氨基糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、酸類及碳水化合物區(qū)分開(kāi)來(lái)是非常必要的，而這些物質(zhì)在采用“傳統(tǒng)”方法時(shí)都隨著腐植酸類物質(zhì)一起被萃取出來(lái)。

有關(guān)ISO/CD 19822的國(guó)際實(shí)驗(yàn)室的研究資料見(jiàn)附件B。

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用于商品肥料、土壤調(diào)理劑及地質(zhì)沉積物的干燥物料和液體物料中腐植酸和疏水性黃腐酸的分析規(guī)程。

2 標(biāo)準(zhǔn)文件

本文本無(wú)標(biāo)準(zhǔn)文件。

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文本。

ISO（國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織）和IEC（國(guó)際電工委員會(huì)）支持下列用于標(biāo)準(zhǔn)化術(shù)語(yǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)址：

——ISO在線瀏覽平臺(tái)：https://www.iso.org/obp

——IEC電子百科：https://www.electropedia.org/

3.1 疏水性黃腐酸（hydrophobic fulvic acids）

元素硫（S）含量低于0.75%、可溶于堿溶液和酸溶液并在pH=1情況下被中等極性的高分子吸附樹(shù)脂吸附的物質(zhì)。該樹(shù)脂是專為吸附具有黃腐酸類典型分子量的兩性化合物而設(shè)計(jì)的一種吸附樹(shù)脂。

3.2 黃腐酸級(jí)分（fulvic fracition）

腐植酸類物質(zhì)的堿萃取物中既溶于堿溶液又溶于酸溶液的部分。

3.3 腐植酸（humic acids）

不溶于強(qiáng)酸、并在pH=1的酸溶液中從堿萃取物中沉淀出來(lái)的腐植酸類物質(zhì)。

3.4腐植酸類物質(zhì)（humic substances）

天然有機(jī)物質(zhì)的主要有機(jī)組分，是由植物和微生物殘?bào)w通過(guò)生物化學(xué)反應(yīng)、經(jīng)腐朽和轉(zhuǎn)化而形成的一類非均一復(fù)雜混合物組成的碳基物質(zhì)。

3.5 木質(zhì)素磺酸鹽（lignosulfonates）

由軟木材亞硫酸鹽制漿中提取出來(lái)的淺色至深褐色無(wú)定型粉末或液體。該木質(zhì)素骨架是三種芳香醇類（松柏醇、p-香豆醇和芥子醇）構(gòu)成的磺化無(wú)規(guī)聚合物，其中松柏醇是其基本單元。

4 原理

4.1 本方法規(guī)定，從原料中分離出來(lái)的腐植酸和疏水性黃腐酸的數(shù)量以無(wú)灰基表達(dá)。

4.2 提取腐植酸和疏水性黃腐酸的方法是，用強(qiáng)堿萃取堿可溶物，然后脫除不溶物，將堿溶液酸化，使腐植酸絮凝出來(lái)。

4.3 脫除腐植酸后留下的上清液被稱作黃腐酸級(jí)分。該黃腐酸級(jí)分中可能還有疏水性黃腐酸，可通過(guò)一種專用的甲基丙烯酸酯樹(shù)脂進(jìn)行選擇性吸附，將疏水性黃腐酸和非腐植酸化合物分開(kāi)，以確定黃腐酸級(jí)分中的疏水性黃腐酸數(shù)量。

5 警告

5.1 要求

以液化概率50%作為液化和非液化的判別界限，{q，lnRcs}得到的模型的訓(xùn)練和預(yù)測(cè)的混淆矩陣如表2所示，當(dāng)實(shí)際類別和預(yù)測(cè)類別一致時(shí)為正確判別，否則為錯(cuò)判。可以看到更多的非液化被錯(cuò)判為液化，這對(duì)工程實(shí)踐而言是有利的，因?yàn)閷?shí)際液化而錯(cuò)判為非液化的后果要比實(shí)際非液化而錯(cuò)判為液化的后果嚴(yán)重。訓(xùn)練和預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率分別為85.7%和87.7%，這與Juang等[13]和潘建平等[18]的結(jié)果相近。雖然準(zhǔn)確率是個(gè)非連續(xù)變量，但仍可作一定的參考。

5.1.1 良好的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范

應(yīng)該始終遵守有關(guān)人身安全保護(hù)裝置的標(biāo)準(zhǔn)（如ISO/IEC 17025）規(guī)定（在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿操作時(shí)佩戴防護(hù)眼鏡）。

5.1.2 濕度控制

腐植酸和黃腐酸是吸潮材料。在處理干物料時(shí)，防止其吸潮是至關(guān)重要的。

5.2 木質(zhì)素磺酸鹽

木質(zhì)素磺酸鹽會(huì)損壞樹(shù)脂。本分析方法不能區(qū)分木質(zhì)素磺酸鹽和疏水性黃腐酸，因此，建議事先排除未知來(lái)源液體產(chǎn)品中存在的木質(zhì)素磺酸鹽。詳見(jiàn)附錄A。

