潘培培 劉東平 謝太震 張忠良 杜南山 樸鳳植 申順善

摘 要：為探討L14-3菌株對辣椒疫病的生防潛力，采用皿內對峙試驗和孢子萌發(fā)試驗，測定其對辣椒疫霉菌的抑制活性，通過盆栽試驗驗證其對辣椒疫病的防治效果，并根據形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析對其進行鑒定。結果表明，L14-3菌株對辣椒疫霉菌的菌絲生長、游動孢子囊的形成、游動孢子的釋放和休止孢子的萌發(fā)均具有顯著的抑制作用;在盆栽試驗中，L14-3處理對辣椒疫病的防治效果達到75.00%。經過鑒定，L14-3菌株為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

關鍵詞：辣椒;多黏類芽孢桿菌;疫病;抑制活性;防治效果;鑒定

中圖分類號：S641.3+S436 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）01-029-06

Biocontrol potential of antagonistic bacteria L14-3 against Phytophthora capsici and its identification

PAN Peipei1， LIU Dongping1， XIE Taizhen1， ZHANG Zhongliang1， DU Nanshan2， PIAO Fengzhi2， SHEN Shunshan1

（1. Henan New Pesticide Discovery Key Laboratory/College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to study the biocontrol potential of strain L14-3 against phytophthora blight of pepper， the antifungal activity of strain L14-3 against Phytophthora capsici were detected by in vitro and pot experiments. The results showed that， in vitro experiment， L14-3 was significant inhibit the mycelial growth， zoosporangium production， release and germination of zoospore of P. capsici. In the pot experiment， L14-3 performed the successful potential control against Phytophthora blight of pepper， the control efficiencies was 75.00%. In addition， based on the morphological，physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis， the strain L14-3 was identified as Paenibacillus polymyxa.

Key words： Pepper; Paenibacillus polymyxa; Phytophthora blight; Aantifungal activity; Control effect; Identification

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的一種具有毀滅性的土傳病害，在辣椒整個生育期均會發(fā)生。此病害發(fā)病速度快，傳播范圍廣，給辣椒生產造成非常嚴重的損失[1]。近年來，不合理的輪作制度、水肥過度使用及品種抗病性差等因素，造成土壤中病原菌逐年積累，進而導致辣椒疫病的發(fā)生與流行。雖然目前已有多種防治方法，但是都存在著各種局限和不足。首先是現(xiàn)有的抗病品種單一，大多數抗病基因只能在一定的種、屬之間表達，而幾乎所有抗病品種都只對某一種或者少數幾種致病微生物有抵抗能力;其次是土壤消毒的方法雖然簡單、有效，但大多數只能局限于設施農業(yè)，在大田農業(yè)中很難實現(xiàn)，并且用化學藥劑還會使病原菌產生抗藥性，并對環(huán)境造成污染[2]。植物根際細菌是指生長在植物根圈兒范圍內所有細菌的統(tǒng)稱，其中很多細菌能促進植物生長，防治植物病害，改善植物微生態(tài)環(huán)境，被稱為植物根際促生細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）。植物根際促生細菌因其促生、防病、改善土壤微生態(tài)及對環(huán)境友好等特點，彌補了植物病害傳統(tǒng)防治方法的缺陷與不足，在農業(yè)生產上具有十分廣闊的應用前景[3]。目前，利用植物根際促生細菌防治辣椒疫病的研究比較活躍。如從小麥根際分離的菌株綠針假單胞菌HG28-5，不僅對辣椒疫病具有顯著的防治作用，還能夠促進辣椒生長[4];枯草芽孢桿菌IBFCBF-4對辣椒疫病的防效高達64.28%，并可顯著促進辣椒生長[5];解淀粉芽孢桿菌CRJ-9對辣椒疫霉菌的拮抗作用明顯，對辣椒疫病的防治效果顯著[6]。

