孔祥平， 奚永蘭， 杜 靜， 王宇欣， 黃 艷， 葉小梅

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所， 江蘇 南京 210014； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源華東科學(xué)觀測實驗站， 江蘇 南京 210014； 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所， 四川 成都 610041)

我國農(nóng)業(yè)秸稈年產(chǎn)量高達(dá)10.4億噸，且秸稈產(chǎn)量呈現(xiàn)出不斷增長的趨勢[1]。通過厭氧發(fā)酵制備生物甲烷是秸稈資源化利用的重要途徑之一，該技術(shù)可規(guī)?；幚磙r(nóng)業(yè)有機(jī)廢物，增加清潔燃?xì)夤┙o，是打贏污染防治攻堅戰(zhàn)、實現(xiàn)碳減排及實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的重要途徑[2-3]。然而，復(fù)雜的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)使得秸稈降解過程成為厭氧發(fā)酵制備甲烷的限速步驟，進(jìn)而導(dǎo)致厭氧發(fā)酵周期長、容積產(chǎn)氣率和甲烷產(chǎn)量低等問題，阻礙了秸稈發(fā)酵制備生物甲烷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。國內(nèi)外學(xué)者對秸稈厭氧消化生產(chǎn)沼氣的預(yù)處理方法進(jìn)行了廣泛的研究，開發(fā)了多種基于物理、化學(xué)、生物或組合的預(yù)處理技術(shù)，有效促進(jìn)了秸稈厭氧消化過程的產(chǎn)氣能力，但由于較高的預(yù)處理成本限制了這些技術(shù)在實際生產(chǎn)過程的應(yīng)用。因此，如何以高效低成本的方式突破秸稈的抗降解結(jié)構(gòu)屏障，提高秸稈的生物轉(zhuǎn)化效率是厭氧發(fā)酵制備生物甲烷領(lǐng)域的研究熱點[5-8]。

自然界中秸稈的降解是一個多種微生物相互協(xié)作的過程。與單一菌株相比，微生物菌群通過分泌功能互補(bǔ)的復(fù)雜降解酶系可顯著提高秸稈的降解效率，從而促進(jìn)厭氧發(fā)酵過程中甲烷的合成[9]。Wen[10]等研究了3種不同秸稈降解菌群MC1，WSD-5，XDC-2對秸稈預(yù)處理過程，結(jié)果表明通過3種菌群的預(yù)處理均能夠使甲烷的收率提高32%～49.2%。Yuan[11]等研究了秸稈降解菌群MC1預(yù)處理棉花秸稈對產(chǎn)甲烷過程的影響，甲烷收率達(dá)到118 mL·g-1VS，比未處理棉花秸稈提高了136%。盡管目前已有大量秸稈降解菌群的報道，但大多數(shù)都是好氧菌群。利用好氧菌群預(yù)處理秸稈將會增加設(shè)備投入，延長發(fā)酵周期，且預(yù)處理過程秸稈干物質(zhì)損失大。相反，厭氧秸稈降解菌群可直接接種至甲烷發(fā)酵體系促進(jìn)秸稈水解，無需額外設(shè)備投入，且主要降解產(chǎn)物可為甲烷發(fā)酵過程提供前體，有利于甲烷收率的進(jìn)一步提高[12]。有鑒于此，Kong[13]等通過在培養(yǎng)基中添加復(fù)合還原劑的方式從高溫堆肥樣品中成功篩選到一種可高效降解農(nóng)業(yè)秸稈的厭氧菌群TC-5，其中稻秸和麥秸的降解率分別達(dá)到46.7%和54.5%(1.0 wt% 添加量)，酶活檢測分析表明TC-5菌群具有多種木質(zhì)纖維素降解酶活性。將厭氧秸稈降解菌群TC-5接種至甲烷發(fā)酵體系，在中溫和高溫批次發(fā)酵過程中甲烷產(chǎn)量分別提高了22.2%和36.6%。

