徐延亮， 劉 軍， 黎 霞， 任肖慶， 吳雨恬， 鄧 宇， 賀 靜

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室， 四川 成都 610041)

規(guī)?；图s化養(yǎng)殖已經(jīng)成為我國畜禽養(yǎng)殖的主流，據(jù)統(tǒng)計，2015年畜禽糞污產(chǎn)生量就達3.834×109t，其中，新鮮糞便6.36×108t，尿液5.65×108 t，產(chǎn)生污水約2.633×109 t[1]。畜禽糞污的不合理排放和不科學利用對生態(tài)環(huán)境以及人們身體健康產(chǎn)生了很多的負面影響，畜禽糞污引發(fā)的惡臭氣體不僅對畜禽本身的危害很大，而且對周邊環(huán)境及人體健康也造成嚴重傷害。因此，畜禽養(yǎng)殖環(huán)境和堆放場所氣體除臭具有重要的現(xiàn)實意義和應用前景。

目前，常用的除臭方法主要有物理法、化學法和生物法，與物理法和化學法相比，生物法使用和產(chǎn)生的是生態(tài)安全的化合物，是生態(tài)友好型的除臭方法，因此，生物法除臭已經(jīng)成為除臭的重要方法之一[2]。目前的除臭菌劑主要是液體劑型，存在運輸不方便和貨架期不長等問題，為了延長菌劑保存期，本試驗以實驗室富集和篩選的一組復合除臭菌劑為研究對象，從菌劑載體的角度出發(fā)，對3種不同菌劑載體進行了比對和篩選，測定載體與菌劑復配后活菌數(shù)，并優(yōu)化添加了香味物質(zhì)作為培養(yǎng)基成分，形成了微生物除臭菌劑產(chǎn)品。將不同劑型的菌劑與市售除臭劑應用于豬糞處理，通過對豬糞氨氣排放的抑制率來評估不同除臭菌劑的作用效果，為制備有效的微生物復合菌劑奠定基礎(chǔ)，為解決糞污臭氣污染問題提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

本實驗室采集豬糞和堆肥樣品進行富集培養(yǎng)，從產(chǎn)臭不明顯富集樣本中培養(yǎng)出約500個單菌落，采用M9U產(chǎn)氨檢測培養(yǎng)基[3]，有20菌落可明顯降低氨氣產(chǎn)生，將其依次命名為A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K，L，M，N，O，P，Q，R，S，T。其中，N和K為條件致病菌。其余18株經(jīng)菌落形態(tài)描述及分子生物學鑒定，根據(jù)農(nóng)業(yè)菌株安全名錄，主要包含乳酸菌，酵母菌和芽孢桿菌。

1.1.2 供試載體

非金屬礦物載體：沸石粉、植物源載體：稻殼粉、玉米秸稈粉。

上述載體過60目篩，在121℃滅菌30 min，烘干備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及其它溶液

1.1.3.1 固體培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，牛肉粉5 g，酵母粉4 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，吐溫801 mg·L-1，瓊脂粉15 g。

YPD培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。

CC培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母粉10 g，蛋白胨3 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g。

1.1.3.2 液體培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。

1.1.4 供試香料

7種香料分別按Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ編號。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的生長曲線和產(chǎn)氨氣性能分析

從臭味不明顯的豬糞或堆肥樣品中分離具有除臭潛力的功能微生物，使用M9U產(chǎn)氨檢測培養(yǎng)基[3]，經(jīng)群落分析及分子生物學鑒定菌株。

1.2.2 菌株生長曲線測定

按照體積比1%將菌株A～T接種在MRS液體培養(yǎng)基，30℃，200 rpm搖床單獨培養(yǎng)。前14 h每隔2 h各取200 μL菌液，14 h～46 h每隔8 h各取200 μL菌液，使用酶標儀進檢測OD600,每組重復檢測2次[4]。以時間(h)為橫坐標，OD600值為縱坐標，建立各菌株生長曲線[5]。

1.2.3 拮抗作用分析

將菌株通過劃線交叉法，在MRS平板上兩兩之間交叉劃線，觀察交叉點是否有菌生長，兩菌均能生長，則無拮抗作用，只有一株或者兩株均不能生長則存在拮抗作用。運用牛津杯抑菌圈法測定菌株之間的拮抗性，觀察透明圈的大小，透明圈越大代表拮抗性越強烈，反之，則拮抗性越低。

