李南錕， 杜 帥， 張培培， 劉 莉， 羅 娟

(1.生態(tài)環(huán)境部環(huán)境工程評估中心， 北京 100012； 2.北京國電富通科技發(fā)展有限責任公司， 北京 100070； 3.生態(tài)環(huán)境部環(huán)境規(guī)劃院， 北京 100012； 4.清華大學， 北京 100091)

厭氧氨氧化過程是在厭氧氨氧化菌作用下將氨氮和亞硝氮直接轉化為氮氣釋放并產生少量硝氮的過程[1]。厭氧氨氧化微生物反應過程中，無需外加碳源，無需曝氣，而且由于產泥量極低，脫氮效率較高等優(yōu)勢被稱為本世紀最具有前景的脫氮工藝之一，并逐步開始應用于各類復雜的污水處理中[2]。其中，高鹽廢水的脫氮處理就是其中備受關注的方向[3]。廢水中總溶解固體(TDS)和有機物的質量分數(shù)大于3.5%或總含鹽量(以NaCl的質量分數(shù)計)大于等于1%即為高鹽廢水[4]。我國水資源時空分布嚴重失衡，淡水資源緊缺，由于人口眾多，導致人均淡水資源量較低，僅為世界平均水平的1/4，因此，從這個角度看，中國已是世界上最缺水的國家之一[5]。為了應對我國的淡水資源危機，許多沿海城市使用海水代替淡水以滿足生活和生產活動的需要，比如用作沖廁水、中水、消防用水等，此外，煉油、造紙、化肥、焦化以及食品等工業(yè)用水和農業(yè)產生廢水具有水量大，含鹽高、碳氮比低、部分有毒性等特點[6]。對于高鹽廢水的處理，傳統(tǒng)的微生物脫氮以及物理化學方法具有成本高，效率低，難度大等劣勢[7]。

大部分厭氧氨氧化菌株提取自海水，因此對高氨氮、高鹽度廢水的處理具有天然的優(yōu)勢[8]。而且厭氧氨氧化過程完全自養(yǎng)，無需額外曝氣，無二次污染，脫氮效率高，近年來逐步應用于工業(yè)廢水，農業(yè)廢水和垃圾滲濾液等高鹽度廢水的脫氮應用中，成為當前研究的熱點[9]。以往學者研究顯示，鹽度30 g·L-1NaCl為鹽度的分水嶺，鹽度低于此值時，氮元素去除率均能維持在80%以上；高于30 g·L-1時，脫氮效率急劇下降[10-12]。此外，在30 g·L-1的NaCl高鹽廢水下同時馴化Scalindua和Kuenenia的兩種厭氧氨氧化菌種實驗中，Kartal[13]等發(fā)現(xiàn)，Kuenenia在馴化后最終成為脫氮系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌種。綜上可知，部分厭氧氨氧化菌種在高鹽度的廢水中仍舊能保持較高的活性，對高鹽度、高氨氮廢水有突出的優(yōu)勢，因此，對厭氧氨氧化系統(tǒng)在高鹽環(huán)境下脫氮性能及微生物多樣性和群落結構的深度分析具有較大意義。

本研究中，在穩(wěn)定運行半年的顆?；瘏捬醢毖趸勰嘞到y(tǒng)中，通過依次加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl進行鹽度對系統(tǒng)影響實驗。基于高通量測序技術，研究了高鹽度對厭氧氨氧化系統(tǒng)的脫氮性能及微生物群落的沖擊和影響，為后續(xù)高鹽低碳廢水脫氮的生物處理提供了新的見解。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

采用水流自下而上天然厭氧的UASB反應器，有機玻璃材質，內徑5 cm，高80 cm，有效容積1.5 L，較大的高徑比有利于厭氧氨氧化顆粒的進一步形成和強化。具體見圖1。

1.進水桶； 2.NaOH溶液； 3.三相分離裝置； 4.出水堰； 5.取樣口； 6.出水桶。圖1 反應器示意圖

1.2 接種污泥與實驗用水

實驗進水采用人工配水，以NaCl為主要的鹽度來源，以NaNO2和NH4Cl為氮源，其他組分包括NaHCO31000 mg·L-1，MgSO4·7H2O 100 mg·L-1，KH2PO430 mg·L-1，CaCl27.8 mg·L-1。微量元素1 mL·L-1微量元素成分：EDTA 5000 mg·L-1，MnCl2·4H2O 990 mg·L-1，CuSO4·5H2O 250 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 430 mg·L-1，CoCl2·6H2O 240 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 220 mg·L-1，NiCl2·6H2O 190 mg·L-1，H3BO414 mg·L-1[14-15]。

