江華娟，李敏敏，何 瑤，姜明光，王升菊，郭 鑫，李 宇，傅超美

基于HPLC指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別的經(jīng)典名方桃紅四物湯制備過(guò)程質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

江華娟1，李敏敏1，何 瑤1, 2*，姜明光1，王升菊1，郭 鑫2，李 宇2，傅超美1*

1. 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 貴州益佰制藥股份有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550001

基于中藥復(fù)方化學(xué)成分群整體指紋信息，考察桃紅四物湯（TSD）湯劑制備過(guò)程中化學(xué)成分的變化，并分析其影響質(zhì)量的波動(dòng)成分和主要貢獻(xiàn)成分，為其質(zhì)量評(píng)控提供參考。按照經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝，制備TSD一次煎煮（A組）、二次煎煮（B組）、冷凍干燥（C組）3個(gè)制備過(guò)程樣品，建立18批藥材3組樣品的HPLC指紋圖譜，采用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 20.0進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA），SIMCA 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），分析3組樣品中化學(xué)指紋信息的動(dòng)態(tài)變化。選取17個(gè)色譜峰作為指紋圖譜共有峰，3個(gè)組別各18批樣品相似度分別均大于0.900；共指認(rèn)出沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、苦杏仁苷、咖啡酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯共10個(gè)成分；HCA、PLS-DA將54批樣品分為2類，A組樣品一類，B、C組樣品一類；PLS-DA分析篩選出6個(gè)差異性色譜峰；根據(jù)PCA綜合模型計(jì)算，綜合評(píng)分結(jié)果為B 組＞C組＞A組，TSD煎煮2次較為合理，冷凍干燥能較好保留煎液中的成分，色譜峰16（藁本內(nèi)酯）、1（沒(méi)食子酸）、13、12（阿魏酸）、7（苦杏仁苷）、15（洋川芎內(nèi)酯A）是影響樣品質(zhì)量的標(biāo)志性差異物質(zhì)。通過(guò)HPLC指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別夠較好地辨識(shí)制備過(guò)程中影響TSD質(zhì)量的標(biāo)志性成分，為經(jīng)典名方制備工藝評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)志物辨識(shí)思路提供了 參考。

桃紅四物湯；經(jīng)典名方；指紋圖譜；HPLC；制備過(guò)程；化學(xué)模式識(shí)別；質(zhì)量標(biāo)志物；質(zhì)量評(píng)價(jià)；中藥復(fù)方化學(xué)成分群；冷凍干燥；聚類分析；主成分分析；偏最小二乘法-判別分析；沒(méi)食子酸；5-羥甲基糠醛；原兒茶酸；苦杏仁苷；咖啡酸；羥基紅花黃色素A；芍藥苷；阿魏酸；洋川芎內(nèi)酯A；藁本內(nèi)酯

桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction，TSD）出自于清代柴得華所著《婦科冰鑒》，是《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》收載方劑。公布處方為生地三錢（酒洗），當(dāng)歸四錢（酒洗），白芍錢五分（酒炒），川芎一錢，桃仁十四粒（去皮尖研泥），紅花一錢（酒洗），水煎溫服，用于血多有塊，色紫稠粘者，有瘀停也，TSD隨其流以逐之?[1-2]。TSD傳統(tǒng)應(yīng)用于婦科血瘀月經(jīng)不調(diào)等，后被廣泛用于各種血瘀、血虛之證，對(duì)于中醫(yī)治療的優(yōu)勢(shì)病種如心腦血管疾病?[3-4]、婦產(chǎn)科疾病?[5-6]、骨科疾病等?[7]均有較好的療效，將該方劑開(kāi)發(fā)為中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑有較好的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。

