萬(wàn)屾騰 白 瑜 李 林，2，3 蔡志鋒，2，3 侯玲杰，2，3 張彩鳳，2，3

1 太原師范學(xué)院化學(xué)系 晉中 030619

2 山西省腐植酸工程技術(shù)研究中心 晉中 030619

3 山西省有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)肥料工程研究中心 晉中 030619

腐植酸（HA）可用作廣譜植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)植物抗逆性、提高植物產(chǎn)量和改善植物品質(zhì)等。此外，HA還具有吸附、絡(luò)（螯）合、離子交換、膠體等理化性質(zhì)，可以使土壤疏松，改善土壤理化性質(zhì)，修復(fù)重金屬污染土壤等作用，如砷（As）。Mukhopadhyay等[1]研究表明，HA與As（V）的結(jié)合物相當(dāng)穩(wěn)定。Cormu等[2]研究認(rèn)為，在pH大于5時(shí)，含HA的高嶺土吸附As（V）的量大于不含HA的高嶺土。Grafe等[3]研究認(rèn)為，在酸性條件下，HA能降低針鐵礦對(duì)As（III）的吸附。這些研究結(jié)果為減輕土壤活性As（III）和As（V）的含量，降低As（III）和As（V）對(duì)作物的生物有效性提供了理論依據(jù)。同時(shí)，HA類(lèi)物質(zhì)均能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，提高其抗逆性和適應(yīng)性，改善植物產(chǎn)品品質(zhì)，增產(chǎn)效果顯著[4]。郭云征等[5]報(bào)道一種農(nóng)牧產(chǎn)品有害物質(zhì)消除劑及其應(yīng)用，用于消除動(dòng)植物體內(nèi)有害物質(zhì)超標(biāo)的問(wèn)題，該消除劑主要成分為HA。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于土壤As（III）和As（V）污染對(duì)植物影響的研究一直是熱點(diǎn)。HA能夠增加植物的葉綠素含量和強(qiáng)化其光合作用能力，也可以和土壤中重金屬離子形成絡(luò)合物，從而抑制重金屬進(jìn)入植物，進(jìn)而增加農(nóng)作物產(chǎn)量。本文通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)搜集，總結(jié)As對(duì)植物的影響、HA在減輕As對(duì)植物毒害方面的作用機(jī)理，以期為相關(guān)研究領(lǐng)域提供參考。

1 As（III）和As（V）對(duì)植物的影響

不同形態(tài)的As毒性不同，依毒性大小依次為As（III）＞As（V）＞二甲基砷＞單質(zhì)As[6，7]。單質(zhì)As因其難溶解能力而顯現(xiàn)出非常低的生理毒性，無(wú)機(jī)As因其移動(dòng)性特別強(qiáng)而顯現(xiàn)出非常強(qiáng)的生理毒性，其中，As（III）的生理毒性最為強(qiáng)烈，依次約為As（V）和二甲基砷的60和70倍[8]。楊桂娣等[9]的研究表明，As（III）對(duì)水稻種子的生理毒性要明顯強(qiáng)于As（V）。

1.1 微量As（III）和As（V）對(duì)植物的促進(jìn)作用

As并非植物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，但一些研究表明，微量的As（III）、As（V）能有助于植物的生長(zhǎng)發(fā)育[10～12]。安堃達(dá)等[13]試驗(yàn)表明，土壤As（V）濃度在50 mg/kg的情況下有助于西紅柿植株的生長(zhǎng)，其生物量和產(chǎn)量分別為對(duì)照組的1.56倍和1.51倍。郭再華等[14]試驗(yàn)證明，土壤中微量As（V）有助于水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)磷元素的吸收。趙天宏等[15]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境中低濃度As（III）存在時(shí)，水稻本能表現(xiàn)出自我保護(hù)作用。

1.2 過(guò)量As（III）和As（V）對(duì)植物的毒害作用

As（III）和As（V）對(duì)植物的毒效應(yīng)可能是通過(guò)影響植物的水分運(yùn)輸和養(yǎng)分吸收，破壞了植物細(xì)胞內(nèi)部的葉綠素，影響其生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，植物產(chǎn)品質(zhì)量變差。楊桂娣等[9]的研究表明，As（III）和As（V）都可以顯著地抑制水稻種子的發(fā)芽比例、根系長(zhǎng)短和含水比例等關(guān)鍵性指標(biāo)。常思敏等[16]研究表明，土壤As（V）抑制烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育，降低烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)，從而降低烤煙的經(jīng)濟(jì)性和商業(yè)價(jià)值。劉全吉等[17]研究表明，土壤As（V）含量為200 mg/kg對(duì)冬小麥生長(zhǎng)發(fā)育有顯著的抑制作用，使植株高度、地上部分生物量、根系生物量及產(chǎn)量較對(duì)照組分別減少17.0%、52.2%、60.6%和46.8%。在水培條件下，As（V）對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育也存在較強(qiáng)的毒性，這是因?yàn)锳s（V）抑制小麥的根系生長(zhǎng)和磷元素吸收，從而減弱根系活力和降低生物量[18]。