筆者從油菜根際分離的根際微生物中篩選出具有拮抗活性的L14-3菌株，確認其對辣椒疫霉菌的抑制活性和辣椒疫病的防治效果，在此基礎上，對L14-3菌株進行了形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析等方面的鑒定，研究其生防潛力，為辣椒疫病的生物防治提供了一定的理論依據和生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試辣椒品種為‘新金富808（河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司）。供試菌株：L14-3菌株分離自河南省許昌采集的健康油菜根際土壤，保存于實驗室-80 ℃超低溫冰箱;辣椒疫霉菌由河南農業(yè)大學植物病害生物防治研究室分離保存并鑒定。

供試培養(yǎng)基：供試培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基（土豆200 g，切成小塊煮沸15 min，雙層紗布過濾，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL）、PDK培養(yǎng)基（土豆200 g，切成小塊煮沸15 min，雙層紗布過濾，蛋白胨10 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 000 mL）、TSA培養(yǎng)基（TSB 30 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 000 mL）和V8A培養(yǎng)基（V8 Juice 100 mL，碳酸鈣1 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。

1.2 試驗設計

試驗于2018年7月至2019年8月在河南農業(yè)大學植物病理研究室進行。在室內進行L14-3菌株對辣椒疫霉菌抑制活性的測定，包括菌絲生長、游動孢子囊形成、游動孢子釋放及孢子萌發(fā)等;然后通過盆栽試驗測定L14-3菌株對辣椒疫病的防治效果，試驗設3個處理（L14-3處理、清水處理及健康對照），隨機區(qū)組設計，3次重復;另外，根據形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析等對L14-3菌株進行鑒定。

1.3 L14-3菌懸液的配制

將L14-3菌株在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，用濃度為0.1 mol·L-1無菌MgSO4溶液刮菌制成108 cfu·mL-1的菌懸液待用。

1.4 辣椒疫霉菌孢子懸浮液的配制

將辣椒疫霉菌在V8A培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，在超凈工作臺上用打孔器在菌落邊緣打菌餅，將其放在空的無菌培養(yǎng)皿中并加入無菌水，加到菌落剛好浸濕，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。待形成游動孢子囊后，置于4 ℃冰箱30 min，誘發(fā)其釋放游動孢子，收集游動孢子并稀釋為104 cfu·mL-1的游動孢子懸浮液。

1.5 L14-3對辣椒疫霉菌的抑制活性測定

1.5.1 菌絲生長的抑制活性測定 菌株L14-3對辣椒疫霉菌菌絲的抑制能力測定采用平板對峙培養(yǎng)法。將辣椒疫霉病菌接種在PDA平板上培養(yǎng)，2 d后用打孔器取直徑5 mm辣椒疫霉菌菌餅，接在PDK平板中央，距離菌餅25 mm處接種L14-3，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后觀察抑菌圈大小。

1.5.2 游動孢子囊形成的抑制活性測定 將辣椒疫霉菌在V8A培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，然后用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，把菌餅放在滅菌后的培養(yǎng)皿中，然后加入L14-3菌懸液（108 cfu·mL-1），使菌懸液剛剛浸沒菌餅表面，置于25 ℃光照恒溫箱中培養(yǎng)16 h之后，在10×10倍的顯微鏡下觀察，并記錄每個視野中產生游動孢子囊的數量。以加入無菌水作為對照。

1.5.3 游動孢子釋放的抑制活性測定 將產生孢子囊的疫霉菌菌餅放入滅菌后的培養(yǎng)皿中，加入L14-3菌懸液（108 cfu·mL-1）至浸沒菌餅，然后在4 ℃冰箱中放置0.5 h，誘發(fā)其釋放游動孢子，在10×10倍顯微鏡下觀察，并記錄游動孢子囊總數和孢子囊空殼數，計算游動孢子釋放率。以加入無菌水作為對照。

