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        結(jié)核分枝桿菌對miR-21和TLR-4/NF-κB信號通路的影響研究*

        2021-02-25 05:25:16林瑤瑤劉海林鐘有清
        重慶醫(yī)學(xué) 2021年3期
        關(guān)鍵詞:活化細(xì)胞因子試劑盒

        麥 葉,林瑤瑤,劉海林,鐘有清

        (1.海南省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,???570203;2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,???570102)

        肺結(jié)核是1種主要由結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染引起的慢性消耗性傳染病,在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū),其近年來發(fā)病率不斷升高,嚴(yán)重威脅人類健康[1]。巨噬細(xì)胞可吞噬入侵的Mtb,并呈遞抗原,使機(jī)體獲得特異的抗結(jié)核免疫力,但Mtb是典型的細(xì)胞內(nèi)寄生菌,可通過多種機(jī)制逃避巨噬細(xì)胞的抗微生物作用,在巨噬細(xì)胞等宿主免疫細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖。研究顯示,機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)抑制Mtb生長,其中90%的病原體潛伏在感染病灶中,進(jìn)入休眠狀態(tài)。一旦免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常,休眠狀態(tài)的Mtb即進(jìn)入復(fù)蘇狀態(tài),肺結(jié)核復(fù)發(fā)[2]。在肺結(jié)核致病及復(fù)發(fā)過程中,Mtb與巨噬細(xì)胞的相互影響發(fā)揮重要作用[3]。因此,研究其作用機(jī)制對于探討肺結(jié)核的臨床治療具有重要意義。Toll樣受體(TLR)是人呼吸道天然免疫中的關(guān)鍵受體,TLR4廣泛表達(dá)于氣道上皮,在呼吸道黏膜免疫中有重要作用,可能參與肺結(jié)核發(fā)生、發(fā)展[4]。有研究報(bào)道,微小RNA(miRNA/miR)可調(diào)節(jié)TLR信號通路[5]。本研究將Mtb感染RAW264.7和THP-1細(xì)胞后,對miR-21表達(dá)和TLR-4/核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響進(jìn)行分析,旨在研究Mtb與巨噬細(xì)胞的相互作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1菌株與細(xì)胞株

        RAW264.7和THP-1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫;強(qiáng)毒Mtb H37Rv及弱毒Mtb BCG(牛型結(jié)核桿菌減毒株,卡介苗)購自北京生物制品研究所。

        1.1.2主要試劑與材料

        DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)液、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;胎牛血清購自美國Hyclone公司;Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自美國R&D公司;流式細(xì)胞儀、異硫氰酸熒光素(FITC)-膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司;蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物公司;本研究所使用ELISA試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司;miR-21與內(nèi)參基因U6基因及TLR4、NF-κB和內(nèi)參基因β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

        1.2 方法

        1.2.1細(xì)胞及Mtb培養(yǎng)

        RAW264.7細(xì)胞:復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)(5% CO2,37 ℃飽和濕度),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),0.1%胰蛋白酶消化懸浮,鋪于12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)(5×105個(gè)/mL)。THP-1細(xì)胞:復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)(5% CO2,37 ℃飽和濕度),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),調(diào)整濃度為5×105個(gè)/mL,利用佛波醇酯類多克隆刺激(PMA)誘導(dǎo)24 h,待細(xì)胞分化貼壁后,在12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。Mtb:將羅氏培養(yǎng)基上的H37Rv菌落分別刮下,接種于7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d,液體可見明顯渾濁,且有白色顆粒,菌膜掛壁;BCG菌株接種于7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d,可見液體稍許渾濁,且有黃色顆粒,菌膜掛壁。

        1.2.2Mtb感染RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞模型建立

        細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL,Mtb濃度5×106個(gè)/mL,使Mtb感染12孔板中貼壁良好的細(xì)胞,5% CO2,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h(培養(yǎng)基中無血清和雙抗),繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分組:RAW264.7細(xì)胞分為對照組、H37Rv感染組和BCG感染組;THP-1細(xì)胞分為對照組、H37Rv感染組和BCG感染組。

        1.2.3細(xì)胞凋亡檢測

        胰蛋白酶消化感染后細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸,洗滌后,利用平板計(jì)數(shù),使細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL,加入Annexin V-FITC及PI溶液,避光孵育(25 ℃,15 min),加入Buffer,利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