1.3 As（III）和As（V）對(duì)植物毒害的機(jī)理

研究表明，As易與胞內(nèi)巰基生物分子結(jié)合[19]，例如As（III）能夠和巰基進(jìn)行配位，其比例約為1∶3，該絡(luò)合物有相對(duì)較大的穩(wěn)定系數(shù)，不易被破壞[20]。As（III）與巰基配位形成絡(luò)合物后會(huì)降低多種生物酶活性，如谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽氧化酵素、硫氧還蛋白還原酶及硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶，進(jìn)而導(dǎo)致一系列毒性效應(yīng)[21]。As（III）和As（V）大多是經(jīng)較大孔徑的通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，植物生長(zhǎng)土壤環(huán)境中如有較高含量的As（III）和As（V），會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生較強(qiáng)副作用[22]。無(wú)機(jī)As（III）和As（V）在進(jìn)入細(xì)胞后通過(guò)影響代謝過(guò)程對(duì)植物造成傷害：（1）氧化損傷，釋放較多的活性氧中間體，迫使細(xì)胞里面進(jìn)行過(guò)氧化反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)、脂類(lèi)以及核酸等胞內(nèi)物質(zhì)，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化效應(yīng)，脂質(zhì)膜的過(guò)氧化將會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終引發(fā)細(xì)胞凋零[23]；（2）抑制二磷酸核酮糖羧化酶、葉綠素的生物合成、光合色素合成以及光合作用；（3）通過(guò)解偶聯(lián)磷酸化抑制ATP合成[23]。

2 HA在減輕As（III）和As（V）對(duì)植物毒害方面的作用機(jī)理

2.1 HA通過(guò)影響氮代謝減輕As（V）對(duì)植物的毒害

氨基酸是合成蛋白質(zhì)的主要原料，也是蛋白質(zhì)降解的主要產(chǎn)物，是反映氮代謝的主要指標(biāo)。谷氨酰胺合成酶（GS）等酶類(lèi)把植物體內(nèi)的NH4+-N循環(huán)同化為谷氨酰胺和谷氨酸后，由谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）等轉(zhuǎn)氨酶類(lèi)轉(zhuǎn)化為其他氨基酸。天冬酰胺酶（ASG）催化天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨，其活性變化一方面反映氮代謝狀況，另一方面生成氨多少與植物在逆境條件下遭受氨中毒的程度呈正比。精氨酸是抗氧化性氨基酸，具有良好的清除自由基能力[24]，是生成多胺、一氧化氮和谷氨酸等的前體物質(zhì)，而多胺、一氧化氮是植物體內(nèi)重要的信使分子，參與生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆等幾乎所有的生理生化過(guò)程[25]。

常思敏等[26]在研究As（V）污染土壤中加入HA的小分子組分——黃腐酸（FA），觀察烤煙氮代謝及其過(guò)程，結(jié)果顯示，F(xiàn)A可改善烤煙全生育期硝酸還原酶（NR）活性，減弱GS的活性。由此得出As（V）污染土壤中加入FA可改善烤煙NO3--N的同化能力，降低其N(xiāo)H4+-N的同化能力，從而減輕土壤As（V）對(duì)烤煙氮同化的毒害；通過(guò)考察As（V）污染土壤中施用FA對(duì)烤煙氮轉(zhuǎn)化代謝影響表明，除團(tuán)棵期FA處理稍微刺激As（V）毒害烤煙的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性外，F(xiàn)A降低了現(xiàn)蕾以后的GPT活性、全生育期的ASG活性和游離氨基酸的積累，從而減輕了As（V）對(duì)烤煙的毒害。根據(jù)Newton等[27]對(duì)HA使As（V）污染土壤種植烤煙氮轉(zhuǎn)化代謝旺盛的研究結(jié)果推斷，As（V）污染土壤中施用HA可抑制烤煙因As（V）毒害產(chǎn)生的氮轉(zhuǎn)化衰弱問(wèn)題，減輕了As（V）對(duì)烤煙氮轉(zhuǎn)化方面的毒害。王琦等[28]通過(guò)研究HA調(diào)節(jié)砷酸鹽生菜毒性作用表明，應(yīng)對(duì)As（V）脅迫的主要差異表達(dá)氨基酸類(lèi)型為谷氨酸和精氨酸，HA可以上調(diào)二者的表達(dá)水平，從而緩解高濃度的As（V）對(duì)生菜的毒性作用。