釋放率/%=游動孢子囊空殼數/游動孢子囊總數×100。

1.5.4 休止孢子萌發(fā)的抑制活性測定 辣椒疫霉菌的游動孢子囊釋放游動孢子后，用雙層紗布過濾，獲得休止孢子懸浮液。取等量的休止孢子懸浮液和L14-3菌懸液，均勻混合之后滴加到凹玻片上，然后將其放到28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每2 h在顯微鏡下調查孢子萌發(fā)數，計算休止孢子萌發(fā)率。以混合無菌水作為對照。

萌發(fā)率/%=萌發(fā)孢子數/休止孢子總數×100。

1.6 L14-3對辣椒疫病的防治效果測定

將辣椒苗培育至4～5片真葉，選取健壯辣椒苗移栽于直徑為90 mm的花盆中，灌注L14-3菌懸液（108 cfu·mL-1，50 mL·株-1），然后沿花盆壁接種辣椒疫霉游動孢子懸浮液（104 cfu·mL-1， 5 mL·株-1），試驗設3次重復，每個重復5株，以清水作為對照。置于溫室培養(yǎng)，參考病情分級標準，計算病情指數及防治效果[7]。

病情指數=[∑（各級發(fā)病數×各級代表數）調查總數×最高級代表值]×100;

防治效果/%=[對照病情指數-處理病情指數對照病情指數]×100。

1.7 L14-3對多種病原菌的抑菌效果測定

采用平板對峙法測定L14-3的抑制活性。將供試病原菌菌餅放在PDK平板中央，在距離菌餅25 mm處接種L14-3，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，然后觀察并記錄抑菌圈大小。

1.8 L14-3的鑒定

1.8.1 形態(tài)和培養(yǎng)特性的觀察 將L14-3菌株在TSA平板上劃線培養(yǎng)，3 d后觀察菌落的形狀、大小、顏色、光澤、黏稠度、透明度、邊緣特征等。L14-3菌體形態(tài)特征的觀察采用革蘭氏染色法，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[8]。

1.8.2 生理生化特性的測定 生理生化特性主要參照《伯杰氏細菌學鑒定手冊》進行測定[9]。

1.8.3 16S rDNA序列同源性分析 在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)L14-3，挑取細菌單菌落。使用生工生物科技有限公司的試劑盒提取細菌DNA。引物采用的是細菌通用引物，分別為27 f （AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG）和1 492 r（TAC GGH TAC CTT ACG ACTT），PCR擴增采用50 μL反應體系，PCR反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%（m/V）的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。擴增產物送生物公司測序，測序結果利用NCBI Blast檢索比對，并采用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9 數據分析

采用DPS 6.5和Microsoft Excel 2013對數據進行統(tǒng)計分析，以最小顯著差數法（LSD）分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 L14-3對辣椒疫霉菌的抑制活性

菌絲生長的抑制效果：L14-3菌株對辣椒疫霉菌菌絲生長具有較強的抑制活性。在PDK培養(yǎng)基平板上抑制辣椒疫霉菌菌絲生長，能夠形成明顯的抑菌帶（圖1），抑菌帶寬度為0.74 cm。游動孢子囊形成的抑制效果：在10×10倍顯微鏡下，對照的視野中能夠形成189.33個游動孢子囊，而L14-3菌株處理的視野中只形成了6.33個，對辣椒疫霉菌游動孢子囊形成的抑制率達96.66%（表1）。游動孢子釋放的抑制效果：在10×10倍鏡下，對照的視野中，游動孢子的釋放率為70.69%，而L14-3菌株處理的視野中，游動孢子釋放率為0.86%，其抑制率達98.78%（表2）。休止孢子萌發(fā)的抑制效果：在水中培養(yǎng)2 h時休止孢子萌發(fā)率為38.44%，培養(yǎng)8 h時萌發(fā)率達到98.50%，而L14-3菌株處理的休止孢子培養(yǎng)2 h時沒有萌發(fā)，培養(yǎng)8 h時萌發(fā)率僅達到4.20%，對孢子萌發(fā)的抑制率達到99.57%（圖2）。