1.2.4 固體菌劑載體性能測定

吸水率測定：在無菌條件下，每種載體在搪瓷盤中稱3份，每份100 g，按照一定體積梯度緩慢加入蒸餾水后充分混勻，至載體不再吸收水分時停止加水，計算每一份載體吸水率，求平均值。

吸水率=

pH值測定：在250 mL錐形瓶中稱取不同載體10 g，加入100 mL無菌水攪拌均勻，測定液體pH值[6]。以蒸餾水作為對照。

1.2.5 載體與微生物復配

將篩選好的18株菌分別培養(yǎng)至對數(shù)期，將200 g載體高溫高壓滅菌后與菌液按照質(zhì)量體積比1∶1混勻，放置于干燥箱40℃低溫干燥，約48 h后完成[7]。

1.2.6 載體與菌劑復配后活菌數(shù)測定

稱取1 g菌劑樣品，加入到裝有無菌玻璃珠和100 mL PBS緩沖液的250 mL錐形瓶中，在恒溫磁力攪拌器上攪拌2 h后進行梯度稀釋，用無菌水分別梯度稀釋后，涂布在MRS，YPD，LB固體培養(yǎng)基上， 約24 h后統(tǒng)計培養(yǎng)基菌落數(shù)，并計算載體釋放的活菌數(shù)目，同時統(tǒng)計培養(yǎng)液的菌落數(shù)目作為接種細菌的數(shù)目，統(tǒng)計3次稀釋涂布平板法菌落的平均值[8]。

活菌率(%)=釋放活菌數(shù)/接種細菌數(shù)目(CFU)×

100%[9]

將干粉狀菌劑放置于30 ℃培養(yǎng)箱保存，模擬菌株快速老化過程，分別于第20 天和40 天稱取載體1 g按上述方法 。

1.2.7 菌劑培養(yǎng)液制備

經(jīng)過初步篩選，確定Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ等7種香料，按照不同比例復配，確定最佳比例及用量，并進一步優(yōu)化配方配比。

1.2.8 菌劑對豬糞臭氣及氨氣的去除效果評估

除臭效果評估反應體系見表1。

表1 復合菌劑除臭效果評估

嗅覺影響分析評估見表2。

表2 惡臭評判標準

產(chǎn)氨氣檢測：將濕潤的紅色石蕊試紙貼于盛有樣品的一次性塑料盒蓋，蓋上蓋子3 min后讀取顏色，紅色石蕊試紙遇氨氣變紫。

產(chǎn)硫化氫檢測：將濕潤的醋酸鉛試紙貼于盛有樣品的一次性塑料盒蓋，蓋上蓋子3 min后讀取顏色，醋酸鉛試紙遇硫化氫變黑。

1.2.9 氨氣去除率計算

稱取24份豬糞樣品置于一次性塑料盒中，每份250 g，將其分為7個試驗組，1個對照組，每組設(shè)置3個重復。試驗組分別加固體菌劑、液體菌劑1、液體菌劑2、液體菌劑3、市售液體菌劑1、市售液體菌劑2、市售液體菌劑3，加無菌水作為對照。與豬糞充分混勻。然后將盛有20 mL稀硫酸的小燒杯平穩(wěn)放入一次性飯盒中，加蓋密封，吸收氨氣。每2 天吸取1 mL稀硫酸樣品，10 天后取樣結(jié)束，利用凱式定氮法測氨。

氨氣去除率=

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長曲線測定

通過檢測各菌株不同生長時間的OD600值，繪制出菌株生長曲線。圖1結(jié)果顯示，在30℃，200 rpm搖床單獨培養(yǎng)相同條件下，菌株A～E在8～20 小時達到對數(shù)生長期，菌株A，B，C，E在20～28 h進入平穩(wěn)生長期，菌D在28～36 h進入衰退期，之后生長平穩(wěn)。