5.3 溫度的控制

在干燥腐植酸和黃腐酸分析樣品時(shí)，溫度不能超過(guò)65 ℃。在高溫下樣品會(huì)分解。

6 試劑

6.1 0.1 M NaOH溶液：稱取純度為99.99%的NaOH 3.99 g，溶于1 L去離子水中。

6.2 0.5 M NaOH溶液：稱取純度為99.99%的NaOH 19.99 g，溶于1 L去離子水中。

6.3 6 M HCl溶液：用等體積的去離子水稀釋12 M的HCl。

6.4 1 M HCl溶液：用1 L去離子水稀釋83.3 mL 12 M的HCl。

6.5 0.1 M HCl溶液：用去離子水按1∶10的比例將6.4制備的1 M HCl稀釋，最終體積達(dá)到1 L。

6.6 氮?dú)饧兌葹?9.9%（UN1066）。

6.7 甲基丙烯酸酯樹(shù)脂：40～60目，孔體積約0.9 mL/g，平均孔徑225，表面積160 mL/g，可吸附分子量高達(dá)150000 MW的物質(zhì)，例如選擇Supelite DAX-8樹(shù)脂，或滿足同等條件的任何其他樹(shù)脂。

6.8 Amberlite IR-120強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：氫型。

6.9 去離子水。

6.10 丙酮。

7 儀器

7.1 帶濕氣保護(hù)裝置的分析天平：稱量能力210 g，可讀數(shù)±0.0001 g。

7.2 干燥箱：120 ℃可控，精度±3 ℃。

7.3 離心機(jī)：最小分離因素（相對(duì)離心力）1500 xg，容許能力3900 xg。

7.4 4～50 mL或250 mL聚乙烯（或高密度聚乙烯）離心管，或可耐600 ℃高溫的重型耐溫離心管（如：Kimble Chase產(chǎn)，標(biāo)號(hào)為45212-50的KIMAX玻璃試管）。

7.5 4～100 mL寬型坩堝（如標(biāo)號(hào)為FB-965-M的Fisher Scientific產(chǎn)品）。

7.6 400 mL容量的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

7.7 磁攪拌器和5～7 cm的磁攪拌棒。

7.8 pH計(jì)與電極。

7.9 帶探測(cè)器的電導(dǎo)儀：按標(biāo)準(zhǔn)條款測(cè)定的校正單元常數(shù)約為1。

7.10 分光光度計(jì)：350 nm下的測(cè)量能力為±0.005個(gè)吸光單元。

7.11 蠕動(dòng)泵，最小流速1.2 mL/min，附帶配管。7.12 馬弗爐。

7.13 旋轉(zhuǎn)振動(dòng)混合機(jī)。

7.14 干燥器，內(nèi)裝硅膠（或等效替代物）作干燥劑。

7.15 錐形瓶，1000 mL。

7.16 燒杯，4 L。

7.17 量筒，1000 mL。、

7.18 玻璃色譜柱，4 cm×25 cm，用于DAX-8樹(shù)脂。

7. 19玻璃色譜柱，5 cm×60 cm，用于IR120 H+交換樹(shù)脂。

7.20 陶瓷研缽和杵。

7.21 篩子，74 μm（200 US目）。

7.22封口膜（Parafilm?）。

注：Parafilm?是美國(guó)威斯康星州尼納Bemis NA公司的一個(gè)商標(biāo)名。提供這一信息是為了便于本標(biāo)準(zhǔn)文本的使用，但并不構(gòu)成ISO對(duì)該命名產(chǎn)品的認(rèn)可。如果證明等價(jià)的產(chǎn)品也具有同樣的效果，就可以使用。它是一種柔軟的、有塑性的、無(wú)味的、半透明的黏性熱塑性塑料，通常用于密封或保護(hù)容器。

8 坩堝的準(zhǔn)備及樣品的干燥和稱重

8.1 坩堝的準(zhǔn)備

8.1.1 如果使用新坩堝，應(yīng)首先用丙酮洗滌，然后在105 ℃的干燥箱中烘2 h。

8.1.2 對(duì)以前用過(guò)的舊坩堝，應(yīng)先用丙酮洗滌，然后在500 ℃的馬弗爐中灼燒2 h。將坩堝放入干燥器中冷卻至室溫。從干燥器中取出坩堝，記錄其重量至小數(shù)后4位。