1.3 測試項目與方法

在系統(tǒng)進水中分別加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl，每個濃度梯度運行穩(wěn)定后，在反應器取樣口提取3個平行微生物樣品，離心后冷凍儲存在-20℃冰箱中，3個鹽度濃度梯度分別標記為A，B，C3組，每組3個平行樣品以A組為例，標記為A1，A2，A3，以此類推。取樣完成后，所有樣本做好標記，委托美吉生物公司測序平臺對所有樣品進行微生物測序統(tǒng)計。本批樣品均采用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)作為引物,對V3～V4高變區(qū)域16S rRNA序列進行擴增分析.MiSeq文庫構建和測序數(shù)據存于美吉生物測序公司i-sanger云平臺。

2 結果與討論

2.1 實驗進程

2.2 鹽度對系統(tǒng)氨氮去除率的影響分析

圖2 不同鹽濃度下厭氧氨氧化系統(tǒng)對氨氮的轉化效能

2.3 鹽度對系統(tǒng)亞硝氮去除率的影響分析

當然，針對氨氮和亞硝態(tài)氮去除率偏差過大的情況，一部分原因是厭氧氨氧化運行系統(tǒng)進水中存在一定的溶解氧，因此反應系統(tǒng)內部并不是完全的厭氧環(huán)境，所以，系統(tǒng)內部存在可以將氨氮氧化為亞硝態(tài)氮的氨氧化細菌，將部分氨氮轉化為亞硝態(tài)氮，造成一定的亞硝態(tài)氮積累，使得氨氮去除率升高，亞硝態(tài)氮去除率降低，而造成了氨氮和亞硝態(tài)氮去除率偏差大的情況。

2.4 氨氮與亞硝氮轉化量與硝氮生成量的分析

Strous[21]等通過大量的實驗數(shù)據和計算，確立了厭氧氨氧化反應的氮素之間關系如下所示：

圖3 不同鹽濃度下厭氧氨氧化系統(tǒng)對亞硝氮的轉化效能

因此，按理論值計算，亞硝氮和氨氮轉化率之比為1.32，硝氮生成量與亞硝氮轉化量之比為0.26。

圖4 氨氮、亞硝氮轉化量與硝氮生成量關系比較

2.5 系統(tǒng)微生物多樣性及豐富度分析

微生物多樣性和豐富度統(tǒng)計表1中可見，各階段的送檢樣品覆蓋度均大于0.99，說明測序結果具有參考價值。Ace指數(shù)和Chao指數(shù)[24]均是用來估算樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，兩者采用的算法不同，但指數(shù)數(shù)值都與物種的豐富度成正比。由表1可知，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)相互印證，說明隨著進水鹽度的增加，厭氧氨氧化系統(tǒng)中物種的種類和豐富度明顯下降，充分體現(xiàn)出部分菌種不能在高鹽度的水環(huán)境下生存。

表1 微生物群落豐度和多樣性

Shannon指數(shù)[25]和Simpson指數(shù)[26]分別為微生物的多樣性的正比指數(shù)與反比指數(shù)。本研究中Shannon指數(shù)值隨鹽度上升明顯下降，而Simpson指數(shù)值卻為上升趨勢，二者均是對上述物種豐富度減少原因的印證，說明鹽度對部分微生物有明顯的抑制作用導致系統(tǒng)中微生物物種多樣性減少。

2.6 微生物門分類水平分析

系統(tǒng)中微生物的種類和相對豐度決定了系統(tǒng)的功能，因此，不同分類水平下對樣本中微生物種類和豐度的分析，對系統(tǒng)功能的解讀具有重要的意義[27]。如圖5門水平群落分布圖所示，在厭氧氨氧化UASB反應器分階段所取微生物樣品中，浮霉菌門(Planctomycetes)是相對豐富度最大的菌門，然后依次為綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中，經研究確定的厭氧氨氧化菌種所在的浮霉菌門(Planctomycetes)在鹽度不斷增加的馴化實驗中，豐度不斷增加，由最初 28.23%增長到 45.22%，物種相對豐度占比不斷提升，說明此類菌種可以在高鹽度的環(huán)境下依舊保持較高的活性和脫氮效率。此外，通過傳統(tǒng)的硝化反硝化方式脫氮的菌屬所在的變形菌門(Proteobacteria)[28～29]和厭氧氨氧化系統(tǒng)中對污泥顆粒化和反應器中生物膜形成的重要作用的綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度呈現(xiàn)下降趨勢[30]。而擬桿菌門(Bacteroidetes)隨著鹽度濃度不斷的提升，物種相對豐度有階梯式的提高，可能此菌門中存在某些菌屬可以極好的適應高鹽度的水環(huán)境，在高鹽厭氧系統(tǒng)的脫氮中扮演著重要的角色。

