陳炯 胡丕波 鄔高華 周海波

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科，合肥 230001；2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)普外科，合肥 230001

近年來免疫療法成為癌癥治療手段中最有前景的方法之一，其中過繼免疫療法被認(rèn)為可改善腫瘤治療效果。過繼免疫療法是通過體外大量擴(kuò)增患者自身免疫細(xì)胞，然后回輸?shù)襟w內(nèi)，輔助人體原有的免疫系統(tǒng)，達(dá)到治療癌癥的效果[1-3]。雙陰性T細(xì)胞(double negative T cell，DNT細(xì)胞)是指CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞，在人類自身免疫反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)中均起到重要作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞同樣具有抗腫瘤作用[5]。誘餌受體3(decoy receptor 3, DcR3)是腫瘤壞死因子受體超家族成員，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，例如NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，可以與靶細(xì)胞表面的腫瘤壞死因子配體相關(guān)分子1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule 1A, TL1A)結(jié)合，輔助免疫細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[6]。本研究構(gòu)建胰腺癌裸鼠皮下種植瘤模型，靜脈輸注體外擴(kuò)增的DNT細(xì)胞，觀察DNT細(xì)胞對胰腺癌種植瘤的治療效果，探討DcR3和TL1A在其中所起的作用。

材料與方法

胰腺癌細(xì)胞株SW1990購自中科院上海細(xì)胞庫，復(fù)蘇后采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，2～3 d更換培養(yǎng)基，適時傳代。18只雄性BALB/c裸鼠購自上海史來克實(shí)驗(yàn)動物公司，4～5周齡，體重20～22 g。所有裸鼠均飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中。

按照抗體吸附法[7,8]分離提純DNT細(xì)胞。取健康志愿者外周血15 ml，加入CD4、CD8去除液各750 μl，室溫靜置20 min，將血液緩慢加入裝有15 ml淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?的離心管中，保持液面界面，室溫下1 200 r/min離心20 min(離心半徑4 cm)。吸取中間白色云霧層細(xì)胞，兩次洗滌后以200 r/min離心5 min(離心半徑4 cm)，用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將1×105/ml細(xì)胞加入到OKT3(美國 eBioscience公司)包被的6孔板中，依次加入2.5 μl IL-2和IL-4(美國 eBioscience 公司)后，置于37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液，適時傳代。12～13 d可收獲足量細(xì)胞，按課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[9]用流式細(xì)胞儀測定DNT細(xì)胞純度。

取對數(shù)生長期SW1990細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液(1.5×107/ml)，接種于裸鼠右側(cè)腋皮下(100 μl/只)，待腫瘤最大徑達(dá)0.5 cm時，將裸鼠隨機(jī)分為對照組、吉西他濱治療組和DNT細(xì)胞治療組，每組6只。對照組不做處理，吉西他濱治療組經(jīng)鼠尾靜脈注射吉西他濱(50 mg/kg)，DNT細(xì)胞治療組經(jīng)鼠尾靜脈注射DNT細(xì)胞懸液(1×108個細(xì)胞/ml，100 μl/只)。每天觀察小鼠狀況。飼養(yǎng)至第50天時頸椎脫位法處死裸鼠，取下種植瘤，測量體積和重量。腫瘤體積[V(cm)3]=1/2×長徑(cm)×短徑(cm) ×短徑(cm)。

取部分瘤組織剪碎，充分研磨，采用RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，BCA法對蛋白濃度進(jìn)行定量，調(diào)整濃度后常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測DcR3和TL1A蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。DcR3、TL1A抗體購于英國Abcam公司，工作濃度均為1∶500。最后ECL發(fā)光，X線片曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為蛋白相對表達(dá)量。

將瘤組織充分剪碎研磨，加入1 ml Trizol(美國Thermo公司)，按照試劑盒說明書提取瘤組織總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。然后以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。DcR3引物正向序列為5′-CAGACGTGCAACGACCTGAC-3′，反向序列為5′-TGGGACCTGCATCCTCAC-3′；TL1A引物正向序列為5′-CGGGGAGACGACCAAACAAG-3′，反向序列為5′-AAGGAGAACGTGGCCCCAAGGTA-3′；GAPDH引物正向序列為5′-CAAGGCTGTGGGCAAGGT-3′，反向序列為5′-GGAAGGCCATGCCAGTGA-3′。擴(kuò)增參數(shù)為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸40 s，循環(huán)40次。采用公式2-△△ct計(jì)算DcR3和TL1A mRNA的表達(dá)量。

取石蠟包埋的瘤體組織，切片，脫蠟水化，按照TUNEL凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)說明書操作。滴加經(jīng)過免疫染色洗滌液稀釋后的蛋白酶K(20 ng/ml)作用20 min，滴加免疫染色固定液固定30 min，滴加免疫染色強(qiáng)力通透液室溫靜置5 min。滴加TUNEL檢測液50 μl，37℃恒溫箱中靜置60 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，通過凋亡細(xì)胞半定量分析計(jì)算凋亡率。

結(jié) 果

DNT細(xì)胞從外周血中分離培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量為1×105/ml，經(jīng)過添加IL-2、IL4的培養(yǎng)液培養(yǎng)13 d左右，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到5×106/ml，DNT細(xì)胞純度>90%。

DNT細(xì)胞治療組種植瘤體積和重量分別為(670.28±124.54)mm3、(225.60±10.76)mg；吉西他濱治療組分別為(604.60±179.16)mm3、(222.68±8.73)mg；對照組分別為(1738.80±391.39)mm3、(265.07±10.76)mg(圖1)。DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組的種植瘤體積、重量均小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.37、7.17，6.45、7.49，P值均<0.01)，而DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組之間的種植瘤體積、重量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.74、0.60，P值分別為0.48、0.56)。