8.2 固體分析樣品的干燥和稱重

8.2.1 如果分析樣品是固體物質(zhì)，應(yīng)粉碎至≤75 μm，并縮分出約5 g試樣，以確保其更加均質(zhì)。

8.2.2 將5 g左右的樣品轉(zhuǎn)入按8.1程序準(zhǔn)備好的100 mL坩堝中。

8.2.3 將分析樣品放入干燥箱中，在62±3 ℃（不超過(guò)65 ℃）下烘24 h。如果在干燥過(guò)程中出現(xiàn)任何結(jié)塊，應(yīng)用玻璃棒打碎。繼續(xù)干燥，直到將樣品干燥到恒重。此過(guò)程可能要長(zhǎng)達(dá)24 h。

8.2.4 達(dá)到恒重后，將樣品從干燥箱中取出，立即放入干燥器中冷卻。

注：腐植酸和黃腐酸是吸濕性物料，在處理這類物料時(shí)，防止其吸潮是至關(guān)重要的。

8.2.5 從干燥的分析樣品中稱出約2.5 g測(cè)試樣于按8.1程序預(yù)干燥過(guò)的坩堝中，在此操作過(guò)程中，要注意防止吸潮。稱出測(cè)試樣重+坩堝重，準(zhǔn)確到小數(shù)后4位。立即執(zhí)行9.1步驟，或者將含有測(cè)試樣品的坩堝放回干燥器。

8.2.6 從“測(cè)試樣重+坩堝重”減去坩堝重，算出測(cè)試樣重，記錄結(jié)果以“測(cè)試樣干重”表示。

8.3 液體樣品的干燥和稱重

8.3.1 對(duì)于液體樣品來(lái)說(shuō)，應(yīng)將其放入可震蕩的容器中震蕩1 min，以使樣品充分均質(zhì)化。從分析樣品中稱出5 g左右測(cè)試樣（準(zhǔn)確至小數(shù)后4位），將其記錄為“液體測(cè)試樣”。

對(duì)于預(yù)計(jì)疏水性黃腐酸含量＜1%的液體分析樣品，需稱取10 g測(cè)試樣。

8.3.2 按8.2.2至8.2.6步驟對(duì)測(cè)試樣進(jìn)行干燥和稱重。

9 萃取程序

9.1 就這一步驟來(lái)說(shuō)，固體和液體樣品的處理方法是相同的。

將制備好的測(cè)試樣轉(zhuǎn)到帶有5～7 cm長(zhǎng)攪拌棒的1 L錐形瓶中。在連續(xù)攪拌下加入0.1 M NaOH，最終加到1 L。往瓶子上部空間充N2氣，再用封口膜覆蓋（或用類似的材料密封瓶口）。然后，在磁攪拌器上進(jìn)行強(qiáng)混合（即300～400 r/min）。液體樣品攪拌1 h，固體樣品攪拌16～18 h。

注：對(duì)固體樣品來(lái)說(shuō)，可在當(dāng)天稍晚些時(shí)候開(kāi)始攪拌。這樣，可以攪拌過(guò)夜。

9.1.1 攪拌后，將瓶子從攪拌器上取下，轉(zhuǎn)移到合適的離心管中，整體在3900 xg的分離因素下離心30 min，以便從堿萃取液中脫除任何不溶物。小心地將堿萃取液轉(zhuǎn)移至裝有磁攪拌棒的1 L干凈錐形瓶中，丟棄不溶物。

9.1.2 在輕輕攪拌溶液的情況下，向堿萃取液中滴加6 M（1∶1）HCl，以調(diào)節(jié)堿萃取液的pH，直到pH達(dá)到1±0.1，以便將腐植酸從酸溶液中絮凝出來(lái)。

9.1.3 用封口膜覆蓋瓶子，攪拌混均1 h。1 h后核查pH值，有必要時(shí)，再用6 M HCl將pH調(diào)到1±0.05。如果pH低于0.95，則用0.5 M NaOH溶液調(diào)回到pH=1±0.05。連續(xù)混勻酸化的萃取液，直到在5 min時(shí)觀察其pH穩(wěn)定在1±0.05為止。pH穩(wěn)定后，不應(yīng)使酸化了的萃取液放置超過(guò)5 min。取下pH電極。

9.2 腐植酸的分離

9.2.1 pH一旦穩(wěn)定后，將瓶子從混合機(jī)上取下，用封口膜覆蓋瓶口。將調(diào)節(jié)好pH的萃取液靜置4 h±5 min（不超過(guò)4 h）。這個(gè)階段對(duì)阻止腐植酸與疏水性黃腐酸的繼續(xù)分離是很關(guān)鍵的。被絮凝的腐植酸會(huì)從溶液中脫離出來(lái)。

9.2.2 立即用已稱重的50 mL離心管在3900 xg下離心30 min，以回收絮凝出來(lái)的腐植酸。輕輕地潷出上清液（黃腐酸級(jí)分），小心不要讓任何絮凝出的腐植酸攜帶出來(lái)。一般情況下，可傾倒出大約500 mL不夾帶絮凝腐植酸的清澈萃取液。如果進(jìn)行疏水性黃腐酸分析的話，應(yīng)將其傾倒于1 L錐形瓶中（或者：采用重型高溫離心杯代替塑料離心杯，即取消將絮凝腐植酸向坩堝轉(zhuǎn)移的必需步驟，以減少勞動(dòng)量，提高精確度）。