2.2 HA通過(guò)介導(dǎo)作用減輕As（III）和As（V）對(duì)植物的毒害

介導(dǎo)作用，也稱(chēng)為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，是一種細(xì)胞通過(guò)質(zhì)膜向內(nèi)萌芽（內(nèi)陷）吸收代謝產(chǎn)物、激素、蛋白質(zhì)和某些病菌的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程形成含有被吸收物質(zhì)的囊泡，并嚴(yán)格由細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)。只有受體特異性物質(zhì)才能通過(guò)這個(gè)過(guò)程進(jìn)入細(xì)胞。研究HA介導(dǎo)作用不僅利于我們科學(xué)評(píng)估天然有機(jī)質(zhì)的生態(tài)調(diào)控作用，同時(shí)利于我們明晰水環(huán)境中污染物的物化歸趨。

（1）HA-As（III）-硅藻共存體系的微觀界面調(diào)節(jié)機(jī)制。

圖 1 HA-As(III)- 硅藻共存體界面作用示意圖Fig.1 Schematic diagram of interface action on coexistence system of humic acid, As(Ⅲ) and diatom

研究報(bào)道該調(diào)節(jié)機(jī)制如圖1[29]所示，HA吸附在植物胞壁外表面構(gòu)筑一層特殊的保護(hù)膜。HA會(huì)對(duì)細(xì)胞膜的電化學(xué)特征和離子傳輸通道產(chǎn)生一定程度的影響，繼而改變細(xì)胞對(duì)重金屬的吸收效果。倪燕燕[29]探究了硅藻細(xì)胞吸附態(tài)HA造成的表面特征的原因。其研究結(jié)果表明，HA在硅藻細(xì)胞外的吸附作用異常強(qiáng)烈，當(dāng)HA含量在20 mg/L以下時(shí)，該吸附效果匹配線(xiàn)性吸附模型，亨利常數(shù)KH約為2.35±0.55×10-8L cell-1。當(dāng)HA含量在60 mg/L以上時(shí)，吸附效果則會(huì)達(dá)到極限狀態(tài)。硅藻胞壁的掃描電鏡圖顯示吸附態(tài)HA能夠遮蔽細(xì)胞壁的微孔結(jié)構(gòu)，并構(gòu)筑胞壁外絮狀層進(jìn)而減弱細(xì)胞膜的滲透性能。另外，紅外光譜分析顯示-COOH是HA與As（III）在硅藻胞壁外層吸附的共同作用基團(tuán)，吸附態(tài)HA占用了As（III）的部分活性吸附位點(diǎn)。由于以上各方面作用的共同存在，HA能夠減少As（III）在硅藻胞壁外的吸附。

（2）不同濃度梯度HA的介導(dǎo)作用存在差異。倪燕燕[29]探究了不同HA濃度梯度介導(dǎo)作用下As（III）對(duì)硅藻細(xì)胞生理毒性的差異性，如果HA含量在20 mg/L以下，As（III）對(duì)硅藻細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有一定程度的促進(jìn)，如果HA含量在40 mg/L以上，As（III）將對(duì)硅藻的生長(zhǎng)發(fā)育表現(xiàn)出顯著的阻礙現(xiàn)象。含量在20 mg/L的時(shí)候，HA對(duì)As（III）的生理毒性影響效率處于最佳狀態(tài)。HA介導(dǎo)作用存在差異的機(jī)制源自于調(diào)節(jié)了硅藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧比例，10 mg/L和20 mg/L的HA介導(dǎo)作用下，經(jīng)As（III）處理的舟形藻細(xì)胞里面活性氧比例依次減少約12.64%和5.95%。該現(xiàn)象的深層次原因可能是，處于低含量As（III）的環(huán)境中，HA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用可以減弱As（III）的生理毒性，雖然HA單獨(dú)使用后硅藻細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)有較低程度的促進(jìn)，它仍可以催化硅藻細(xì)胞里面的氧化應(yīng)激系統(tǒng)。

（3）離子界面的競(jìng)爭(zhēng)吸附作用對(duì)減輕As對(duì)植物毒害。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，As（III）和As（V）和其他重金屬的生理毒性，源自水生生物吸收周?chē)h(huán)境中Na+、Cl-和Ca2+等的阻礙現(xiàn)象，當(dāng)環(huán)境中重金屬的含量偏高時(shí)，它們會(huì)堵塞離子傳輸路徑并提高離子滲出率[30]。文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于HA對(duì)Na+、K+和Ca2+的吸收動(dòng)力學(xué)的影響，HA通過(guò)提高Na+活性吸收的極限容量來(lái)促進(jìn)Na+跨膜運(yùn)輸，該現(xiàn)象和Glover等[31]的試驗(yàn)結(jié)果一致。HA會(huì)增加植物細(xì)胞中Na+、K+與有關(guān)酶的生物活性，還能夠促進(jìn)離子遷移相關(guān)酶的生物活性，從而降低As（III）和其他重金屬的對(duì)植物的毒性。