        1.2.4qRT-PCR檢測miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)

        利用Trizol法提取總RNA,檢測合格后,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA,利用qRT-PCR試劑盒檢測miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)。反應(yīng)體系為20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件如下:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后升溫至95 ℃ 15 s,降至60 ℃ 15 s,95 ℃ 20 min。每個(gè)標(biāo)本均重復(fù)檢測3次,結(jié)果取平均值,相對表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算,見表1。

        表1 qRT-PCR引物序列

        1.2.5細(xì)胞因子檢測

        利用ELISA法檢測感染12 h后[6]細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)水平。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié) 果

        2.1 RAW264.7和THP-1細(xì)胞形態(tài)變化

        RAW264.7正常細(xì)胞折光度好,邊緣清晰,感染后細(xì)胞發(fā)生皺縮,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有小泡,邊界不清晰;正常THP-1細(xì)胞大小均一,細(xì)胞透亮,形態(tài)規(guī)則,包膜完整,PMA誘導(dǎo)后貼壁生長,部分細(xì)胞伸出偽足,見圖1。

        A:正常RAW264.7細(xì)胞;B:Mtb感染后RAW264.7細(xì)胞;C:正常THP-1細(xì)胞;D:PMA誘導(dǎo)后THP-1細(xì)胞。

        2.2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

        在THP-1細(xì)胞中,H37Rv感染組及BCG感染組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高,且BCG感染組細(xì)胞凋亡率較H37Rv感染組明顯升高(P<0.05)。在RAW264.7細(xì)胞中,H37Rv感染組及BCG感染組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高,且BCG感染組細(xì)胞凋亡率較H37Rv感染組明顯降低(P<0.05),見圖2。

        A:RAW264.7細(xì)胞對照組;B:RAW264.7細(xì)胞BCG感染組;C:RAW264.7細(xì)胞H37Rv感染組;D:THP-1細(xì)胞對照組;E:THP-1細(xì)胞BCG感染組;F:THP-1細(xì)胞H37Rv感染組;G:細(xì)胞凋亡比例;a:P<0.05,與對照組比較;b:P<0.05,與H37RV感染組比較。

        2.3 miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)情況

        與RAW264.7細(xì)胞對照組比較,BCG感染組及H37Rv感染組miR-21低表達(dá),TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá)(P<0.05),且BCG感染組TLR4、NF-κB mRNA較H37RV感染組表達(dá)水平更高(P<0.05)。與THP-1細(xì)胞對照組比較,BCG感染組及H37Rv感染組miR-21低表達(dá),TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá)(P<0.05),且BCG感染組TLR4、NF-κB mRNA較H37Rv感染組表達(dá)水平更高(P<0.05),見圖3。

        A:RAW264.7細(xì)胞mRNA表達(dá)情況;B:THP-1細(xì)胞mRNA表達(dá)情況;a:P<0.05,與對照組比較;b:P<0.05,與H37Rv感染組比較。

        2.4 細(xì)胞因子檢測結(jié)果

        與RAW264.7細(xì)胞對照組比較,BCG感染組及H37Rv感染組TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05),且BCG感染組TNF-α、IL-6表達(dá)水平較H37Rv感染組明顯降低,IL-10明顯升高(P<0.05)。與THP-1細(xì)胞對照組比較,BCG感染組及H37Rv感染組TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),且BCG感染組TNF-α、IL-6表達(dá)水平較H37RV感染組明顯升高,IL-10明顯降低(P<0.05),見圖4。

        A:細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平;B:細(xì)胞IL-6表達(dá)水平;圖C:細(xì)胞IL-10表達(dá)水平;*:P<0.05,與對照組比較;#:P<0.05,與H37Rv感染組比較。