9.2.3 將盛有絮凝腐植酸的離心管再于1500 xg下離心20～30 min，以進(jìn)一步將殘余的腐植酸沉淀從液體黃腐酸級(jí)分中分離出來(lái)。如果還準(zhǔn)備分析疏水性黃腐酸，需將此上清液也慢慢倒入9.2.2得到的黃腐酸級(jí)分清液中。

9.2.4 如果使用高溫離心管，需將盛有絮凝腐植酸的離心管放入62±3 ℃的干燥箱中。如果使用塑料或低溫離心管，需仔細(xì)地將杯中的絮凝腐植酸全部刮入按8.1準(zhǔn)備好的100 mL寬型坩堝中。刮出絮凝腐植酸后，往離心杯中注入少量去離子水，擰緊管蓋，使勁搖動(dòng)帶蓋的離心管，將去離子水/絮凝腐植酸混合物全部轉(zhuǎn)入坩堝中。無(wú)論是用重型離心管還是用坩堝，都需在62±3 ℃的干燥箱中將絮凝腐植酸干燥到恒重（一般需過(guò)夜）。用玻璃棒打碎干燥時(shí)形成的任何結(jié)塊，要注意避免任何物料從管中掉出去。干燥過(guò)程可能延長(zhǎng)到24 h，這取決于腐植酸的來(lái)源。

注：高溫離心管可放置在幾個(gè)50 mL燒杯中，再放入干燥箱。

9.2.5 絮凝腐植酸一旦干燥到恒重，從干燥箱中取出管子/坩堝，立即放入干燥器中冷卻。冷卻到室溫后，再對(duì)盛有絮凝腐植酸的管子/坩堝稱重。此操作過(guò)程要注意減少吸潮。記錄干燥的絮凝腐植酸+管子/坩堝的總重量，扣除管子/坩堝的重量，得到干燥的絮凝腐植酸的重量。

10 灰分的測(cè)定

10.1 在這一階段，干燥的絮凝腐植酸會(huì)殘留一定量的灰分。無(wú)論是重型離心管中，還是坩堝（按8.1制備的）中，干燥絮凝腐植酸的灰分的測(cè)定都是在500 ℃的馬弗爐中灼燒4 h，直到恒重。如果在灰化時(shí)形成任何固體團(tuán)塊，應(yīng)小心地用玻璃棒擊碎。不能使用金屬棒。

10.2 當(dāng)達(dá)到恒重后，將盛有絮凝腐植酸灰的管子/坩堝從馬弗爐中取出，放入干燥器中冷卻到室溫。

10.3 冷卻后，稱出管子/坩堝+灰的總重量減去管子/坩堝的重量，得到灰的重量，記錄為“絮凝腐植酸灰重”。

11 疏水性黃腐酸的分離

11.1 疏水性黃腐酸是用酸性疏水樹(shù)脂（即Supelite XAD-8）從黃腐酸級(jí)分中選擇性吸附的另一類酸性可溶物，親水性的酸性可溶物則不與樹(shù)脂結(jié)合而被排除在外。成熟的技術(shù)是，將該樹(shù)脂事先在防空氣袋中用去離子水浸潤(rùn)，往4 cm×25 cm的玻璃色譜柱中部分填充280 mL樹(shù)脂，由濕樹(shù)脂頂部到柱子頂部應(yīng)保留大約2.5 cm的空間（圖1）。留有充足空間的目的是便于監(jiān)控通過(guò)柱子的液體流速。如果使用新樹(shù)脂，應(yīng)事先采用14.1的方法凈化。色譜柱中的樹(shù)脂使用后，需按14.1.3的方法再生。當(dāng)天使用完的樹(shù)脂，應(yīng)在甲醇中保存。再次使用前，應(yīng)在大燒杯中通過(guò)懸浮法用去離子水沖洗樹(shù)脂，直到將甲醇全部脫除（可溶有機(jī)碳低于2 mg/L）。如果樹(shù)脂變色，或使用了15次左右，應(yīng)該采用監(jiān)控材料進(jìn)行一次質(zhì)量控制試驗(yàn)。必要時(shí)，可用14.1的方法清洗樹(shù)脂，或者將其丟棄，換用新樹(shù)脂。

11.2 黃腐酸級(jí)分溶液被一個(gè)蠕動(dòng)泵送到柱子頂部并穿過(guò)整個(gè)柱子，該泵設(shè)置了一定的壓力，以保證足夠的流速將液體覆蓋住柱子中的樹(shù)脂，使其既不溢出柱子又不使樹(shù)脂暴露在空氣中。建議流速為4～5 mL/min。不可使溶液的水平面低于樹(shù)脂的頂部。將流出廢液丟棄。

