劉萬(wàn)峰 ，蒲文宣，楊愛國(guó)，高軍平，王 奇，孫明銘，張新要，孫 楠，陳 凱，王國(guó)平,3，李曉旭*,

1.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，長(zhǎng)沙市勞動(dòng)中路386號(hào) 410007

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101

3.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，云南省玉溪市南翔路14號(hào) 653100

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，其家族成員在N端具有1個(gè)或者2個(gè)高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域（WRKYGQK），其命名也來(lái)源于該結(jié)構(gòu)域［1］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在C端有C2H2或者C2HC型的鋅指結(jié)構(gòu)［1-2］。據(jù)報(bào)道WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合W-box（TTGACC/T）順式元件，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)［3］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員在真菌性、細(xì)菌性和病毒性病原物引發(fā)的植物生物逆境應(yīng)答中起重要作用［4-5］。在擬南芥中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY3和AtWRKY4編碼基因受灰霉病（Botrytis）和水楊酸（SA）誘導(dǎo)表達(dá)，并且與野生型相比wrky3、wrky4單突變體及wrky3/wrky4雙突變體接種灰霉病后表型表現(xiàn)更加嚴(yán)重，說(shuō)明其對(duì)灰霉病抗性具有正向調(diào)控作用［6-7］。轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY70編碼基因能夠被二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）所誘導(dǎo)，AtWRKY70基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)對(duì)二孢白粉菌的抗性［8-9］。此外，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）侵染擬南芥時(shí)，AtWRKY25基因高量表達(dá)，而AtWRKY25基因過(guò)表達(dá)能夠增加對(duì)丁香假單胞菌的抗性［10］。同時(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員也參與非生物逆境脅迫響應(yīng)［11-12］。在擬南芥中，由生物逆境誘導(dǎo)的基因AtWRKY25同樣也被干旱脅迫以及熱脅迫所誘導(dǎo)，AtWRKY25過(guò)表達(dá)時(shí)能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱能力［13-14］。在水稻中研究發(fā)現(xiàn)OsWRKY30基因參與干旱脅迫，該基因過(guò)表達(dá)可以顯著提高耐旱性［15］。另外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員也參與植物衰老過(guò)程的調(diào)控。在擬南芥中，AtWRKY54和AtWRKY70作為負(fù)調(diào)控因子調(diào)控?cái)M南芥的葉片衰老過(guò)程［16］。此外，轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY53編碼基因在衰老時(shí)期表達(dá)量上調(diào)，wrky53突變體具有晚衰表型，并且該基因過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)葉片衰老［17-18］。有研究表明參與葉片衰老調(diào)控的AtWRKY53基因，同樣能被丁香假單胞菌誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)，相對(duì)于野生型，wrky53/wrky46雙突變體對(duì)丁香假單胞菌更為敏感，說(shuō)明AtWRKY53基因可能同時(shí)調(diào)控生物逆境應(yīng)答和葉片衰老。此外，在禾本科植物紫花針茅中，SpWRKY53基因受鹽和干旱等非生物脅迫的誘導(dǎo)，并且SpWRKY53基因過(guò)表達(dá)可以顯著促進(jìn)葉片的衰老［19］。另有研究表明，小麥TaWRKY53b基因在葉片衰老期顯著上調(diào)，說(shuō)明該基因可能在調(diào)節(jié)小麥葉片衰老中起重要作用［20］。在水稻中，OsWRKY53過(guò)表達(dá)的水稻植株對(duì)稻瘟病的抗性明顯增強(qiáng)［21］。在玉米中，不同的非生物脅迫如低溫、NaCl、H2O2和PEG均能顯著誘導(dǎo)ZmWRKY53基因的表達(dá)，并且在接種玉米紋枯病的葉片中ZmWRKY53基因的表達(dá)量也有顯著提高［22］。

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受外界逆境脅迫而影響產(chǎn)量和品質(zhì)［23-25］。同時(shí)，煙草收獲的對(duì)象是落黃成熟的葉片，煙葉成熟落黃對(duì)品質(zhì)特征等起重要作用［26-28］。為此，采用比較基因組學(xué)的方法，在普通煙草中鑒定、克隆NtWRKY53基因，并對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系、共線性、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活以及基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在明確煙草逆境脅迫、葉片落黃的調(diào)控機(jī)制，為煙草育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