2.2 L14-3對辣椒疫病的防治效果

在盆栽試驗中，L14-3菌株對辣椒疫病具有顯著的防治效果。對照辣椒苗在處理第7天時莖基部開始皺縮變褐，第12天時病情指數為64.00;而L14-3菌株處理的辣椒苗，第10天開始表現(xiàn)出輕微癥狀，第12天時的病情指數為16.00，對辣椒疫病的防治效果達到75.00%（表3，圖3）。

2.3 L14-3對多種病原菌的抑制效果

L14-3菌株除辣椒疫霉菌以外，對多種植物病原菌具有抑菌活性，其抑菌帶寬度大于0.75 cm，顯示其生防潛力（表4，圖4）。

2.4 L14-3的鑒定

L14-3菌體為直桿狀，革蘭氏陽性，在TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為米黃色、半透明、邊緣不整齊的不規(guī)則形。在4～50 ℃范圍內均能生長，耐鹽度不高于4%，可以利用葡萄糖和蔗糖，不能利用果糖，硝酸鹽還原反應、淀粉水解反應呈陽性，亞硝酸鹽還原反應、明膠液化呈陰性（表5）。另外，以L14-3菌株總DNA為模板，PCR擴增出長度約為1.5 kb的DNA片段?；厥赵撈芜M行序列測定結果，L14-3的16S rDNA片段序列長為1 579 bp，進行NCBI BLAST比對的結果表明，與多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）的16S rDNA序列相似性達到99%，并對其構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。因此，根據形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析，將L14-3菌株鑒定為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

3 討論與結論

辣椒疫霉菌主要以卵孢子在土壤中和病殘體上越冬，在適宜的溫度和濕度條件下，辣椒疫霉菌產生新的孢子囊，釋放游動孢子，孢子萌發(fā)侵入辣椒的根部、莖基部和葉部。在辣椒的整個生長發(fā)育期間，發(fā)病的辣椒植株上的疫霉菌會不斷產生孢子囊和游動孢子，發(fā)生多次再侵染。一般辣椒疫霉菌的菌絲、孢子囊或孢子萌發(fā)產生芽管初次侵染植株后，營養(yǎng)菌絲在寄主細胞間生長，通過無性繁殖形成孢子囊。在潮濕環(huán)境下，孢子囊萌發(fā)再次侵染植株，往復循環(huán)。田間辣椒疫霉菌的侵入和傳播主要靠游動孢子囊和游動孢子，可造成病原菌的大量傳播及病害的流行[10]。馬艷等[11]篩選的拮抗真菌F-310能抑制病原菌孢子囊的形成，又能抑制已經形成的孢子囊和游動孢子的萌發(fā)，從而抑制了病菌的無性繁殖。本研究結果表明，L14-3菌株不僅能抑制辣椒疫霉菌菌絲生長，還能抑制游動孢子囊的形成、游動孢子釋放及休止孢子的萌發(fā)，抑制辣椒疫霉菌侵入，阻斷辣椒疫霉菌再次形成侵染源及再次侵染，切斷病害擴散蔓延，可有效控制病害的發(fā)生和流行，為辣椒疫病的生物防治提供了一定的理論依據和生防資源。