圖1 菌株A～E生長曲線

圖2～圖4顯示，菌株F在20～28 h進入衰退期，之后生長平穩(wěn)。菌株G在4～12 h達到對數(shù)生長期，12～48 h生長平穩(wěn)；菌株H，I，J，L，M在8～28 h進入對數(shù)生長期，第28 h以后開始衰退。菌株O在8～28 h達到對數(shù)生長期，28 h以后生長開始衰退；菌株S在12～28 h內(nèi)達到對數(shù)生長期，之后生長較為平穩(wěn)；菌株P(guān)，Q，R，T在4～8 h內(nèi)進入對數(shù)生長期，在8～48 h內(nèi)，菌株P(guān)，R，T增長緩慢，生長較為平穩(wěn)，菌株Q在8～12 h內(nèi)生長衰退，12～20 h內(nèi)菌數(shù)開始增長，20 h以后生長平穩(wěn)。

圖2 菌株F～J生長曲線

圖3 菌株L～P生長曲線

圖4 菌株Q～T生長曲線

綜上所述，菌株A～F，H～O均在8 h后進入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期均在12 h以上，部分菌株對數(shù)生長期后進入平穩(wěn)生長期，48 h以內(nèi)不會有衰退期，平穩(wěn)生長期均時長超過12 h，如菌株A，B，C，E，F(xiàn) 等，但是H，I，J，L，M，N等菌株在28 h以后進入生長衰退期。菌株G，P，Q，R，T等在4 h后進入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期持續(xù)時長約4 h，均在4 h以

后的不同時間進入平穩(wěn)生長期，平穩(wěn)生長時間超過對數(shù)生長期。因此，按照對數(shù)生長期收集菌體作為與載體復配的時間節(jié)點，菌株G和R分別在培養(yǎng)10.4 h和7.2 h收集，其他菌株均在培養(yǎng)17.6 h以后收集菌體。

2.2 菌株間拮抗作用分析

通過平板交叉劃線法探究各菌株間的拮抗作用，觀察交叉點處的菌株生長情況，如表3所示：18株微生物之間無相互抑制效應。微生物之間的拮抗作用是指一種微生物的生長和代謝活動，對其他微生物產(chǎn)生抑制、干擾或毒害作用。拮抗作用一般具有專一性或特異性，本研究中所篩選菌株為乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌，此3類廣泛共存于環(huán)境中。

表3 菌株的拮抗性

2.3 固體菌劑載體吸水性能測定

選擇沸石粉、稻殼粉和玉米秸稈粉作為備選載體，不同載體吸水率測定結(jié)果顯示(見圖5)：沸石粉吸水較快，吸水量較少，吸水率為46%，攪拌后呈糊狀；稻殼粉加水后吸水較慢，吸水量居中，浮于水面緩慢吸收水分，吸水率為195.3%，玉米秸稈粉吸水最快，吸水量最高，吸水率為600.3%。不同載體pH值測定結(jié)果顯示：沸石粉pH值最高，為8.10，稻殼粉次之，pH值為7.71，玉米秸稈最低，pH值為7.51。

圖5 不同載體吸水性能和pH值

因此，沸石粉吸水率最低，pH值最高，不適合作為固體菌劑載體；稻殼粉吸水率，pH值次之，但是其吸水速率較慢；玉米秸稈粉吸水率最高，吸水速度較快，pH值更接近中性，故最終選擇玉米秸稈粉作為固體菌劑載體。

2.4 載體與菌劑配制為固體菌劑后活菌數(shù)測定

通過檢測載體和菌劑復配后第0天，20天，40天的活菌數(shù)評估制備效果。第0天的接菌數(shù)為1.4483×1010個·g-1，活菌數(shù)1.0628×1010個·g-1。

活菌數(shù)測定結(jié)果顯示(見圖6)，第20 天的活菌數(shù)為6.02×109個·g-1， 20 天后活菌率為56.64%；第40 天的活菌數(shù)為2.003×109個·g-1，即 40 天后活菌率為33.27%。根據(jù)農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標顯示，粉劑型有效活菌數(shù)應不少于2.0×108個·g-1，且保質(zhì)期應不少于6個月，自制復合菌劑20 天和40天后符合規(guī)定標準。

圖6 固體菌劑不同時間的活菌數(shù)

2.5 培養(yǎng)液配方對液體菌劑活菌數(shù)的影響

經(jīng)過香料配方初步篩選，選擇了3種感官較好的配方，配方1(Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ∶Ⅳ=2∶3∶3∶7)，配方2(Ⅰ∶Ⅴ∶Ⅵ∶Ⅶ=1∶2∶3∶1)，配方3(Ⅱ∶Ⅵ∶Ⅲ=5∶2∶2)?？疾炝嗽诓煌浞脚囵B(yǎng)液下，對菌劑總活菌數(shù)的影響。從圖7可以看出，3種配方培養(yǎng)下，總菌數(shù)都在1010個·mL-1以上，其中配方2條件下活菌數(shù)最高。