2.3 HA通過(guò)降低土壤As生物有效性減輕As對(duì)植物的毒害

HA是一類(lèi)復(fù)雜的有機(jī)混合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)里面包含有多種有機(jī)官能團(tuán)，比如-COOH、-OH和-NH2等。HA與金屬離子的吸附和絡(luò)合作用直接影響了重金屬的毒性。HA通過(guò)絡(luò)合作用抑制重金屬遷移，減輕對(duì)植物危害。隨著HA施用濃度的增加，作物積累的重金屬含量隨之降低。Saada等[32]研究表明，HA中除含有大量苯環(huán)外，還含有大量-COOH等官能團(tuán)，分子表面呈孔狀結(jié)構(gòu)，增加了吸附表面積，同時(shí)HA中大量的活性基團(tuán)為As的吸附提供了更多的吸附位點(diǎn)，從而限制植物對(duì)As的吸收。相關(guān)研究顯示HA能夠和As（III）經(jīng)由配體交換進(jìn)行分子耦合而產(chǎn)生As-HA絡(luò)合物，由此減少植物生長(zhǎng)環(huán)境里面可利用的As（III）含量。Perassi等[33]研究表明，HA在固定As的同時(shí)，還會(huì)與磷肥形成HA-磷酸鹽絡(luò)合物，絡(luò)合物既能防止土壤對(duì)磷的固定又有利于植物吸收磷，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

土壤組成成分、pH以及外界引入土壤的競(jìng)爭(zhēng)離子等因素均會(huì)影響土壤對(duì)As的吸附[34]。其中不同形態(tài)的As在土壤中是可以相互轉(zhuǎn)化的，其轉(zhuǎn)化過(guò)程與氧化-還原、溶解-沉淀、甲基化-脫甲基以及生物富集等過(guò)程密切相關(guān)。隨pH的增高，土壤對(duì)As的吸附量減小，隨著Eh（氧化還原電位）值的減小和pH的升高，As的可溶性顯著增加。As（III）和As（V）隨Eh值改變而相互轉(zhuǎn)化。由于土壤對(duì)As的吸附作用，植物吸收的可利用量并不能通過(guò)土壤中的總As濃度來(lái)反映。相較于總量，土壤中As的存在形態(tài)更重要，其決定了As的生物有效性和毒性[35]。在典型環(huán)境狀況下，As（III）基本上是以HAsO2化合物存在，少量會(huì)以存在于土壤或水體，由于HA呈電負(fù)性，有研究表明，As能夠經(jīng)由金屬橋（例如Fe、Mn）與HA形成As-M-HA三聚絡(luò)合物[36～38]，從而抑制As對(duì)植物的毒害作用。王俊等[39]表明，在添加量≤1% C時(shí)FA和HA均可提高交換態(tài)As的分配比例，F(xiàn)A能顯著促進(jìn)土壤As由鋁型As和鐵型As向殘?jiān)鼞B(tài)As轉(zhuǎn)化，且隨用量的增加轉(zhuǎn)化作用增強(qiáng)，而HA的這種作用強(qiáng)度較弱，在HA添加量為5% C時(shí)甚至表現(xiàn)出相反的作用。劉利軍等[40]研究表明，在高pH土壤條件下，HA可以顯著降低溶解性As的含量，當(dāng)HA用量為10 g/kg土?xí)r，可以有效降低As對(duì)植物的毒害作用。

研究還發(fā)現(xiàn)，HA與重金屬間存在復(fù)雜的化學(xué)平衡，且HA直接或間接地向植物細(xì)胞供給有機(jī)碳源，刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育，顯示出對(duì)重金屬生理毒性的緩解功能[41]。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，隨著土壤As污染研究的深入，土壤As污染的植物修復(fù)逐漸成為研究熱點(diǎn)，特別是在減害的栽培措施方面頗有成效。本文主要綜述了砷的各種形態(tài)對(duì)植物的毒害程度，依毒性大小依次為As（III）＞As（V）＞二甲基砷＞單質(zhì)As；HA在減輕As對(duì)植物毒害方面的作用機(jī)理，包括影響氮代謝、介導(dǎo)作用、降低土壤As生物有效性的作用機(jī)理。目前，雖然已有一些關(guān)于HA對(duì)As污染植物毒性影響的分子生物學(xué)和細(xì)胞機(jī)制的研究，但仍然需要進(jìn)一步明確其影響機(jī)制。可借助先進(jìn)的分子生物學(xué)手段，從基因與蛋白分子水平精準(zhǔn)考察As污染植物毒性作用機(jī)制。