本研究在半連續(xù)進(jìn)料模式下考察了添加厭氧微生物菌劑TC-5對秸稈和豬糞混合發(fā)酵產(chǎn)氣過程和發(fā)酵體系中微生物多樣性的影響。研究結(jié)果表明生物強(qiáng)化菌劑TC-5的添加能夠調(diào)控厭氧發(fā)酵過程中細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌微生物的組成，進(jìn)而影響微生物的活性，促進(jìn)甲烷產(chǎn)量的提高，相關(guān)結(jié)果對厭氧發(fā)酵過程的生物強(qiáng)化技術(shù)開發(fā)具有重要的價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用水稻秸稈來自江蘇省南京市六合區(qū)的試驗農(nóng)田中，自然風(fēng)干后，使用粉碎機(jī)(Hummer 900)將其粉碎成約2～3 mm的粉末顆粒，置于烘箱55 ℃下烘干后備用。取自于江蘇省淮安市養(yǎng)殖場的新鮮豬糞，取回后儲存于4 ℃的冰箱。接種物為本實驗室污泥馴化罐中不產(chǎn)氣厭氧污泥。厭氧木質(zhì)纖維素降解菌群TC-5來源于保存的原始種子液經(jīng)過活化后得到。供試材料的理化參數(shù)如表1。

表1 供試材料的理化組成 (%)

所有化學(xué)品均為試劑級，購買于上海中化集團(tuán)或上海生工科技有限公司。 所用的氣體包括CO2,H2,CH4和N2均從南京特種氣體工廠購買。

1.2 試驗裝置

厭氧發(fā)酵裝置采用CSTR反應(yīng)器(見圖1)，總?cè)莘e5 L，有效容積4 L，主要由攪拌器、發(fā)酵罐、排水集氣裝置以及水浴系統(tǒng)組成。發(fā)酵罐材質(zhì)為雙層有機(jī)玻璃，罐內(nèi)設(shè)有攪拌釜，機(jī)械密封，攪拌軸連接定時開關(guān)與高頻電機(jī)，軸上固定 3 層葉片，采用間歇式攪拌方式。發(fā)酵罐整體采用循環(huán)恒溫水浴箱保溫。發(fā)酵罐頂部設(shè)置有進(jìn)料口和排氣口，側(cè)面的上部設(shè)有出水口，下部設(shè)有出料口和進(jìn)水口，進(jìn)出料口采用閥門控制，沼氣出口連接排水集氣裝置。

圖1 CSTR反應(yīng)器結(jié)構(gòu)圖

1.3 試驗方法

1.3.1 厭氧木質(zhì)纖維素降解菌群TC-5的制備

將配制好的50 mL PCS培養(yǎng)基分裝到180 mL血清瓶中，并在加熱狀態(tài)下持續(xù)通無氧高純氮?dú)夂?.5 g·L-1的L-半胱氨酸，以達(dá)到排除培養(yǎng)基中溶解性氧氣的作用，在121℃滅菌15 min備用。無菌條件下，按照4%v/v的比例將甘油管保存的菌種原始菌液轉(zhuǎn)接至厭氧血清瓶中活化。置于55℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，在8000 rpm·min-1條件下離心10 min，收集濕菌體按照接入?yún)捬醢l(fā)酵罐中。

1.3.2 半連續(xù)厭氧發(fā)酵試驗的運(yùn)行

本試驗設(shè)計3個重復(fù)組，每組運(yùn)行3個發(fā)酵階段共60 d，每個發(fā)酵階段設(shè)置為20 d，以恒溫循環(huán)水浴將發(fā)酵罐維持在37℃，每2 h攪拌1次，轉(zhuǎn)速設(shè)定為20 r·min-1。厭氧發(fā)酵試驗包括3個階段，A 階段為一次性進(jìn)料的批式發(fā)酵試驗，共計20 d。B階段不添加TC-5菌劑的半連續(xù)發(fā)酵(SRT為20 d)。C階段為添加厭氧菌群TC-5的半連續(xù)發(fā)酵(SRT為20 d)。采用排水法(飽和碳酸氫鈉溶液)計量每日沼氣總產(chǎn)量。