(A1～A3，B1～B3,C1～C3分別為添加10 g·L-1,20 g·L-1,30 g·L-1的NaCl鹽度環(huán)境下采集的3組平行微生物樣品)圖5 系統(tǒng)門水平群落分布圖

2.7 微生物屬分類水平分析

為了深入研究鹽度對系統(tǒng)中微生物群落的影響，繪制了屬水平群落分布圖以及Wilcoxon rank-sum檢測條形圖，進一步對比隨著鹽度的增加微生物物種和相對豐度的變化情況。

從圖6中可知，Candidatus_Kuenenia相對豐度達到31.6%，是厭氧氨氧化系統(tǒng)中占比最高的菌屬，對系統(tǒng)的脫氮性能有決定性作用。由圖可知，隨著進水鹽度濃度的變化，Candidatus_Kuenenia的物種相對豐度從31.6%下降到27.1%。相較于Jiang[31]等在厭氧氨氧化MVR系統(tǒng)的實驗中得出，

(A1～A3，B1～B3,C1～C3分別為添加10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl鹽度環(huán)境下采集的3組平行微生物樣品)圖6 系統(tǒng)屬水平群落分布圖

當系統(tǒng)鹽度從0 g·L-1提升到30 g·L-1時Candidatus_Kuenenia菌屬從相對豐度占比從72.7%下降到13.5%的結果，可知厭氧氨氧化顆粒污泥系統(tǒng)對高鹽水環(huán)境有更好的抗沖擊能力。g_norank_f_Anaerolineaceae菌屬是厭氧氨氧化系統(tǒng)中綠彎菌門(Chloroflexi)最常見的菌屬，其通常存在于厭氧環(huán)境中，與氫營養(yǎng)型產甲烷菌協(xié)同降解系統(tǒng)中碳水化合物和其他細胞組織[32]。

Denitratisoma菌屬屬于變形菌門(Proteobacteria)一直保持著較高的豐度，是厭氧氨氧化系統(tǒng)脫氮性能的重要輔助成分。 SM1A02菌屬于浮霉菌門(Planctomycetes)，在ANAMMOX反應器中普遍存在且相對豐度占比較大[33-34]。有文獻研究稱，SM1A02屬是活性污泥中的功能性細菌屬，被稱作潛在的新型厭氧氨氧化菌屬[35]。此外，norank_c_Chitinivibrionia在鹽度達到20 g·L-1時便從該系統(tǒng)中消失。在鹽度提升到20 g·L-1時Arenimonas菌屬的相對豐富度提升到最高，但是當鹽度提升到30 g·L-1，Arenimonas菌屬相對豐度急劇減少幾近消失，不同的是Chryseolinea菌屬隨鹽度升高，豐度不斷提高。

圖7為屬水平Wilcoxon rank-sum檢測條形圖，圖中可以清楚地看出各樣本不同分組組中的平均相對豐度百分比的差值，最右邊為P值，P值越小，表示物種的變化越大。圖中可以清晰地看出norank_c_Chitinivibrionia和Arenimonas隨鹽度的提升，豐度出現(xiàn)明顯下降，這兩種菌屬均為專性厭氧，異養(yǎng)菌屬，其中Arenimonas為異養(yǎng)反硝化菌屬[36-38]。Chryseolinea豐度隨鹽度的提升而不斷升高，以往文獻中提到此菌屬是影響污泥沉降性能的關鍵菌屬，極易在厭氧環(huán)境下生存，有利于厭氧氨氧化顆粒的生成[39]。

(A,B,C分別為添加10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl鹽度環(huán)境下采集微生物樣品)圖7 屬水平Wilcoxon rank-sum檢測條形圖

3 結論

(1)通過逐步加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl對顆粒厭氧氨氧化污泥系統(tǒng)進行鹽度影響探究。結果發(fā)現(xiàn):鹽度從0 g·L-1增加到30 g·L-1過程中對氨氮去除率幾乎沒有影響，對亞硝氮去除率影響較大，亞硝氮去除率從95%降到65%。

(2)16SrRNA基因高通量測序分析研究結果顯示從門水平分析，隨著鹽度的增加，浮霉菌門(Planctomycetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)豐度增加，而變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi) 豐度減少。

(3)Candidatus_Kuenenia是厭氧氨氧化系統(tǒng)中占比最高的菌屬，豐富度最高達到31.6%，是決定系統(tǒng)脫氮性能的主導菌屬，鹽度達到30 g·L-1時，其豐度下降至27.1%。潛在的Anammox菌屬-SM1A02菌屬隨著鹽度的提升，豐度占比有明顯的提升，此外，norank_c_Chitinivibrionia，Arenimonas,Chryseolinea是受鹽度影響相對豐度變化最大的3種菌屬。