芽孢桿菌因繁殖速度快、對高溫和干旱的耐性強、對營養(yǎng)要求比較簡單和定殖能力強等優(yōu)點成為植物病害生物防治中研究應用最多的一類生防微生物[12-13]。已報道，枯草芽孢桿菌和蠟質芽孢桿菌對水稻紋枯病有較好的防治效果[14];特基拉芽孢桿菌XT1-4對馬鈴薯黃萎病菌的拮抗作用比較明顯，防治效果達到60%以上[15];多黏類芽孢桿菌BRF-1的代謝產物能夠抑制枯萎病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，盆栽防治效果顯著，并且能夠促進植株的生長[16]。本研究中篩選的L14-3菌株為多黏類芽孢桿菌，對辣椒疫霉菌有較強的抑制活性，其抑菌譜比較廣，除辣椒疫霉菌以外，對鐮孢菌等多種植物病原菌物具有顯著抑菌活性。與姜旭[17]研究中結果一致，多黏類芽孢桿菌BRF-1能夠抑制枯萎病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，盆栽防治效果顯著，并且能夠促進植株生長。同時，菌株L14-3在室內培養(yǎng)條件下具有產生嗜鐵素、分解纖維素和分解蛋白等特性（結果未列出），是一株多功能的具有較大生防潛力的生防菌。生防微生物防治植物病害的機制是多方面的，包括分泌拮抗活性物質、與病原物競爭營養(yǎng)和生態(tài)位、誘導植物抗性等，有關L14-3菌株在田間的使用效果及具體防病機制還有待進一步探索和研究。

參考文獻

[1] 周耀.辣椒疫病拮抗菌株篩選及防治效果研究[J].新農業(yè)，2019（20）：32-35.

[2] 信奎.農林園藝作物土傳病害防治現(xiàn)狀及應對策略[J].現(xiàn)代園藝，2018（18）：71.

[3] 李麗.論生物技術在植物病蟲害防治中的作用[J].農民致富之友，2019（32）：68.

[4] 王娟，劉東平，丁方麗，等.促植物生長根際細菌HG28-5對黃瓜苗期生長及根際土壤微生態(tài)的影響[J].中國蔬菜，2016（8）：50-55.

[5] 談泰猛，黎繼烈，申愛榮，等.辣椒疫病拮抗菌的分離、鑒定及其生防效果[J].生態(tài)學雜志，2017，36（4）：988-994.

[6] 程睿君，原晨虹，成巨龍，等.一株抗辣椒疫霉的根際細菌CRJ-9的篩選、鑒定及防治效果研究[J].河北農業(yè)大學學報，2019，42（1）：83-89.

[7] 毛愛軍，胡洽，耿三省.辣椒疫病菌接種鑒定技術研究[J].北京農業(yè)科學，1998，16（2）：21-24.

[8] 吳坤，張世敏.微生物學實驗技術[M].北京：氣象出版社，2004：10-12.

[9] BUCHANAN R E，GIBBONS N E.Bergey's manual of systematic bacteriology[M].9th ed.Baltimore：Williams & Wilkins Company，1994.

[10] 郭堅華，李師默，祁紅英.PGPR在土傳病害生物防治中的應用（上）[J].世界農業(yè)，1999（2）：34-36.

[11] 馬艷，常志州，朱萬寶，等.拮抗真菌F-310對辣椒疫霉菌的抗生活性及防效[J].江蘇農業(yè)學報，2004，20（3）：180-183.

[12] 吳輝，潘夢武，高易宏，等.辣椒疫病生防菌的篩選、鑒定及其抑菌機理初探[J].湖北農業(yè)科學，2015，54（7）：1596-1599.

[13] 葉晶晶，曹寧寧，張劍飛，等.芽孢桿菌在植病生防中的應用研究進展[J].農業(yè)科學與技術（英文版），2013，14（5）：695-698.

[14] 李華榮，肖建國，顏思齊.蠟質芽孢桿菌R2防治水稻紋枯病的研究[J].植物病理學報，1993，23（2）：101-105.

[15] 申建芳，李子桀，蒙春燕，等.馬鈴薯黃萎病生防細菌的篩選與鑒定[J].北方農業(yè)學報，2018，46（1）：81-84.

[16] 陳雪麗，王光華，金劍，等.多粘類芽孢桿菌BRF-1和枯草芽孢桿菌BRF-2對黃瓜和番茄枯萎病的防治效果[J].中國生態(tài)農業(yè)學報，2008，16（2）：446-450.

[17] 姜旭.利用微生物防治植物病害研究進展[J].園藝與種苗，2018（6）：57-58.