圖1 對照組(1)、DNT細(xì)胞治療組(2)和吉西他濱治療組(3)種植瘤標(biāo)本

DNT細(xì)胞治療組、吉西他濱治療組、對照組DcR3蛋白表達(dá)量分別為0.56±0.02、0.57±0.03、0.39±0.04，DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為8.99、8.80，P值均<0.001)，而DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.49，P=0.64)。DNT細(xì)胞治療組、吉西他濱治療組、對照組TL1A蛋白表達(dá)量分別為0.41±0.03、0.40±0.05、0.81±0.05，DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為18.04、14.82，P值均<0.001)，而DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.46，P=0.65，圖2)。

圖2 對照組(1)、DNT細(xì)胞治療組(2)、吉西他濱治療組(3)種植瘤組織DcR3、TL1A蛋白表達(dá)

DNT細(xì)胞治療組、吉西他濱治療組、對照組DcR3 mRNA的表達(dá)量分別為3.74±0.19、3.40±0.39、0.92±0.05，DNT細(xì)胞治療組及吉西他濱治療組均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為34.94、15.40，P值均<0.001)，而DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.95，P=0.08)。DNT細(xì)胞治療組、吉西他濱治療組和對照組TL1A mRNA表達(dá)量分別為0.83±0.11、0.79±0.08、1.70±0.36，DNT細(xì)胞治療組及吉西他濱治療組均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.69、6.08，P值均<0.001)，而DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.73，P=0.48)。

DNT細(xì)胞治療組、吉西他濱治療組和對照組的細(xì)胞凋亡率分別為(53.2±11.2)%、(56.2±8.6)%、(10.3±3.2)%，DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.00、12.28，P值均<0.001，圖3)，而DNT細(xì)胞治療組和吉西他濱治療組間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.52，P=0.61)。

圖3 對照組(3A、3B)、DNT細(xì)胞治療組(3C、3D)、吉西他濱治療組(3E、3F)細(xì)胞凋亡的明場圖(3A、3C、3E)及熒光(3B、3D、3F)對比圖(TUNEL，×100)

討 論

免疫治療是近年來逐漸走進(jìn)人們視野的一種新型的治療方法，癌癥的過繼免疫治療更是引起了全世界研究者的廣泛關(guān)注，參與過繼免疫治療的各種人體免疫細(xì)胞被深入研究，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群在腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵作用。本課題組所研究的DNT細(xì)胞最初被發(fā)現(xiàn)也正是因?yàn)槠鋮⑴c了免疫應(yīng)答的過程。人體中大多數(shù)T細(xì)胞都呈CD4和CD8陽性表達(dá)，兩種表面分子均呈陰性表達(dá)的T細(xì)胞僅占總細(xì)胞數(shù)的1%～5%。CD8陽性T細(xì)胞、NK T細(xì)胞以及γδ T細(xì)胞的抗腫瘤作用已經(jīng)被廣泛研究[10-12]，然而關(guān)于DNT細(xì)胞在抗腫瘤中應(yīng)用的報(bào)道較少，尤其是在實(shí)體腫瘤中的研究。本課題組采用目前最先進(jìn)的抗體吸附法在體外擴(kuò)增DNT細(xì)胞，并將其注射入胰腺癌細(xì)胞種植瘤裸鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞可以顯著延緩胰腺癌種植瘤的生長，且DNT細(xì)胞治療組種植瘤細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增高。更有意義的是，DNT細(xì)胞對胰腺癌種植瘤的治療效果與作為陽性對照組的臨床常用化療藥吉西他濱的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示將DNT細(xì)胞免疫治療胰腺癌用于臨床具有一定的可能性。

DNT細(xì)胞的抗腫瘤作用雖然被越來越多的學(xué)者關(guān)注，但是其具體機(jī)制尚不清楚。DcR3是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族成員，它最初是在癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。與大多數(shù)TNFR成員不同，DcR3缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，且可在血清和細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測到[13]。其配體TL1A同樣也是TNF超家族成員，由174個氨基酸構(gòu)成，主要高表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞[14]。有研究報(bào)道DcR3-TL1A是一種新的免疫信號通路，它在炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎等疾病中發(fā)揮重要的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)DcR3蛋白和mRNA在DNT細(xì)胞治療組的表達(dá)明顯高于對照組，而TL1A蛋白和mRNA的表達(dá)與DcR3表達(dá)情況相反，因此DNT細(xì)胞可能是通過上調(diào)胰腺癌細(xì)胞DcR3表達(dá)和下調(diào)TL1A表達(dá)來產(chǎn)生治療作用的。有研究指出TLIA蛋白可以提高T細(xì)胞免疫活性，從而進(jìn)一步增強(qiáng)與靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)[16]。Chen等[17]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過人工上調(diào)DcR3蛋白表達(dá)后，T細(xì)胞對胰腺癌的免疫治療作用明顯增加。本研究的結(jié)論與他們一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞對DcR3和TL1A調(diào)節(jié)能力與化療藥吉西他濱相似，兩者是否均通過介導(dǎo)DcR3-TL1A途徑抑制胰腺腫瘤生長有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究證明了DNT細(xì)胞在體內(nèi)對裸鼠胰腺癌種植瘤生長有明顯的抑制作用，其效果與臨床常用化療藥吉西他濱相似，DcR3-TL1A可能參與了DNT細(xì)胞的抑癌作用機(jī)制，這為DNT細(xì)胞過繼免疫治療胰腺癌的臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突