中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不科學(xué)、質(zhì)量追溯性差、質(zhì)量均一性差等問(wèn)題一直是亟待解決的技術(shù)瓶頸，已成為行業(yè)發(fā)展的重中之重，經(jīng)典名方復(fù)方制劑研發(fā)成為中成藥質(zhì)量提升的突破口。經(jīng)典名方復(fù)方制劑研發(fā)過(guò)程中，首先需要開(kāi)展“物質(zhì)基準(zhǔn)”質(zhì)量研究?！敖?jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)”?[8]是指以古代醫(yī)籍中記載的經(jīng)典名方制備方法為依據(jù)制備而得的中藥藥用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，除成型工藝外，其余制備方法應(yīng)當(dāng)與古籍記載基本一致。經(jīng)典名方復(fù)方制劑的所有藥學(xué)研究均須與物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，以確保與物質(zhì)基準(zhǔn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性一致。由此可見(jiàn)，建立以關(guān)鍵質(zhì)量屬性辨識(shí)和量值傳遞為核心的制劑過(guò)程質(zhì)量控制體系，是高品質(zhì)經(jīng)典名方的研發(fā)核心。

課題組前期基于質(zhì)量標(biāo)志物辨識(shí)思路，對(duì)TSD的質(zhì)量控制研究現(xiàn)狀和質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)進(jìn)行了詳細(xì)綜述?[9]；并進(jìn)行了TSD物質(zhì)基準(zhǔn)的研究工作，在古籍溯源和遵古宜今的思路下，根據(jù)阿魏酸、羥基紅花黃色素A和芍藥苷3個(gè)指標(biāo)成分的含量選擇了煎煮2次，采用冷凍干燥法制成了物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物。但是其工藝路線選擇的合理性，以及方中的化學(xué)成分群在煎煮、冷凍干燥過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化仍需進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)基于TSD化學(xué)特質(zhì)群在制劑過(guò)程的傳遞特性，按照TSD經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的制備過(guò)程，制備一煎液、二煎液、凍干粉3組樣品，通過(guò)建立18批次藥材的3組共54個(gè)樣品HPLC指紋圖譜，進(jìn)行指紋圖譜分析和化學(xué)模式識(shí)別，整體評(píng)價(jià)TSD物質(zhì)基準(zhǔn)制備過(guò)程中煎煮次數(shù)、冷凍干燥對(duì)湯液質(zhì)量的影響，并篩選出制備過(guò)程中波動(dòng)較大的成分、對(duì)湯液整體質(zhì)量貢獻(xiàn)成分，為TSD制劑過(guò)程質(zhì)量控制指標(biāo)選擇和經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量研究思路提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Dionex ULtiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)，包括8154930四元梯度泵、6022020進(jìn)樣器、8155307柱溫箱、8149920 DAD檢測(cè)器、7313241在線脫氣機(jī)和Chromelon Console工作站，賽默飛世爾科技有限公司；DL-720D數(shù)控超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；FTS-10A液體加熱器，潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UPK-I-10T型優(yōu)普系列超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式真空泵，北京中興偉業(yè)有限公司；DD5臺(tái)式大容量低速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)wkq19032208）、原兒茶酸（批號(hào)wkq18041907）、羥基紅花黃色素A（批號(hào)wkq18041907）、苦杏仁苷（批號(hào)wkq19070210）、咖啡酸（批號(hào)wkq16081501）、5-羥甲基糠醛（批號(hào)wkq19092704）、芍藥苷（批號(hào)wkq18032104）、阿魏酸（批號(hào)wkq16080209）、洋川芎內(nèi)酯A（批號(hào)wkq18041907）、藁本內(nèi)酯（批號(hào)wkq18041907），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 藥材

試驗(yàn)用藥材均購(gòu)于包含道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)的3個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定方向裴瑾教授鑒定，紅花為菊科紅花屬植物紅花L.的干燥花，桃仁為薔薇科櫻桃屬植物桃(L.) Batsch的干燥成熟種子，地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根，白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根，川芎為傘形科藁本屬植物川芎Hort.的干燥根莖，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根。TSD 6味藥材，每味藥材3個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)6因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到18批樣品如表1所示。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 參考經(jīng)典名方目錄中TSD的處方和制備方法，處方中各味藥材按照古籍記載的炮制要求及實(shí)驗(yàn)室研究得到的炮制工藝進(jìn)行炮制得到飲片。處方劑量按古籍記載2.68倍量，稱取酒炙地黃30 g、酒炙當(dāng)歸40 g、酒炙白芍15 g、川芎10 g、酒炙紅花10 g、燀桃仁10 g，加8倍量水浸泡30 min，第1次煎煮1 h，第2次煎煮1.5 h，合并煎液，定容到適當(dāng)濃度，取10 mL，4000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得TSD供試品溶液。