圖7 3種培養(yǎng)液條件下液體菌劑的活菌數(shù)

2.6 菌劑對豬糞臭氣及氨氣的去除效果評估

結(jié)果顯示(見表4)配方3和市售菌劑3除臭效果最好，勉強可以聞到氣味，配方2次之，氣味很弱，固體菌劑、配方1和市售菌劑3除臭效果不明顯，很容易能感覺到氣味，市售菌劑2除臭效果最差，可以聞到強烈的氣味。

表4 菌劑除臭效果分析評估

2.7 氨氣去除率計算

實驗室條件下，在豬糞存儲盒中使用菌劑，測定其氨氣的積累量。結(jié)果表明(見圖8)：在2 天以后，固體菌劑開始積累氨氣，3 天以后，除液體菌劑3之外的2種液體菌劑和3種市售菌劑開始積累氨氣，其氨氣積累量由多到少依次為固體菌劑、市售液體菌劑1、市售液體菌劑3、液體菌劑1、液體菌劑2。液體菌劑3在4 天以后開始積累氨氣，且氨氣積累量比其它菌劑少，產(chǎn)生速率慢。

圖8 不同劑型除臭劑施用后豬糞的氨氣積累量

氨氣去除率結(jié)果表明(見圖9)：在0～2 天內(nèi)，除固體菌劑外，其它菌劑在第2 天時，氨氣去除率達100%。2～6 天內(nèi)，液體菌劑3氨氣去除率保持在100%，第4 天以后，其它均菌劑氨氣去除率開始降低，但是市售液體菌劑3的氨氣去除率在4天以后保持在60%以上。通過除氨率實驗結(jié)果可以看出，在液體菌劑中，液體菌液3的降低氨氣產(chǎn)生效果最為顯著。

圖9 不同劑型除臭劑施用后豬糞的氨氣去除率

固體菌劑在前4 天起效較液體菌劑慢，可能因素是固體菌劑在豬糞中定殖需要一段時間，但是在菌劑施用第4 天到第10 天氨氣去除率達到50%以上，效果和液體菌劑相當，具有非常好的實際實用潛力。

3 討 論

在畜禽養(yǎng)殖方面，養(yǎng)殖圈舍和糞便儲存處理過程中產(chǎn)生的氨氣造成土壤酸化以及水體富營養(yǎng)化等問題日趨嚴重[10]。據(jù)統(tǒng)計，農(nóng)業(yè)畜禽養(yǎng)殖氨排放量自1975年至2005年增加5100 kg，增幅達44.7%[11]。目前，部分畜禽養(yǎng)殖場通過糞尿分離減少部分臭氣的產(chǎn)生與排放，但是后續(xù)的糞尿處理存在較大的缺陷，劉娟[12]等研究發(fā)現(xiàn)糞尿酸化可顯著降低氨氣排放。據(jù)了解，也有研究使用菌劑處理畜禽糞尿，但是效果和穩(wěn)定性有待提高。目前關(guān)于除臭菌劑載體選擇和效果評價尚沒有報道，故本研究從菌劑載體的角度出發(fā)，通過篩選一些具有一定除臭作用的菌株，與載體復配，優(yōu)化配制條件，初步應用于豬糞儲存，檢測除臭效果，結(jié)果顯示液體除臭菌劑在使用2 天之后，氨氣去除率能達到100%，4 天之后略有降低，但維持在80%以上。固體菌劑效果要比液體菌劑起效慢4 天左右，總體效果低50%，但是因其具有運輸方便和施用簡易的特點，也具備很好的現(xiàn)實使用意義。

本研究雖然篩選出載體種類以及菌劑配方，做了初步效果評估，但是也有許多不足有待進一步探究： 1)本研究菌劑只做了豬糞發(fā)酵探究除臭效果，其他畜禽糞便除臭效果如何有待進一步探究； 2)菌劑對于其它惡臭氣體的去除率尚需要評估； 3)菌劑處理后的畜禽糞便能否再次利用，利用價值如何有待進一步探究。