        3 討 論

        作為一種人畜共患的消耗性疾病,肺結(jié)核嚴(yán)重危害我國民眾的生命健康。近年來,由于部分耐藥Mtb的出現(xiàn),結(jié)核病的防治工作面臨新的威脅。目前,多項(xiàng)研究結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞是宿主控制Mtb感染散播的主要防御屏障,可吞噬Mtb,進(jìn)行消化清除[7-8]。另外,巨噬細(xì)胞在Mtb免疫逃逸中也發(fā)揮重要作用,導(dǎo)致結(jié)核病的慢性癥狀,使其具有潛伏性和傳染性。靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞被抗原刺激活化,產(chǎn)生多種細(xì)胞因子繼續(xù)刺激、活化巨噬細(xì)胞,吞噬Mtb,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死,引起巨噬細(xì)胞崩解,將Mtb釋放,重新被其他巨噬細(xì)胞吞噬,使Mtb得以在細(xì)胞間傳播。感染后的巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡,分解為有囊膜包裹的吞噬小體,吞噬小體可降低Mtb活性,促進(jìn)機(jī)體先天性免疫反應(yīng)。RAW264.7細(xì)胞及可經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞的THP-1細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于Mtb與巨噬細(xì)胞相互作用的研究中[9]。本研究通過構(gòu)建Mtb感染巨噬細(xì)胞模型,檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,RAW264.7、THP-1細(xì)胞H37Rv感染組及BCG感染組凋亡率均明顯升高,與H37Rv感染組比較,THP-1細(xì)胞BCG感染組凋亡率明顯升高,RAW264.7細(xì)胞明顯降低,提示Mtb感染巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)其凋亡,與呂翎娜等[9]研究結(jié)果一致。

        有研究顯示,TLRs信號在機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答及固有性免疫應(yīng)答中具有重要作用,與多種疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[10]。TLR4主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞,可識別病原相關(guān)分子,通過胞內(nèi)信號傳遞,誘導(dǎo)免疫炎性因子,擴(kuò)大非特異性防御作用。TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MyD88依賴性和非依賴型兩條,TLR4活化后,可與MyD88羧基端TLR受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合,通過一系列磷酸化反應(yīng),活化NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK),NIK可使NF-κB抑制蛋白泛素化降解,從而激活NF-κB,活化后的NF-κB由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),啟動(dòng)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、翻譯,最終促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-10的分泌。有研究顯示,細(xì)菌脂多糖可活化單核巨噬細(xì)胞表面TLR4,繼而激活NF-κB,誘導(dǎo)炎性因子IL-6、TNF-α釋放,參與固有免疫應(yīng)答[11]。Mtb細(xì)胞壁含有大量的分枝菌酸、脂類和多糖,可通過識別、激活巨噬細(xì)胞表面的多種受體,如TLR4等,啟動(dòng)相應(yīng)的免疫防御反應(yīng)。大量研究表明,miR-21在呼吸道相關(guān)疾病中異常表達(dá)[12-13]。生物信息學(xué)顯示,miR-21可能通過靶向調(diào)節(jié)TLR-4參與機(jī)體免疫反應(yīng)。許瑞等[14]研究報(bào)道,高表達(dá)miR-21可增加下調(diào)TLR4基因的活化能力,引起通路下游NF-κB及IL-6活性降低。同時(shí),也有研究證明,IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子可通過細(xì)胞外正反饋調(diào)節(jié),進(jìn)一步導(dǎo)致NF-κB活化[15]。本研究結(jié)果顯示,感染后RAW264.7及THP-1細(xì)胞miR-21低表達(dá),TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá),且BCG感染組較H37Rv感染組miR-21低表達(dá),TLR4、NF-κB mRNA高表達(dá),提示Mtb感染可能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),感染12 h后的RAW264.7及THP-1細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平均明顯升高;在RAW264.7細(xì)胞中,BCG感染組較H37Rv組TNF-α、IL-6表達(dá)水平明顯降低,IL-10明顯升高;在THP-1細(xì)胞中,BCG感染組較H37Rv組TNF-α表達(dá)水平明顯升高,IL-6、IL-10表達(dá)水平明顯降低,提示Mtb感染可能影響巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌。

        綜上所述,Mtb感染促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡,抑制機(jī)體miR-21表達(dá),從而激活TLR-4/NF-κB信號通路。本研究選擇不同毒性的Mtb感染兩種巨噬細(xì)胞,結(jié)果表明,兩種Mtb對信號通路及細(xì)胞的因子的影響有一定差異,具體原因及機(jī)制將在后續(xù)研究中展示。

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