表1 TSD藥材產(chǎn)地批號(hào)

一次煎煮樣品制備（A組）：分別于煎煮1次后取一半煎液，加水稀釋至1150 mL（生藥量0.05 g/mL），按表1藥材產(chǎn)地批號(hào)組合制樣得到A1～A18共18批樣品。

二次煎煮樣品制備（B組）：取第1次煎煮的一半煎液與第2次煎煮得到的另一半煎液混合，加水稀釋至1150 mL（生藥量0.05 g/mL），制樣得到B1～B18共18批樣品。

冷凍干燥樣品制備（C組）：取二次煎煮樣品10 mL置于培養(yǎng)皿中，預(yù)凍24 h后，于冷凍干燥機(jī)中凍干48 h，加超純水溶解，定容至10 mL（生藥量0.05 g/mL），制樣得到C1～C18共18批樣品。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸、原兒茶酸、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、咖啡酸、5-羥甲基糠醛、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯，置于10個(gè)量瓶中，分別加甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為1.218、1.058、1.212、1.079、1.248、1.367、1.534、1.325、1.245、1.308 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別取上述10種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得沒(méi)食子酸、原兒茶酸、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、咖啡酸、5-羥甲基糠醛、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯各成分質(zhì)量濃度分別為0.609、0.529、0.606、0.270、0.312、0.684、0.384、0.662、0.622、0.327 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱為Agilent HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～20 min，5%～13%乙腈；20～45 min，13%～17%乙腈；45～55 min，17%～21%乙腈；55～85 min，21%～65%乙腈；85～95 min，65%～80%乙腈；95～100 min，80%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。精密吸取空白溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按照“2.1.1”項(xiàng)方法取第1批次藥材組合制得的同一供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，選擇出峰穩(wěn)定、響應(yīng)值高、峰面積較大的阿魏酸為參照峰，各共有峰保留時(shí)間的RSD為0.088%，峰面積RSD為1.00%，表明本方法精密度良好。

1-沒(méi)食子酸 2-5-羥甲基糠醛 3-原兒茶酸 7-苦杏仁苷 9-咖啡酸 10-羥基紅花黃色素A 11-芍藥苷 12-阿魏酸 15-洋川芎內(nèi)酯A 16-藁本內(nèi)酯

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取第1批次藥材組合制得的同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24、48 h進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜，以阿魏酸為參照峰，各共有峰保留時(shí)間的RSD為0.15%，峰面積的RSD為1.24%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取第1批次藥材組合制備的供試品溶液6份，記錄指紋圖譜，以阿魏酸為參照峰，各共有峰保留時(shí)間的RSD均小于2.17%，峰面積RSD均小于2.03%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 TSD指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備18批藥材的3組共54個(gè)樣品供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將得到的HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版本），以?shī)A角余弦為測(cè)度對(duì)上述指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。采用平均數(shù)法，時(shí)間窗為0.1 min，進(jìn)行色譜峰匹配及相似度分析，結(jié)果見(jiàn)圖2和表2、3。指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果以對(duì)照?qǐng)D譜為參照，各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，分別計(jì)算出各組別相似度均＞0.900，如表2所示，表明不同產(chǎn)地、不同批次供試品的主要物質(zhì)群差異較小。