11.3 隨后，通過(guò)蠕動(dòng)泵在足夠的壓力下用去離子水沖洗柱子，此流速（4～5 mL/min）足以保證覆蓋樹(shù)脂。連續(xù)洗滌直到流出液的紫外光吸收率A=0.015（350 nm），或流出液達(dá)柱體積的2倍（不超過(guò)2倍）為止。以上兩點(diǎn)，以先發(fā)生者為準(zhǔn)。丟棄廢液。

11.4 然后，通過(guò)蠕動(dòng)泵用0.1 M NaOH將疏水性黃腐酸從樹(shù)脂中反洗脫（即洗脫液從柱子底部導(dǎo)入）出來(lái)（流速4～5 mL/min），收集含疏水性黃腐酸的流出液。用分光光度計(jì)檢測(cè)其流出液的吸光率A=0.03（350 nm），或流出液達(dá)柱體積的3倍（不超過(guò)3倍）為止。以上兩點(diǎn)，以先發(fā)生者為準(zhǔn)。

圖1 從黃腐酸級(jí)分中分離疏水性黃腐酸的裝置示例

12 氫離子交換

12.1 按14.2的方法制備氫型（H+）離子交換樹(shù)脂。按14.2.1的方法往5 cm×50 cm色譜柱中注入500 mL制備好的H+交換樹(shù)脂。將含疏水性黃腐酸的溶液泵到柱子頂部，僅靠溶液重力使其穿過(guò)柱子。重復(fù)該步驟，總共兩次通過(guò)柱子。這一步驟的目的是用H+置換疏水性黃腐酸上的Na+，使疏水性黃腐酸質(zhì)子化。

12.2 用500 mL去離子水洗滌柱子。將流出的洗滌水添加到12.1的質(zhì)子化疏水性黃腐酸溶液中。

12.3 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在65 ℃下（不超過(guò)65 ℃）將疏水性黃腐酸濃縮到50～60 mL。

12.4 用8.1準(zhǔn)備好的坩堝干燥疏水性黃腐酸濃縮液，記錄坩堝的重量。將蒸發(fā)剩余的疏水性黃腐酸濃縮液轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的坩堝中。在干燥箱中62±3 ℃（不超過(guò)65 ℃）下將疏水性黃腐酸濃縮液干燥到恒重，并破碎所形成的任何團(tuán)塊。

12.5 恒重后，將盛有疏水性黃腐酸濃縮物的坩堝放入干燥器，使其冷卻到室溫。記錄坩堝+疏水性黃腐酸濃縮物總重量。減去坩堝重量，即得干燥疏水性黃腐酸的重量。

12.6 測(cè)定疏水性黃腐酸中殘留的灰分?；曳譁y(cè)定程序與10腐植酸灰分的測(cè)定相同，采用準(zhǔn)備好的坩堝或重型離心管均可。

12.7 通過(guò)13.2～13.4的方法計(jì)算疏水性黃腐酸的百分含量（%）。

13 計(jì)算

13.1 無(wú)灰腐植酸重量的確定

灰分%=（絮凝腐植酸的灰重÷干燥后絮凝腐植酸重）×100

無(wú)灰腐植酸重量=干燥后絮凝腐植酸重×（1-灰分%）

13.2 無(wú)灰疏水性黃腐酸重量的確定

灰分%=（疏水性黃腐酸的灰重÷干燥后疏水性黃腐酸重）×100

無(wú)灰疏水性黃腐酸重量=干燥后疏水性黃腐酸重×（1-灰分%）

13.3 固體分析樣品%的確定

固體分析樣品%=（無(wú)灰分析樣品重÷干燥的試樣重）×100

13.4 液體分析樣品%的確定

液體分析樣品%=（無(wú)灰分析樣品重÷液體試樣重）×100

14 樹(shù)脂的再生及柱子的制備

14.1 概述

14.1.1 色譜樹(shù)脂的制備

無(wú)論用新樹(shù)脂還是用變了色的舊樹(shù)脂，其制備程序都是很重要的。要用甲醇、乙醚、乙腈和甲醇依次連續(xù)進(jìn)行索氏萃取8 h（分別2 h）。如果制備后的樹(shù)脂不立即使用，應(yīng)浸泡在甲醇中保存。

14.1.2 色譜柱的制備

在裝填柱子之前，應(yīng)該在大燒杯中通過(guò)懸浮法用去離子水沖洗樹(shù)脂上的甲醇，直到去掉甲醇為止（可溶有機(jī)碳不超過(guò)2 mg/L）。往柱子中裝填280 mL樹(shù)脂后，先用0.1 N NaOH、再用0.1 N HCl交替沖洗3次，以脫除樹(shù)脂中可能包含的其他雜質(zhì)。