A 階段發(fā)酵TS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，反應(yīng)器容積4 L，接種物與發(fā)酵罐有效容積之比為1∶2，水稻秸稈與新鮮豬糞添加量換算出TS干物質(zhì)比為1∶5，發(fā)酵體系C/N調(diào)節(jié)為30。裝料方式如同批式發(fā)酵試驗，一次性進(jìn)料后密封發(fā)酵罐。在A階段運(yùn)行結(jié)束后，繼續(xù)實行B階段，每天定時定量進(jìn)出料，進(jìn)出料料液總體積為200 mL，利用100目網(wǎng)篩過濾出料液，過濾后的濾液用于進(jìn)料料液中。進(jìn)料基質(zhì)為水稻秸稈和新鮮豬糞，發(fā)酵TS同為8%，當(dāng)進(jìn)料料液體積不足200 mL時可采用純化水補(bǔ)充。B階段運(yùn)行結(jié)束時，接入活化后離心的厭氧菌群TC-5菌泥，按照5.0 % v/v接種量的方式接入，并繼續(xù)運(yùn)行20天，進(jìn)出料方式與B階段保持一致。

1.4 分析檢測方法

豬糞和水稻秸稈總碳(TC)、總氮(TN)和總固體(TS)的含量測定采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法。pH值由pH計測得。采用 GC-7890A 氣相色譜儀分析沼氣中的甲烷濃度(TCD檢測器)，并使用氫氣作為載氣。進(jìn)樣器，柱箱和檢測器的溫度分別控制在100℃，150℃和120℃。載氣的流速為50 mL·min-1，樣品的進(jìn)樣量為0.5 mL。定期采集不同階段厭氧發(fā)酵中的沼液，采用通用型細(xì)菌引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)進(jìn)行細(xì)菌多樣性檢測；利用Arch344F (5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′)和Arch915R (5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)引物進(jìn)行了古細(xì)菌多樣性的測定。DNA擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物送往上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行 Illumina MiSeq 高通量測序，在美吉云平臺上對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌群TC-5的添加對厭氧發(fā)酵日產(chǎn)沼氣量和甲烷量的影響

在厭氧發(fā)酵過程中，日產(chǎn)沼氣量如圖2所示，A,B,C這3個階段的發(fā)酵時間均為20天。在發(fā)酵啟動階段，日產(chǎn)沼氣量迅速增加，在第4天達(dá)到峰值6493 mL·d-1，隨后開始下降，這種趨勢符合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的試驗結(jié)果，說明發(fā)酵啟動，在適宜的溫度、充足的原料條件下，體系中的微生物開始活動，物料發(fā)生降解產(chǎn)生大量沼氣，隨著發(fā)酵的進(jìn)行到達(dá)峰值后，沼氣產(chǎn)量開始下降，說明隨著原料基質(zhì)的降解，體系可以利用的原料在減少，沼氣產(chǎn)量隨著減少。B階段通過半連續(xù)進(jìn)料的方式，沼氣產(chǎn)量開始逐漸緩慢增加，并在后期30～40天發(fā)酵過程穩(wěn)定在3500～3700 mL·d-1，說明隨著半連續(xù)發(fā)酵的進(jìn)行，體系在后期逐漸達(dá)到一個穩(wěn)定的狀態(tài)。C階段在添加菌群TC-5之后，沼氣日產(chǎn)量并沒有立即得到提升，沼氣產(chǎn)量經(jīng)過10天左右的發(fā)酵緩慢增加，最終穩(wěn)定在4000 mL·d-1左右。

圖2 厭氧發(fā)酵過程中日產(chǎn)沼氣量

在厭氧發(fā)酵過程中，日產(chǎn)甲烷量如圖3所示。日產(chǎn)甲烷量的總體趨勢和日產(chǎn)沼氣量相似，日產(chǎn)甲烷的體積分?jǐn)?shù)緩慢上升，在B和C階段穩(wěn)定在54.38%左右。B階段的日產(chǎn)甲烷量穩(wěn)定在1800～1900 mL·d-1，C階段穩(wěn)定在2100～2200 mL·d-1，添加厭氧微生物菌劑TC-5能夠明顯提高甲烷的日產(chǎn)量提。