表2 TSD3組樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果

表3 TSD3組樣品特征峰保留時(shí)間和峰面積

根據(jù)評(píng)價(jià)系統(tǒng)生成的指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，標(biāo)定A、B、C 3組樣品共有峰，綜合3組樣品指紋圖譜信息，選擇特征明顯、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定出17個(gè)色譜峰。經(jīng)混合對(duì)照品溶液色譜圖（圖1）的保留時(shí)間比對(duì)，17個(gè)色譜峰中指認(rèn)出10個(gè)成分，分別是1號(hào)峰（沒(méi)食子酸）、2號(hào)峰（5-羥甲基糠醛）、3號(hào)峰（原兒茶酸）、7號(hào)峰（苦杏仁苷）、9號(hào)峰（咖啡酸）、10號(hào)峰（羥基紅花黃色素A）、11號(hào)峰（芍藥苷）、12號(hào)峰（阿魏酸）、15號(hào)峰（洋川芎內(nèi)酯A）、16號(hào)峰（藁本內(nèi)酯）。54個(gè)樣本保留時(shí)間和峰面積結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果顯示一煎液的相對(duì)峰面積明顯小于二煎液，說(shuō)明煎煮次數(shù)對(duì)成分含量影響大；二煎液和冷凍干燥樣品相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，可見(jiàn)冷凍干燥過(guò)程很好地保留了主要物質(zhì)群。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.5.1 聚類分析（HCA） 將指紋圖譜的17個(gè)共有峰峰面積，處理成量化特征峰數(shù)據(jù)。運(yùn)用SPSS 20.0分析軟件對(duì)其進(jìn)行HCA分析，采用組間連接法，以歐式平方距離為測(cè)度，Z標(biāo)準(zhǔn)化，將54個(gè)樣本進(jìn)行分類，結(jié)果由圖3所示?？傮w來(lái)看，54個(gè)樣本分為2類，A1～A18單獨(dú)為一類，B1～B18和C1～C18為一類，由此可見(jiàn)且煎煮次數(shù)對(duì)質(zhì)量的影響遠(yuǎn)超過(guò)藥材產(chǎn)地批次的影響。B、C組內(nèi)部由于藥材產(chǎn)地批次不同又分為2類，第1～6批次藥材制備的樣品歸為一類，其余批次為一類。

2.5.2 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 提取各樣品的色譜指紋峰信息，將歸一化的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-PV11.0（Umetrics，Sweden）軟件中，經(jīng)過(guò)中心化、標(biāo)準(zhǔn)化后再進(jìn)行PLS-DA等多變量統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)PLS-DA模型第1主成分的VIP值（閾值＞1）并同時(shí)結(jié)合檢驗(yàn)的值（閾值0.05）來(lái)尋找差異性關(guān)鍵成分。在置信區(qū)間（95%）內(nèi)，54個(gè)樣品存在一定差異性，根據(jù)分布可將54批樣品分為2類，如圖4所示，樣品A1～A18為一類，B1～B18和C1～C18為一類，其分類結(jié)果與HCA分析結(jié)果一致。

利用PLS-DA模型第1主成分的變量重要性投影（VIP）值（閾值＞1）并同時(shí)結(jié)合檢驗(yàn)的值（閾值0.05）尋找到3組樣品間的標(biāo)志性差異成分，如圖5、6所示。由圖5得分圖可知，17個(gè)成分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明3組樣品化學(xué)成分相似。質(zhì)量穩(wěn)定VIP值越大，表明對(duì)樣品分類貢獻(xiàn)越大，由圖6可見(jiàn)，VIP值＞1的有6種成分，依次是色譜峰16（藁本內(nèi)酯）、1（沒(méi)食子酸）、13、12（阿魏酸）、7（苦杏仁苷）、15（洋川芎內(nèi)酯A），說(shuō)明這6種成分是影響不同批次、組別樣品質(zhì)量的差異性物質(zhì)，在制備過(guò)程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。

圖3 TSD3組樣品聚類樹(shù)狀圖

圖4 TSD指紋圖譜共有峰PLS-DA得分結(jié)果圖

圖5 TSD中17個(gè)成分載荷圖

圖6 TSD中17個(gè)成分VIP值圖

2.5.3 主成分分析（PCA） 將指紋圖譜的17個(gè)共有峰峰面積分別導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，進(jìn)行PCA。對(duì)共有峰峰面積Z標(biāo)準(zhǔn)化處理后，計(jì)算主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率及因子荷載矩陣，結(jié)果見(jiàn)表4和圖7。主成分特征值、累積方差貢獻(xiàn)率以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，共提取出4個(gè)主成分，得到主成分的累積方差貢獻(xiàn)率82.782%，故選取前4個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，它代表了17個(gè)成分量的82.782%的信息量，可較好地反映總體成分信息。在4個(gè)主成分中特征值較大的是主成分1，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)54.469%，是信息量較全面的指標(biāo)。

表4 主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖7 公共因子碎石圖

從表5和圖8中可以看出，根據(jù)因子載荷矩陣，在主成分1中，除了17、8、5、16號(hào)色譜峰以外，其余13個(gè)成分的因子載荷非常接近，均是主成分1的重要貢獻(xiàn)成分，說(shuō)明主成分1很好地表達(dá)了TSD多成分物質(zhì)（群）。

2.5.4 綜合評(píng)價(jià)分析 用計(jì)算得到的主成分對(duì)54個(gè)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，將得到的特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，得到主成分表達(dá)式，再以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的特征值占提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重得到主成分綜合模型，根據(jù)主成分綜合模型計(jì)算54個(gè)樣品的主成分得分及綜合得分值?[10]，如表6所示。綜合得分結(jié)果顯示，A組的綜合得分全部位列36位之后，說(shuō)明煎煮2次較為適宜；B、C組由產(chǎn)地批次造成排名差異，說(shuō)明冷凍干燥可較好地保留湯液中的有效成分。

表5 初始因子載荷矩陣

圖8 旋轉(zhuǎn)后主成分空間圖

3 討論

經(jīng)典名方研究的核心內(nèi)容是系統(tǒng)開(kāi)展“藥材-飲片-中間體-物質(zhì)基準(zhǔn)”的質(zhì)量研究與相關(guān)性研究，在煎煮、冷凍干燥過(guò)程中，“標(biāo)準(zhǔn)湯液（中間體）-物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物”之間的化學(xué)成分群動(dòng)態(tài)傳遞特性是經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)能否有效表達(dá)經(jīng)典名方制劑質(zhì)量的關(guān)鍵。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)煎液-物質(zhì)基準(zhǔn)的化學(xué)成分群進(jìn)行指紋信息和多元統(tǒng)計(jì)分析，從質(zhì)量傳遞特評(píng)價(jià)制備工藝的合理性。研究建立了TSD指紋圖譜，對(duì)一煎液（A組）、二煎液（B組）、冷凍干燥樣品（C組）共3組18批藥材的54個(gè)樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，進(jìn)行中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)A組樣品的17個(gè)共有峰峰面積明顯小于B組和C組，B組和C組差別不大；進(jìn)行HCA發(fā)現(xiàn)A組單獨(dú)歸為一類，B、C組歸為一類；采用PLS-DA，找出色譜峰16（藁本內(nèi)酯）、1（沒(méi)食子酸）、13、12（阿魏酸）、7（苦杏仁苷）、15（洋川芎內(nèi)酯A）這6種成分是影響不同批次、組別樣品質(zhì)量的標(biāo)志性差異物質(zhì)，在制備過(guò)程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。并采用PCA，選取代表TSD 82.782%質(zhì)量信息的4個(gè)主成分，根據(jù)主成分綜合模型計(jì)算54個(gè)樣本綜合得分值進(jìn)行排序，A組的綜合得分全部位列36位之后。研究結(jié)果表明，煎煮次數(shù)對(duì)質(zhì)量的影響明顯大于藥材的產(chǎn)地和批次的影響，煎煮2次更能有效提取出化學(xué)成分；冷凍干燥能較好的保留煎液中化學(xué)物質(zhì)群，質(zhì)量與煎液保持基本一致。

表6 主成分得分、綜合得分排序

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)古籍溯源，TSD的服用方法為水煎溫服，一般認(rèn)為是煎煮1次，也有專家認(rèn)為煎煮1次不能完全有效提取出方中有效物質(zhì)；根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》，中藥復(fù)方一般煎煮2次，課題組前期依據(jù)阿魏酸、羥基紅花黃色素A和芍藥苷3個(gè)指標(biāo)成分的含量選擇了煎煮2次；同時(shí)，課題組對(duì)比了常壓干燥、減壓干燥、冷凍干燥等方法，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥對(duì)指標(biāo)成分含量影響較小，現(xiàn)有研究表明冷凍干燥法是最常用的經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物干燥方法?[11-12]。

在指紋圖譜方法學(xué)考察時(shí)，實(shí)驗(yàn)中比較不同生產(chǎn)廠家（Waters、Agilent、Thermo Fisher）色譜柱的分離效果，對(duì)流動(dòng)相、柱溫、體積流量等色譜條件進(jìn)行了反復(fù)考察，根據(jù)色譜峰的數(shù)量、峰形及分離度，最終確定選取Agilent HC-C18色譜柱，體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD檢測(cè)器）對(duì)物質(zhì)基準(zhǔn)供試品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190～400 nm），分析三維圖譜，比較了237、254、280、310 nm波長(zhǎng)下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在280 nm波長(zhǎng)條件下，供試品指紋圖譜出現(xiàn)的峰數(shù)量最多，且響應(yīng)值較高，故選擇280 nm為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)；研究對(duì)比了乙腈、甲醇作為有機(jī)相與不同濃度磷酸水溶液作為水相之間的組合，最終確定乙腈與0.5%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，并對(duì)洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，確定了指紋圖譜的洗脫梯度；在中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)時(shí)，選取了特征明顯、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的17個(gè)色譜峰作為指紋圖譜共有峰，可較好地反映指紋圖譜概貌，其中10個(gè)成分進(jìn)行了對(duì)照品標(biāo)定，其余7個(gè)成分未找到對(duì)照品標(biāo)定其成分，需進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)較多未知成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定。

通過(guò)PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)色譜峰16（藁本內(nèi)酯）、1（沒(méi)食子酸）、13、12（阿魏酸）、7（苦杏仁苷）、15（洋川芎內(nèi)酯A）6種成分是影響54個(gè)樣品質(zhì)量的標(biāo)志性差異物質(zhì)。通過(guò)PCA，對(duì)于代表TSD 54%質(zhì)量信息的主成分1，色譜峰11（芍藥苷）、9（咖啡酸）、10（羥基紅花黃色素A）、1（沒(méi)食子酸）、14、12（阿魏酸）、3（原兒茶酸）、13、6、7（苦杏仁苷）、4、2（5-羥甲基糠醛）、15（洋川芎內(nèi)酯A）均是主要的質(zhì)量貢獻(xiàn)成分。課題組前期基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的五原則對(duì)TSD質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行文獻(xiàn)綜述預(yù)測(cè)分析，提示阿魏酸、芍藥苷、苦杏仁苷、芍藥內(nèi)酯苷、梓醇、沒(méi)食子酸、羥基紅花黃色素A可作為該復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)志物[9]。而《中國(guó)藥典》2015年版中對(duì)TSD中6個(gè)飲片明確規(guī)定了5個(gè)定量檢測(cè)指標(biāo)是羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、阿魏酸、芍藥苷、毛蕊花糖苷?[13]。由于毛蕊花糖苷在280 nm波長(zhǎng)下出峰小，本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行標(biāo)定。

對(duì)于質(zhì)量標(biāo)志物的選擇，從制劑過(guò)程來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)找出6種標(biāo)志性差異性成分。其中阿魏酸、苦杏仁苷是《中國(guó)藥典》檢測(cè)成分，作為質(zhì)量標(biāo)志物的理論依據(jù)充分。沒(méi)食子酸在白芍、川芎、當(dāng)歸等很多藥材中均存在，成分特有性較差，但是其在TSD中的含量較高，可測(cè)性好，且具有抗炎、抗氧化等多種生物活性，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等具有防治作用?[14]，可以考慮作為質(zhì)量標(biāo)志物。藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A是川芎和當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分，從指紋圖譜中看出，凍干樣品中這2種成分的含量均顯著低于二煎樣品，而且洋川芎內(nèi)酯A也是質(zhì)量的主要貢獻(xiàn)成分，現(xiàn)代研究表明其在抗氧化損傷、抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝及抗血小板聚集、舒張血管等方面具有顯著的療效?[15-16]，因此，建議將洋川芎內(nèi)酯A作為質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行含量測(cè)定。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of Taohong Siwu Decoction preparation process based on fingerprint and chemical pattern recognition

JIANG Hua-juan?1, LI Min-min1, HE Yao1, 2??, JIANG Ming-guang1, WANG Sheng-ju1, GUO Xin2, LI Yu2, FU Chao-mei1

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources,College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Guizhou Yibai Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550001, China

Based on the overall fingerprint information of the chemical constituents of traditional Chinese medicine compound, the changes in the chemical constituents of Taohong Siwu Decoction (TSD, 桃紅四物湯) in the preparation process were investigated, and the fluctuation and main contributing constituents affecting the quality were analyzed to provide references for its quality evaluation and control.According to the standard preparation process of the classic prescriptions, three preparation process samples were prepared: one-time decoction (group A), secondary decoction (group B), and freeze-drying (group C) were prepared, and the HPLC fingerprint of 18 batches of medicinal materials were established in three groups and processed by the fingerprint similarity evaluation system of traditional Chinese medicine, the SPSS 20.0 was used for systematic clustering analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), and the SIMCA 14.1 software was used for partial least squares-discrimination analysis (PLS-DA), to analyze the dynamic changes of chemical fingerprint information in three groups of samples.Seventeen chromatographic peaks were selected as the common peaks of the fingerprint. The similarities of 18 batches of samples in each of the three groups were all greater than 0.900; Ten ingredients including gallic acid, 5-hydroxymethyl furfural, protocatechuic acid, amygdalin, caffeic acid, hydroxysafflor yellow A, paeoniflorin, ferulic acid, senkyunolide A, ligustilide were identified. HCA and PLS-DA divided 54 batches of samples into two types, one for group A, and one for group B and C; PLS-DA analysis screened out six different chromatographic peaks. According to the PCA comprehensive model calculation, the comprehensive scoring result was group B > group C > group A. It was reasonable to decoct TSD twice and freeze-drying can retain the components in the decoction. Chromatographic peaks 16 (ligustilide), 1 (gallic acid), 13, 12 (ferulic acid), 7 (amygdalin), and 15 (senkyunolide A) were the marked differential substances affecting the quality of the samples.The HPLC fingerprint and chemical pattern recognition can better identify the iconic components that affect the quality of TSD during the preparation process. This paper provides a reference for the preparation process evaluation and identification of quality indicators of the classic prescriptions.

Taohong Siwu Decoction; classical prescriptions; fingerprints; HPLC; preparation process; chemical pattern recognition; quality markers; quality evaluation; chemical composition group of Chinese medicine prescriptions; freeze-drying; cluster analysis; principal component analysis; partial least squares-discriminant analysis; gallic acid; 5-hydroxymethyl furfural; protocatechuic acid; amygdalin; caffeic acid; hydroxysafflor yellow A; paeoniflorin; ferulic acid; senkyunolide A; ligustilide

R286.02

A

0253 - 2670(2021)04 - 1000 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.012

2020-09-07

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFS0256）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者學(xué)科人才科研提升計(jì)劃（QNXZ2018027）

江華娟，碩士研究生，主要從事新制劑、新劑型和中藥炮制工藝與機(jī)制研究。E-mail: 292956421@qq.com

何 瑤，副教授，主要從事新制劑、新劑型和中藥炮制工藝與機(jī)制研究。E-mail: 20660306@qq.com

傅超美，教授，主要從事新制劑、新劑型和中藥炮制工藝與機(jī)制研究。E-mail: chaomeifu@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]