普通煙草K326為主栽品種，用于后續(xù)非生物脅迫處理；臺(tái)煙8號(hào)為CMV抗性品種［29］，用于CMV接種處理；雪茄煙Beinhart1000-1為黑脛病抗性品種［30］，用于黑脛病接種處理。

pCHF3-cGFP、pBridge載體、農(nóng)桿菌GV3101以及酵母AH109菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。pBlunt0載體、大腸桿菌感受態(tài)購(gòu)自北京全式金有限公司。Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Ex TaqTM熒光定量試劑盒、高保真pfu酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。Infusion連接試劑盒、酵母SD培養(yǎng)基、色氨酸缺失物、X-Gal等購(gòu)自日本Clonetech公司。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。引物合成和載體測(cè)序由北京六合華大基因有限公司完成。熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司的ABI 7500型，激光共聚焦顯微鏡為德國(guó)Leica公司的TCS-SP8型。

1.1.1 非生物脅迫處理

試驗(yàn)設(shè)置在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，采用盆栽將普通煙草K326種植于光照培養(yǎng)箱中。光周期設(shè)置為16 h光照/8 h黑暗，溫度設(shè)置為24 ℃。在煙株現(xiàn)蕾期采集莖尖、莖、根尖、根、幼嫩葉片和衰老葉片等，液氮迅速冷凍后放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；普通煙草K326種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，在MS固體培養(yǎng)基中萌發(fā)，待幼苗長(zhǎng)至6片真葉時(shí)，將其在MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)5 d。參考文獻(xiàn)［31］進(jìn)行非生物逆境及激素處理。干旱處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗放于吸水濾紙上模擬干旱處理，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對(duì)照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長(zhǎng)勢(shì)相近的整株幼苗；鹽處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至含有0.05 mol/L NaCl的MS溶液中進(jìn)行處理，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對(duì)照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長(zhǎng)勢(shì)相近的整株幼苗；冷脅迫、熱脅迫處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至新的MS溶液中，隨后放入4 ℃、37 ℃培養(yǎng)箱中，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對(duì)照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長(zhǎng)勢(shì)相近的整株幼苗；ABA激素處理：將懸浮培養(yǎng)5 d的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至含有10-5mol/L ABA的MS溶液中進(jìn)行處理，以未經(jīng)處理的煙草幼苗為對(duì)照，分別在1 h、6 h、12 h采樣，每組采集3株長(zhǎng)勢(shì)相近的整株幼苗。以上所有樣品均經(jīng)液氮冷凍后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 CMV接種

參考文獻(xiàn)［29］進(jìn)行煙草CMV接種，接種毒源為CMV亞組I的Fny株系（CMV-Fny），普通煙草臺(tái)煙8號(hào)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，以空白接種液接種的煙草植株為對(duì)照。接種方法：待煙苗處于6片真葉期時(shí)，在葉片上均勻撒上石英砂，選取最上面2片充分展開的真葉為接種葉，用脫脂棉蘸取接毒液輕輕摩擦2遍，1 h后用清水將葉片表面殘留的石英砂沖洗干凈。接病后在1、3和5 d時(shí)采樣，每組采集3株病情相近植株的葉片組織。

1.1.3 黑脛病接種

參考文獻(xiàn)［30］進(jìn)行黑脛病接種，接種毒源為黑脛病菌0號(hào)生理小種（由本實(shí)驗(yàn)室保存），接種品種為Beinhart1000-1，以未接種的煙草植株為對(duì)照。接種方法：在6片真葉期煙苗周圍5 cm處，將長(zhǎng)柄勺子豎直插入土壤中進(jìn)行傷根處理，隨后取菌谷放入土壤，立刻覆土、灌水保濕。接病后分別在1、3和5 d時(shí)采樣，每組采集3株病情相近植株的根部組織。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA的制備

將采集的組織和逆境脅迫處理樣品從-80 ℃冰箱取出，在液氮中研磨成粉末。使用Trizol試劑盒提取總RNA并去除基因組DNA，使用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋至25 ng/μL備用。

1.2.2 NtWRKY53基因的克隆

在茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//solgenomics.net/）下載普通煙草K326蛋白序列（Nitab-v4.5 proteins），以擬南芥AtWRKY53的蛋白全長(zhǎng)序列為query，進(jìn)行本地BLASTP比對(duì)，得到候選基因（Nitab4.5_0000223g0340），基于得到的候選基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)擴(kuò)增引物。上游引物：5′-ATGGATTGTGGTTTCAATTGG-3′，下游引物：5′-TTATCTGAAAAATTCTGAGTT-3′，使用pfu高保真酶進(jìn)行目的基因克隆，擴(kuò)增后完成膠回收。取8 μL WRKY53基因擴(kuò)增膠回收產(chǎn)物與2 μL pBlunt0平端載體混合，在PCR儀中25 ℃反應(yīng)20 min完成連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物全部加入100 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并完成轉(zhuǎn)化，在含有100 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行抗性篩選，對(duì)陽(yáng)性單克隆使用目的基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR鑒定，將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

普通煙草NtWRKY53基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子的序列特征通過(guò)在線程序ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，包括其等電點(diǎn)、分子量等理化性質(zhì)；在擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（www.arabidopsis.org）和NCBI（http：//solgenomics.net/）中下載擬南芥AtWRKY53（ACF20468）、AtWRKY6（AF331713）、AtWRKY31（ACF20468）和其他物種中相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列，包括水稻 OsWRKY53（DAA05118）、小麥TaWRKY53（AGF90798）、玉米ZmWRKY53（NP_001147551）、紫花針茅SpWRKY53（AOZ56938）以及 番 茄 SlWRKY53 （XP_004244630）、葡萄VvWRKY53（RVW26716）、蘋 果 MdWRKY53（RXH95720）。參照文獻(xiàn)［31］使用MAFFT完成多序列比對(duì)，利用Texshade將多序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，分析其保守的WRKY結(jié)構(gòu)域?；诙嘈蛄斜葘?duì)結(jié)果，使用MEGA v6.06構(gòu)建鄰接樹（Neighbor-Joining，NJ tree），參數(shù)設(shè)置：Poisson模型，Pairwise Deletion，Bootstrap Value設(shè)置為1 000次；同時(shí)在默認(rèn)參數(shù)下，利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線程序?qū)ι鲜鲂蛄羞M(jìn)行保守基序（motif）預(yù)測(cè)分析。

1.2.4 共線性分析

在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/）和茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載擬南芥和普通煙草K326基因組注釋信息，參考文獻(xiàn)［32］利用McScan X在默認(rèn)參數(shù)下進(jìn)行擬南芥和普通煙草基因組的共線性分析。

1.2.5 亞細(xì)胞定位分析

參考文獻(xiàn)［31］對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY053進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。以Blunt-NtWRKY53為模板，對(duì)不含終止密碼子的NtWRKY53基因CDS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Infusion重組酶，將目的片段連接到pCHF3-cGFP亞細(xì)胞定位載體上，構(gòu)建35S ∷NtWRKY53-cGFP融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行陽(yáng)性篩選，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，在含有100 μg/mL壯觀霉素（Spec）和50 μg/mL利福平（Rif）的YEP固體平板上進(jìn)行抗性篩選，通過(guò)PCR進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。參考文獻(xiàn)［33］在本氏煙葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，以含有35∷GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株為對(duì)照，將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和對(duì)照分別以200 r/min振蕩12 h后，5 000 r/min離心3 min集菌，用重懸液重懸后，分別注射到葉片背部，避光12 h。隨后取注射葉片材料，在Leica激光共聚焦顯微鏡TCS-SP8下對(duì)熒光信號(hào)（DAPI、GFP）進(jìn)行觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)分別選擇405 nm和488 nm。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)［31］對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY053進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性分析。以Blunt-NtWRKY53為模板，對(duì)NtWRKY53基因全長(zhǎng)CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收純化后，使用Infusion重組酶連接到pBridge載體中，構(gòu)建NtWRKY53-GAL4BD融合表達(dá)載體，在含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板上進(jìn)行抗性篩選后，用PCR鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序。以pBridge空載體為對(duì)照，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞中，在-Trp缺陷平板（SD/-Trp）上進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選，隨后將所篩選的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移至顯色培養(yǎng)基（SD/-Trp/X-gal）上進(jìn)行顯色分析。

1.2.7 表達(dá)模式分析

根據(jù)NtWRKY53基因的CDS序列，利用Primer premier 5設(shè)計(jì)特異性熒光定量檢測(cè)引物，上游引物序列：5′-TCAAGAAACAAGCCAACAATCCAAA-3′，下游引物序列：5′-TGACGGCGAATAACCTCC TACCAAA-3′。參考文獻(xiàn)［34］，采用普通煙草NtEF1α基因（GenBank ID NM001326165）作為管家基因。各個(gè)組織及處理獨(dú)立進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)為獨(dú)立樣本并單獨(dú)提取RNA，同時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)性重復(fù)?；?-ΔΔCt法計(jì)算NtWRKY53基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtWRKY53基因的克隆及分析

以擬南芥AtWRKY53的蛋白序列進(jìn)行本地BLASTP比對(duì)，鑒定得到NtWRKY53蛋白，其與AtWRKY53具有59%的相似性?；谄胀煵軰326數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)NtWRKY53基因特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以不含cDNA模板的擴(kuò)增體系作陰性對(duì)照，擴(kuò)增片段大約1 000 bp左右。將擴(kuò)增片段經(jīng)過(guò)膠回收純化后，將其連接到pBlunt0平端載體，并對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果（圖1）表明，NtWRKY53基因的CDS序列全長(zhǎng)1 095 bp，由364個(gè)氨基酸組成。利用ProtParam在線工具分析NtWRKY53蛋白的理化性質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量為41 189.62 Da，理論等電點(diǎn)為5.60。

圖1 NtWRKY53基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of NtWRKY53 gene

2.2 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)所鑒定的NtWRKY53蛋白序列，將其與其他物種中的相關(guān)WRKY53蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)（圖2）。完全保守的氨基酸殘基用黑色標(biāo)注，相對(duì)保守的氨基酸殘基用灰色標(biāo)注，發(fā)現(xiàn)NtWRKY53基因所編碼的蛋白具有典型WRKY結(jié)構(gòu)域（WRKYGQK），在其C端具有保守的Cys2HisCys型鋅指結(jié)構(gòu)域。

圖2 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子WRKY結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 WRKY domain analysis of NtWRKY53 transcription factor

2.3 NtWRKY53的進(jìn)化分析和保守基序分析

以擬南芥、番茄和水稻等物種中已報(bào)道的WRKY53轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥中其他WRKY轉(zhuǎn)錄因子為參考，使用MEGA重建鄰接樹（圖3）。參與進(jìn)化分析的11個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員被分為2個(gè)亞類（Clade）和3個(gè)亞家族（Subgroup）。其中，NtWRKY53與文獻(xiàn)報(bào)道的不同物種WRKY53轉(zhuǎn)錄因子均聚在Clade I中，煙草NtWRKY53與番茄StWRKY53、擬南芥AtWRKY53聚在一起，說(shuō)明其直系同源。其中擬南芥 AtWRKY53、煙草NtWRKY53、番茄SlWRKY53和葡萄VvWRKY53等雙子葉植物中的WRKY53聚在亞家族I中，而小麥TaWRKY53、水稻OsWRKY53和玉米ZmWRKY53等單子葉植物中的WRKY53聚在亞家族Ⅱ中，說(shuō)明單子葉、雙子葉植物中的WRKY53可能發(fā)生了結(jié)構(gòu)及功能上的分化。

對(duì)參與進(jìn)化分析的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守基序（Motif）進(jìn)行分析可以看出，同一亞家族內(nèi)保守基序的種類和數(shù)目相似度較高，不同亞家族成員之間保守基序差異較大，也從側(cè)面反映出進(jìn)化分析的可靠性。值得注意的是，NtWRKY53和AtWRKY53的保守基序的組織形式高度一致，提示兩者可能發(fā)揮著類似的生物學(xué)功能。

2.4 共線性分析

利用McScan X在默認(rèn)參數(shù)下對(duì)擬南芥基因組和普通煙草K326基因組進(jìn)行共線性分析（圖4）。At1～At5分別代表擬南芥的5條染色體，Nt01～Nt24代表普通煙草的24條染色體。結(jié)果表明，普通煙草NtWRKY53基因與擬南芥AtWRKY53基因在擬南芥和普通煙草基因組的共線性區(qū)塊中，存在共線性關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明所鑒定的普通煙草NtWRKY53基因與擬南芥AtWRKY53基因直系同源。

圖3 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化及保守基序分析Fig.3 Phylogenetic and conserved motifs analyses of NtWRKY53 transcription factor

圖4 普通煙草和擬南芥WRKY53基因的共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of WRKY53 gene between Nicotiana tabacum and Arabidopsis

2.5 NtWRKY53亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建了35S∷NtWRKY53-GFP融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染本氏煙草葉片，瞬時(shí)表達(dá)NtWRKY53-cGFP蛋白（圖5）。BF為明場(chǎng)，細(xì)胞核特異性染料DAPI指示細(xì)胞核。35S∷GFP為陰性對(duì)照，其GFP熒光信號(hào)遍布整個(gè)細(xì)胞。而融合NtWRKY53的GFP蛋白信號(hào)只能在細(xì)胞核中觀察到，并與細(xì)胞核染料DAPI的信號(hào)重疊，這說(shuō)明NtWRKY53是一個(gè)核定位蛋白，符合其轉(zhuǎn)錄因子的特性。

圖5 NtWRKY53的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of NtWRKY53

2.6 NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活分析

在擬南芥中，AtWRKY53被報(bào)道具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可調(diào)控下游基因表達(dá)［17-18］。在煙草中，對(duì)NtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活分析結(jié)果表明，GAL4BD-NtWRKY53（即融合表達(dá)NtWRKY53的酵母表達(dá)菌株）在顯色培養(yǎng)基（X/-Trp）上能夠正常生長(zhǎng)，并且顯示藍(lán)色，表明轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY53能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá)（圖6）。而GAL4BD對(duì)照酵母菌株在顯色培養(yǎng)基（X/-Trp）上不顯示藍(lán)色，說(shuō)明其不能激活報(bào)告基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄激活分析表明，NtWRKY53在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖6 NtWRKY53酵母轉(zhuǎn)錄激活分析Fig.6 Transactivation assay of NtWRKY53 in yeast

2.7 NtWRKY53基因的表達(dá)模式分析

采集普通煙草K326的不同組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，以莖組織中目的基因表達(dá)量為參考，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，NtWRKY53基因在莖（S）、根（R）、根尖（Rt）、幼葉（YL）和衰老葉片（SL）中表達(dá)，而在莖尖（St）中沒有檢測(cè)到目的基因表達(dá)（圖7 A）。值得注意的是，相對(duì)于幼葉煙草衰老葉片中NtWRKY53基因表達(dá)量顯著上調(diào)。

對(duì)NtWRKY53基因在非生物逆境脅迫條件下的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53基因的表達(dá)受多種非生物逆境脅迫的誘導(dǎo)（圖7 B）。在0.05 mol/L NaCl鹽脅迫下，NtWRKY53基因的表達(dá)量在處理6 h時(shí)達(dá)到對(duì)照（MOCK）的12.71倍左右，隨后下降。在干旱脅迫下，NtWRKY53基因的表達(dá)量也出現(xiàn)先上調(diào)，后下降的情況。而在冷脅迫和熱脅迫處理下，NtWRKY53基因的表達(dá)量逐漸下降。同時(shí)，激素脫落酸（ABA）處理下，NtWRKY53基因的表達(dá)也被誘導(dǎo)，在處理1 h后，表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的6.07倍，隨后下降。

對(duì)NtWRKY53基因在生物逆境脅迫條件下的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53基因的表達(dá)受多種生物脅迫的誘導(dǎo)（圖7 C）。在接種CMV（CMV-Fny）后，NtWRKY53基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，在接種3 d時(shí)達(dá)到對(duì)照的6.7倍，在接種5 d時(shí)其表達(dá)量有所下降。在接種黑脛病（Black Shank，BS）1 d時(shí)，NtWRKY53基因的表達(dá)量為對(duì)照的4.2倍，之后表達(dá)量下降。

3 討論

圖7 NtWRKY53基因的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression pattern analysis of NtWRKY53 gene

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在生物、非生物脅迫響應(yīng)以及植物生長(zhǎng)發(fā)育和葉片衰老等過(guò)程中起重要的調(diào)控作用［2］。本研究中鑒定并克隆到煙草中AtWRKY53的同源基因NtWRKY53。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53蛋白具有典型WRKY結(jié)構(gòu)域和Cys2HisCys型鋅指結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析和共線性分析發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53與擬南芥AtWRKY53直系同源。同時(shí)，AtWRKY53與NtWRKY53保守基序的類型和組織結(jié)構(gòu)高度類似，暗示其生物學(xué)功能可能有較強(qiáng)的一致性。亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)果表明，NtWRKY53定位在細(xì)胞核中并且具有轉(zhuǎn)錄激活活性，表明NtWRKY53可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)功能。

本研究中發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53同擬南芥AtWRKY53、水稻OsWRKY53、小麥TaWRKY53b和紫花針茅SpWRKY53結(jié)構(gòu)域高度相似且在進(jìn)化關(guān)系上同源，表明這些同源基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子可能承擔(dān)類似的生物學(xué)功能。值得注意的是，AtWRKY53、TaWRKY53b、SpWRKY53基因在衰老葉片中上調(diào)表達(dá)，而過(guò)表達(dá)AtWRKY53、SpWRKY53基因能夠分別促進(jìn)擬南芥和紫花針茅的葉片衰老過(guò)程［19-20，35］。在煙草中NtWRKY53基因在衰老葉片中表達(dá)量較高，暗示其參與煙草葉片衰老、落黃的調(diào)控過(guò)程。另外，在擬南芥等物種中，AtWRKY53、OsWRKY53基因分別能夠被丁香假單胞菌和稻瘟病接種誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá)OsWRKY53水稻株系對(duì)稻瘟病的抗性明顯增強(qiáng)，并且低溫和鹽脅迫等非生物脅迫以及玉米紋枯病均能顯著誘導(dