馮 瓊，林 虹，蔡興俊

(海南省人民醫(yī)院新生兒科，?？?570311)

新生兒肺炎是新生兒常見病，可于宮內(nèi)、分娩過程中或出生后發(fā)病，主要由不同病原體(如細(xì)菌、病毒、支原體、真菌等)感染引起，其是引起新生兒死亡的主要原因，有報(bào)道圍生期新生兒肺炎病死率達(dá)10%～20%[1]，對(duì)新生兒生存質(zhì)量、生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響。因此，早期診斷新生兒肺炎、及時(shí)采取相應(yīng)積極措施進(jìn)行干預(yù)是提高新生兒存活率及生存質(zhì)量的關(guān)鍵。臨床上通常經(jīng)驗(yàn)性使用廣譜抗生素對(duì)新生兒肺炎進(jìn)行治療，以至于不規(guī)范使用抗菌藥物導(dǎo)致患兒產(chǎn)生大量耐藥菌株，對(duì)后續(xù)治療效果帶來嚴(yán)重影響[2-3]。新生兒肺炎早期臨床表現(xiàn)不明顯，病原學(xué)檢查往往比較滯后，缺乏快速、靈敏、特異的診斷指標(biāo)[4]。以往研究常以白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等評(píng)價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)程度，但此類指標(biāo)靈敏度、特異度較低[5]。因此，尋求有效、準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)診斷新生兒肺炎意義重大。微小RNA(miRNA/miR)是一類高度保守、內(nèi)源性、非編碼核苷酸，與機(jī)體免疫功能異常存在密切關(guān)系[6]。邵慧芝等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童比較，重癥肺炎患兒外周血miR-223水平明顯升高，可作為重癥肺炎早期診斷標(biāo)志物之一。張薇等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，支原體肺炎患兒外周血miR-155表達(dá)水平明顯升高，推測(cè)miR-155參與支原體肺炎的發(fā)生、發(fā)展。然而，有關(guān)miR-223、miR-155在新生兒肺炎中表達(dá)情況的研究卻鮮有報(bào)道，故本研究同時(shí)探討生兒肺炎患兒血清miR-223、miR-155表達(dá)情況，以期為診斷新生兒肺炎提供一定參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月至2017年9月本院新生兒科收治的121例新生兒肺炎患兒作為新生兒肺炎組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合臨床新生兒肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)足月產(chǎn)；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他感染性疾??；(2)一般情況較差；(3)臨床資料不完整。另選取同期于本院正常分娩的120例健康新生兒作為對(duì)照組。所有新生兒均為單胎。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本采集均取得患者及家屬知情同意并簽字。

1.2 方法

1.2.1主要試劑與儀器

TRIzol試劑(貨號(hào)MN562J2)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)J6547M)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)N5643MJ)購自美國Sigma公司、SYBR Premix ExTaq試劑盒(貨號(hào)N5643MJ)PrimeScript RT reagent試劑盒(貨號(hào)ND6527J)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào)726-NDY)均購自北京中衫金橋公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(型號(hào)7500)、分光光度計(jì)(型號(hào)UV-3672)購自美國Sigma公司；全自動(dòng)熒光免疫分析儀(型號(hào)VI-DAS30)購自法國梅里埃公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)COBAS 601)購自德國羅氏公司。

1.2.2標(biāo)本采集及保存

根據(jù)所有患兒病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果及病情，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)抗菌治療，分別于治療前、后抽取靜脈血3 mL。對(duì)照組采集臍帶血3 mL，離心10 min(2 000 r/min)，分離得血清，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，待測(cè)。

1.2.3觀察指標(biāo)

采用全自動(dòng)熒光免疫分析儀及配套試劑測(cè)定受試者治療前、后血清中降鈣素原(PCT)水平，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定血清中IL-6水平，以上操作嚴(yán)格按照儀器、試劑及試劑盒說明書進(jìn)行。觀察治療前、后水平變化。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)血清miR-223、miR-155相對(duì)表達(dá)水平

采用Trizol試劑提取兩組新生兒治療前、后血清總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。以RNA為模板，按照PrimeScript RT reagent試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以cDNA為模板，參照SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20.0 μL：2×UltraSYBR mixture 10.0 μL，cDNA模板(25 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由大連寶生生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，miR-223、miR-155均以U6作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算兩組新生兒血清中miR-223、miR-155相對(duì)表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料

兩組性別、胎齡、年齡、出生方式比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組miR-223、miR-155、PCT、IL-6相對(duì)表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，新生兒肺炎組治療前miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平明顯升高(P<0.05)；兩組治療后miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與治療前比較，新生兒肺炎組治療后miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 兩組miR-223、miR-155、PCT、IL-6相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3 兩組miR-223、miR-155及PCT、IL-6相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，兩組miR-223與miR-155、PCT、IL-6表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，miR-155與miR-223、PCT、IL-6表達(dá)亦呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 兩組miR-223、miR-155及PCT、IL-6相關(guān)性分析

2.4 miR-223、miR-155、PCT、IL-6對(duì)新生兒肺炎診斷的ROC曲線

以血清miR-223、miR-155、PCT、IL-6水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示血清miR-223、miR-155、PCT、IL-6水平診斷新生兒肺炎的AUC分別為0.886(0.833，0.939)、0.825(0.750，0.901)、0.812(0.737，0.891)、0.831(0.839，0.903)，截?cái)嘀捣謩e11.36、4.32和8.13 ng/mL、35.69 pg/mL，靈敏度分別為85.9%、81.5%、82.7%、83.6%，特異度分別為82.7%、78.7%、77.3%、82.1%；四者聯(lián)合診斷的AUC為0.956(0.961，0.953)，靈敏度為96.2%，特異度為93.8%，見圖1。

圖1 miR-223、miR-155、PCT、IL-6對(duì)新生兒肺炎診斷的ROC曲線

3 討 論

新生兒肺炎是新生兒時(shí)期常見病、多發(fā)病，臨床表現(xiàn)往往不典型，常與其他疾病并發(fā)，漏診、誤診率較高，且由于新生兒特殊的生理、免疫狀態(tài)，使得病情變化較快，極易出現(xiàn)窒息、呼吸衰竭，嚴(yán)重者出現(xiàn)循環(huán)衰竭甚至死亡[10]。因此，預(yù)防新生兒肺炎的發(fā)生，及早做出準(zhǔn)確診斷并采取積極措施進(jìn)行干預(yù)是研究的熱點(diǎn)。

成熟miRNA是長(zhǎng)度為20～23個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑，通常會(huì)降低mRNA穩(wěn)定性。miRNA靶向主要是通過miRNA 5′端(“種子”區(qū)域)與mRNA編碼區(qū)和非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)的位點(diǎn)之間的特定堿基配對(duì)相互作用實(shí)現(xiàn)的。其在調(diào)節(jié)生物學(xué)過程(如免疫細(xì)胞譜系的發(fā)生、分化和成熟及維持免疫穩(wěn)態(tài)、正常功能)中起著重要作用[11]。但有研究報(bào)道，miRNA家族中miR-223[12]、miR-155[13]在肺炎繼發(fā)膿毒癥患者中、支原體感染肺炎模型小鼠中有較高的臨床診斷價(jià)值。因此推測(cè)miR-223、miR-155異常表達(dá)與新生兒肺炎發(fā)生有關(guān)，且有一定的診斷價(jià)值。本研究探討新生兒肺炎患兒血清miR-223、miR-155表達(dá)情況，以期為尋找準(zhǔn)確、有效的新生兒肺炎早期診斷指標(biāo)提供一定參考。顏保松等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核組患者外周血中miR-223水平明顯高于健康對(duì)照組，且對(duì)肺結(jié)核具有較高診斷價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，新生兒肺炎組患兒治療前血清中miR-223水平明顯高于對(duì)照組，治療后血清miR-223恢復(fù)至正常水平，提示miR-223可能與新生兒肺炎發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。周好好等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組小鼠肺組織中miR-155水平明顯升高，推測(cè)miR-155可能參與了哮喘發(fā)病過程。本研究顯示，新生兒肺炎組患兒治療前血清中miR-155水平明顯高于對(duì)照組，治療后血清中miR-155水平同樣恢復(fù)至正常水平，提示miR-155可能參與了新生兒肺炎發(fā)病過程。

以往有學(xué)者以PCT、IL-6等感染性標(biāo)志物在新生兒肺炎患兒中的表達(dá)情況對(duì)病情做出診斷[16]。但有研究顯示，PCT、IL-6等在新生兒肺炎患兒血清中高表達(dá)，與新生兒肺炎發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，但I(xiàn)L-6靈敏度、特異度較低[17]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，新生兒肺炎組患兒治療前血清中PCT、IL-6水平明顯升高，治療后，血清中PCT、IL-6水平恢復(fù)正常水平；與治療前比較，新生兒肺炎組患兒治療后血清中PCT、IL-6水平明顯降低，與以往研究趨勢(shì)一致，這提示PCT、IL-6與新生兒肺炎發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。正常情況下，血液循環(huán)中PCT、IL-6水平較低，炎性反應(yīng)中PCT、IL-6水平升高。研究顯示，PCT、IL-6水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可以反映炎癥損傷的嚴(yán)重程度[18]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，血清miR-223與miR-155、PCT、IL-6表達(dá)呈正相關(guān)，miR-155與血清miR-223、PCT、IL-6表達(dá)呈正相關(guān)。提示血清miR-223、miR-155與PCT、IL-6一樣具有早期評(píng)估新生兒肺炎的能力。

綜上所述，miR-223、miR-155異常高表達(dá)可能與新生兒肺炎發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，具有評(píng)估新生兒肺炎的能力，且miR-223、miR-155、PCT及IL-6聯(lián)合檢測(cè)明顯提高了對(duì)新生兒肺炎的診斷靈敏度及特異度，可為臨床對(duì)新生兒肺炎的診斷提供一定參考。然而本研究并未對(duì)miR-223、miR-155、PCT及IL-6在新生兒肺炎患兒中的具體作用機(jī)制進(jìn)行闡述，因此，后期應(yīng)進(jìn)行大樣本量的研究并對(duì)具體機(jī)制進(jìn)行探討。