圖3 厭氧發(fā)酵過程中日產(chǎn)甲烷量

2.2 菌群TC-5的添加對厭氧發(fā)酵日累積產(chǎn)沼氣量和甲烷量的影響

在厭氧發(fā)酵過程中，日累積產(chǎn)沼氣量如圖4所示。A階段日累計沼氣產(chǎn)量在0～10天迅速增加，10～20天緩慢增加，而B和C階段持續(xù)緩慢增加，這種趨勢和日產(chǎn)沼氣量相似，符合厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣模式。A，B，C這3個階段的最終累積沼氣產(chǎn)量分別為67304 mL,65803 mL,75700 mL，相較于A發(fā)酵階段和B發(fā)酵階段，添加厭氧菌群TC-5后的C發(fā)酵階段沼氣產(chǎn)量分別提高了12.47%,15.04%，這說明在厭氧發(fā)酵過程中，添加厭氧菌群TC-5可在一定程度上有助于沼氣產(chǎn)量的提高。

圖4 厭氧發(fā)酵過程中日累積產(chǎn)沼氣量

在厭氧發(fā)酵過程中，日累積產(chǎn)甲烷量如圖5所示。A，B，C這3個階段總體趨勢與日累積產(chǎn)沼氣量相似，最終累積甲烷產(chǎn)量分別達(dá)到34540 mL,35626 mL,41146 mL。相較于A發(fā)酵階段和B發(fā)酵階段，添加厭氧菌群TC-5后的C發(fā)酵階段甲烷產(chǎn)量分別提高了19.12%,15.49%。

圖5 厭氧發(fā)酵過程中日累積產(chǎn)甲烷量

2.3 厭氧菌群TC-5的添加對發(fā)酵容積產(chǎn)氣率和原料產(chǎn)氣率的影響

容積產(chǎn)氣率和原料產(chǎn)氣率是衡量厭氧發(fā)酵過程效率和經(jīng)濟(jì)效益的核心指標(biāo)。在本實驗的半連續(xù)厭氧發(fā)酵過程中，不同發(fā)酵階段的容積產(chǎn)氣率如圖6所示，各階段間的容積產(chǎn)氣率差異顯著。A階段由于前期可溶性有機(jī)物的快速降解導(dǎo)致容積產(chǎn)氣率先迅速上升，在第4天達(dá)到容積產(chǎn)氣率最大值1.62 L·L-1d-1，并由于秸稈中木質(zhì)纖維素組分的抗降解性容積產(chǎn)氣率持續(xù)下降至0.48 L·L-1d-1左右，隨后緩慢上升到次高峰0.92 L·L-1d-1。B，C階段趨勢相同，均為先緩慢增加，第30～40天穩(wěn)定在0.89 L·L-1d-1，第50～60天穩(wěn)定在1 L·L-1d-1。3個階段的平均容積產(chǎn)氣率(見表2)分別為0.84，0.82和0.95 L·L-1d-1，C階段是分別是A，B階段的1.13和1.16倍。

表2 不同厭氧發(fā)酵階段的平均容積產(chǎn)氣率和原料產(chǎn)氣率對比

發(fā)酵原料、滯留時間、發(fā)酵溫度等條件顯著影響原料產(chǎn)氣率。整個發(fā)酵過程中原料產(chǎn)氣率變化如圖7所示。A，B，C這3個階段的容積產(chǎn)氣率趨勢總體相似。A階段產(chǎn)氣率隨著發(fā)酵時間的增加而緩慢增加，在第20天達(dá)到最大值210.06 mL·g-1TS。B階段中啟動后原料產(chǎn)氣率迅速降低，直到第30～40天后達(dá)到228.17 mL·g-1TS。接入?yún)捬蹙篢C-5后啟動的C階段發(fā)酵過程原料產(chǎn)氣率緩慢增加，在第60天達(dá)到251.86 mL·g-1TS，3個不同發(fā)酵階段的平均原料產(chǎn)氣率(見表2)分別為123.47,205.64和236.56 mL·g-1TS，C階段的原料產(chǎn)氣率分別是A階段和B階段的1.92和1.15倍。

圖6 發(fā)酵過程中容積產(chǎn)氣率

圖7 發(fā)酵過程中原料產(chǎn)氣率

2.4 菌群TC-5的添加對厭氧發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

分別對每個發(fā)酵階段的起始和結(jié)束階段進(jìn)行高通量測序技術(shù)分析，研究3種不同厭氧發(fā)酵體系中細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌群落的變化過程(見圖8～圖10)。厭氧發(fā)酵的水解酸化階段主要由細(xì)菌負(fù)責(zé)完成[14]。細(xì)菌群落在門水平上的分布圖顯示厭氧發(fā)酵體系中主要包含厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)，此細(xì)菌門水平分布圖結(jié)果與之前報道的文獻(xiàn)結(jié)果相一致[15-16]。厚壁菌門在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解中起重要作用，因為已知屬于該門的物種會產(chǎn)生多種纖維素降解酶。厚壁菌門的嚴(yán)格梭狀芽胞桿菌1(Clostridiumsensustricto1)和克里斯滕森氏菌(Christensenellaceae_R-7_group)的菌群相對豐度升高。Christensenellaceae_R-7_group和Clostridiumsensustricto1是典型的纖維素分解菌，也能有效降解半纖維素，并且能夠高效的分解有機(jī)物合成有機(jī)酸為厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程提供前提物質(zhì)。

圖8 不同發(fā)酵階段細(xì)菌在門水平上的相對豐度對比

圖9 不同發(fā)酵階段細(xì)菌在屬水平上的相對豐度對比

圖10 不同發(fā)酵階段產(chǎn)甲烷古菌在屬水平上的相對豐度對比

擬桿菌門是第2大優(yōu)勢種群，門內(nèi)菌種的主要功能是降解大分子有機(jī)物以及產(chǎn)有機(jī)酸。在接入TC-5后，擬桿菌綱中vadinBC27wastewatersludgegroup屬的相對豐度相比對照組(A組)有明顯升高。vadinBC27wastewatersludgegroup能夠利用氨基酸(亮氨酸、色氨酸和蛋氨酸等)產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸[17]。

由細(xì)菌群落在門和屬水平上的分析可知，接入?yún)捬蹙篢C-5后，梭菌綱中的Christensenellaceae_R-7_group和Clostridiumsensustricto_1以及擬桿菌綱中vadinBC27wastewatersludgegroup的物種豐富度均比未接菌時高，而這些細(xì)菌可能通過加強(qiáng)有機(jī)物的分解利用過程，進(jìn)而提高沼氣和甲烷產(chǎn)量。

厭氧消化過程的甲烷合成由多種產(chǎn)甲烷古細(xì)菌協(xié)同作用完成。從圖10可以看出，古菌群落在屬水平上主要包含甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)、甲烷鬃菌屬(Methanosaeta)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)。其中，乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta占據(jù)主導(dǎo)地位；乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanosarcina和氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanobacterium是第二大優(yōu)勢菌屬。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入半連續(xù)進(jìn)料階段，產(chǎn)甲烷古菌的相對豐度總體保持平穩(wěn)，但接種厭氧菌群TC-5后Methanosaeta屬的物種豐富度升高，而Methanosarcina和Methanobacterium屬的物種豐富度降低，這表明厭氧降解菌群TC-5可以影響厭氧發(fā)酵體系中氫營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑的平衡。乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的豐度升高和氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的豐度降低，說明TC-5能夠提高厭氧發(fā)酵體系利用乙酸作為底物產(chǎn)生甲烷的潛力。

3 結(jié)論

在豬糞-稻秸半連續(xù)厭氧發(fā)酵過程中考察了添加TC-5生物強(qiáng)化菌劑對厭氧發(fā)酵過程沼氣合成和微生物多樣性的影響。實驗結(jié)果表明添加TC-5生物強(qiáng)化菌劑能夠有效提高日產(chǎn)氣量和累計產(chǎn)氣量，與批次發(fā)酵和未接種菌劑組相比，甲烷產(chǎn)量提高了12.47%～15.04%。通過高通量測序技術(shù)分析了不同發(fā)酵過程中微生物菌落的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵型細(xì)菌Christensenellaceae_R-7_group，Clostridiumsensustricto_ 1，vadinBC27 wastewater sludge group和產(chǎn)甲烷古菌Methanosaeta的相對豐度均比批次發(fā)酵和未接種TC-5菌劑的半連續(xù)發(fā)酵過程顯著提高，特殊的發(fā)酵型細(xì)菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的豐度升高可能是發(fā)酵過程甲烷產(chǎn)量提高的原因。相關(guān)實驗結(jié)果表明采用微生物菌劑TC-5強(qiáng)化厭氧發(fā)酵過程提升甲烷產(chǎn)量是一種可行的技術(shù)方案。