14.1.3 色譜樹(shù)脂的再生

再生是在裝有280 mL樹(shù)脂的4 cm×25 cm的色譜柱上進(jìn)行的，用蠕動(dòng)泵將其2倍柱體積的去離子水泵到柱子頂部，使水僅靠重力流下來(lái)。然后通入1倍柱體積的0.1 M HCl，使其穿過(guò)柱子底部。

14.2 氫型（H+）交換樹(shù)脂的再生

14.2.1 H+交換樹(shù)脂的再生是按批量過(guò)程進(jìn)行的，在一個(gè)4 L的燒杯中，一次至少放入500 mL樹(shù)脂，倒出樹(shù)脂中存在的任何液體，用1 M HCl覆蓋，至少放置30 min，每隔5 min攪拌1次。用傾瀉法將多余的HCl倒出，用去離子水覆蓋樹(shù)脂。用攪拌棒使勁攪拌15 s，然后靜置5 min。倒出水，再用去離子水覆蓋，使勁攪拌。

14.2.2 在5 cm×50 cm的柱子中裝填500 mL再生過(guò)的H+交換樹(shù)脂。裝填完畢后，用去離子水洗滌，直到用AgNO3檢測(cè)流出水中無(wú)Cl-為止。

附錄A（實(shí)用性資料）確認(rèn)存在木質(zhì)素磺酸鹽的程序

A.1 概述

按經(jīng)典定義，從腐殖化的物料中萃取出來(lái)的可溶于酸和堿的物質(zhì)是黃腐酸。但本文將可溶于酸和堿的物質(zhì)定義為“黃腐酸級(jí)分”，因?yàn)樵S多物質(zhì)都適用于廣義的操作性定義。該黃腐酸級(jí)分可能會(huì)、也可能不會(huì)含有我們感興趣的分析物質(zhì)——疏水黃腐酸。由于市場(chǎng)上將某些物質(zhì)，特別是木質(zhì)素磺酸鹽也稱作黃腐酸，因此有必要事先鑒別木質(zhì)素磺酸鹽存在的可能性。

警告——用于本文的疏水性吸附樹(shù)脂與木質(zhì)素磺酸鹽是不兼容的。木質(zhì)素磺酸鹽不能定量地從樹(shù)脂中解吸，并可能永久性損壞樹(shù)脂。

A.1.1 腐植酸類物質(zhì)是無(wú)味的，或有輕微的石油類氣味。木質(zhì)素磺酸鹽具有亞硫酸鹽特有的味道，因?yàn)樗鼈兪怯脕喠蛩猁}處理過(guò)的木材木質(zhì)素衍生物。由于感官檢查是不能確定的，故木素磺酸鹽的預(yù)篩查首先是通過(guò)分析元素硫（S）來(lái)完成。

A.2 硫的濃度

木質(zhì)素磺酸鹽中的總硫濃度通?！?%。腐植酸類物質(zhì)中的硫一般＜1%，平均0.6%。用傅立葉變換紅外光譜（FTIR）可以檢測(cè)到總元素硫（S）超過(guò)0.75%的任何產(chǎn)品，用以確定是否存在木質(zhì)素磺酸鹽。

A.3 FTIR分析

FTIR基于化學(xué)鍵彎曲或伸展引起的紅外光吸收變化的原理。Mid-FTIR可記錄波數(shù)在4000 cm-1到400 cm-1之間釋放的能量。可觀察到的物質(zhì)的紅外光譜吸收峰與其組成物質(zhì)原子間鍵合的振動(dòng)頻率相對(duì)應(yīng)。由于沒(méi)有兩種化合物會(huì)準(zhǔn)確產(chǎn)生同樣的紅外光譜，故FTIR分析一般用于確定的物質(zhì)。許多商業(yè)實(shí)驗(yàn)室都提供FTIR分析并給出解釋報(bào)告。

A.3.1 磺酸鹽鍵的光譜

木質(zhì)素磺酸鹽中硫-氧鍵，是由如下特征吸收峰確定的：1030～1041 cm-1處為亞砜單一S=O鍵對(duì)稱振動(dòng)，1150～1200 cm-1為O=S=O對(duì)稱振動(dòng)，1330～1430 cm-1附近的峰為磺酸鹽O=S=O的不對(duì)稱振動(dòng)。在木質(zhì)素磺酸鹽濃度低于500 mg/kg的復(fù)雜混合物中，Mid-FTIR很難將其檢測(cè)出來(lái)。但是，木質(zhì)素磺酸鹽缺乏1700～1730 cm-1處出現(xiàn)的脂肪族羧酸C=O伸展振動(dòng)的尖峰，而1680～1710 cm-1處則顯示出芳香族羧酸C=O特有的伸展振動(dòng)弱峰。因此，缺乏這些吸收峰就可以排除疏水性黃腐酸的存在，而不能確定是否存在木質(zhì)素磺酸鹽。見(jiàn)圖1。

圖1 商品木質(zhì)素磺酸鹽的代表性光譜

A.3.2 黃腐酸的光譜

腐植酸和黃腐酸顯示出相似的光譜帶，都在1620 cm-1和1720 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)雙峰。在1600～1710 cm-1范圍的波數(shù)對(duì)應(yīng)于芳香族C=O的伸縮振動(dòng)，而1700～1730 cm-1是脂肪族C=O的伸縮振動(dòng)。對(duì)于1720 cm-1處的峰來(lái)說(shuō)，黃腐酸比腐植酸更強(qiáng)，因?yàn)榍罢叩聂然–OOH）較多。在木質(zhì)素磺酸鹽中，這些吸收帶都很弱或者沒(méi)有。典型的情況是，在1220 cm-1和1400 cm-1附近有兩個(gè)較弱的、但明顯的峰，它們分別是羧酸的C-O伸縮（1210～1320 cm-1）和O-H平面彎曲（1395～1440 cm-1）振動(dòng)吸收。見(jiàn)圖2和圖3。

A.3.3 光譜分析參數(shù)

樣品介質(zhì)：水

光譜波數(shù)范圍：Mid-IR（4500～600 cm-1）

孔障：Happ-Genzel

分辨率：4 cm-1

掃描數(shù)：16～64

溫度：296 K

圖2 國(guó)際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)薩旺尼河黃腐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品2S103F的光譜

圖3 國(guó)際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)薩旺尼河黃腐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品2S103F的Mid-FTIR光譜600～ 1900 cm-1細(xì)節(jié)

附錄B（實(shí)用性資料）ISO/CD 19822國(guó)際實(shí)驗(yàn)室研究

ISO/CD 19822國(guó)際實(shí)驗(yàn)室研究的目的是根據(jù)ISO 5725-2：1994《測(cè)試方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度） 第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法重復(fù)性和可再現(xiàn)性的基本方法》中的精確度對(duì)來(lái)自11個(gè)參與的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?！熬_度”指的是各參與實(shí)驗(yàn)室采用同樣的方法對(duì)同樣的物料所測(cè)定結(jié)果之間的一致性，其產(chǎn)生的偏差可能來(lái)源于試驗(yàn)條件的差異。

2016年2月，我們向各個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)出邀請(qǐng)函，請(qǐng)他們參與ISO國(guó)際實(shí)驗(yàn)室研究，即對(duì)商業(yè)產(chǎn)品中的腐植酸和疏水性黃腐酸進(jìn)行分析。6個(gè)國(guó)家的12個(gè)實(shí)驗(yàn)室同意參加該研究，并表示遵守如下準(zhǔn)則：

（1）在開(kāi)始研究時(shí)，所有必需的儀器、化學(xué)品及方法中指定的其他必需品，都可以在他們的實(shí)驗(yàn)室找到。

（2）對(duì)規(guī)定的“時(shí)間”要求，如項(xiàng)目的開(kāi)始日期、完成日期，應(yīng)該嚴(yán)格執(zhí)行。

（3）分析規(guī)程應(yīng)嚴(yán)格遵守，不能修改。

（4）有資質(zhì)的操作人員才能進(jìn)行分析工作。

（5）各項(xiàng)分析都應(yīng)該在重復(fù)條件下進(jìn)行，即在不同的日期，由同一個(gè)操作員用同一臺(tái)儀器進(jìn)行分析。

（6）要求參與者提供的報(bào)告必須是4次重復(fù)分析的結(jié)果，無(wú)論出現(xiàn)任何矛盾數(shù)據(jù)，都不能丟棄或者修改。

國(guó)際實(shí)驗(yàn)室于2016年6月開(kāi)始第一階段的前期研究。

B.1 第一階段

包括采用ISO/CD 19822程序?qū)η捌谘芯康膶?shí)習(xí)樣品進(jìn)行分析。這個(gè)階段是讓各實(shí)驗(yàn)室熟悉本方法，并與本研究主管進(jìn)行任何技術(shù)交流。樣品由美國(guó)腐植酸產(chǎn)品貿(mào)易協(xié)會(huì)免費(fèi)提供給各個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

第一階段涉及分析兩種樣品材料：固體礦物和液體商品材料。固體是預(yù)先均質(zhì)化過(guò)的，液體產(chǎn)品的均質(zhì)化很簡(jiǎn)單，在試樣分取前在它的容器中振蕩即可，因此樣品的偏差性明顯降低。有足夠的試驗(yàn)材料提供給大量的分析工作。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室編碼。各實(shí)驗(yàn)室都向本研究主管報(bào)告了兩種材料的4次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，并附帶說(shuō)明書和觀察報(bào)告。對(duì)前期研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，其數(shù)據(jù)為所有參與實(shí)驗(yàn)室共享。

第一階段前期研究結(jié)果的初步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果出現(xiàn)很高的偏差性。我們復(fù)查了所報(bào)告的固體樣品的水分、兩種樣品中腐植酸和疏水性黃腐酸的灰分、流出液柱體積以及用于各實(shí)驗(yàn)室的DAX-8樹(shù)脂的數(shù)量之后，對(duì)某些程序進(jìn)行了修訂。修訂版本中已標(biāo)準(zhǔn)化的有：

——固體樣品中水分的測(cè)定；

——腐植酸和疏水性黃腐酸中灰分的測(cè)定；

——疏水性黃腐酸的分光光度計(jì)吸收率的平均值；

——洗脫液的柱體積數(shù)；

——裝填進(jìn)色譜柱中的DAX-8樹(shù)脂的體積；

——Amberlite離子交換樹(shù)脂的體積；

——選擇用高溫離心管代替塑料管，以免去物料向耐高溫坩堝轉(zhuǎn)移的必需步驟。

來(lái)自各實(shí)驗(yàn)室的說(shuō)明書已經(jīng)編輯完成，并已分發(fā)給各參與實(shí)驗(yàn)室。對(duì)參與者的技術(shù)建議已進(jìn)行過(guò)評(píng)審，并編入標(biāo)準(zhǔn)草案，以備進(jìn)一步完善分析規(guī)程。

2016年7月15日，國(guó)際實(shí)驗(yàn)室第二階段研究啟動(dòng)。

B.2 第二階段

包括對(duì)4個(gè)商品腐植酸產(chǎn)品的水分、灰分、腐植酸和疏水性黃腐酸含量的分析。要求參與實(shí)驗(yàn)室由同一分析操作員用同一臺(tái)儀器在不同的日期進(jìn)行4次重復(fù)分析。因?yàn)楣腆w樣品已由研究主管粉碎、篩分和均質(zhì)化，所以各參與者收到固體樣品后不需再制備。液體樣品需在分析前由操作員將樣品振蕩1 min使其均質(zhì)化。

給參與者發(fā)送了4個(gè)不同的樣品：

——與第一階段相同的固體礦物材料（QCM 1.1）；

——采自另一礦點(diǎn)的一個(gè)固體礦物材料（D2），據(jù)報(bào)告，其腐植酸含量比QCM 1.1的低；

——一個(gè)液體萃取物（L2）；

——一個(gè)液體萃取物（L3），據(jù)報(bào)告，其腐植酸和疏水性黃腐酸含量是樣品L2的2倍。

研究主管對(duì)各實(shí)驗(yàn)室上報(bào)來(lái)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并將匯總的統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)寄給了參與實(shí)驗(yàn)室，請(qǐng)他們核查。

B.3 結(jié)果

由各參與實(shí)驗(yàn)室上報(bào)來(lái)的數(shù)據(jù)，首先用同樣的統(tǒng)計(jì)分析軟件程序像第一階段那樣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定其異常值。可能的近程異常值是由第一個(gè)四分點(diǎn)上大于-1.5×IQR的觀察值和第三個(gè)四分點(diǎn)上大于+1.5×IQR的觀察值來(lái)確定的?？赡艿倪h(yuǎn)程異常值由這些四分點(diǎn)上大于3.0×IQR的數(shù)據(jù)來(lái)確定。通過(guò)對(duì)比可見(jiàn)，分析樣品的第二階段的濃度數(shù)據(jù)波動(dòng)總體上低于第一階段，這表明分析操作者對(duì)此程序更加熟悉了。下面的表1匯總了剔除異常值后的所有試驗(yàn)參數(shù)的平均值。這些數(shù)據(jù)及確定偏差的理由，已于2016年11月15日提交給設(shè)在中國(guó)臨沂的ISO第134技術(shù)委員會(huì)（ISO/TC 134）第2工作組。

隨后采用ISO 5725-2對(duì)重復(fù)性和可再現(xiàn)性進(jìn)行了計(jì)算?！稖y(cè)式方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法重復(fù)性和可再現(xiàn)性的基本方法》已存入ISO/TC 134第2工作組的電子軟件，統(tǒng)計(jì)分析已于2017年年初用電子郵件發(fā)給了該工作組。由ISO/TC 137第2工作組產(chǎn)生的評(píng)價(jià)報(bào)告已于2017年6月11日在巴西Giraju舉行的會(huì)議上討論通過(guò)。

表2列出了實(shí)驗(yàn)室研究獲得的分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

表1 4個(gè)樣品材料的水分、灰分及無(wú)灰濃縮分析樣品組分的平均含量 %

表2 以r（重復(fù)性）和R（可再現(xiàn)性）表示的準(zhǔn)確度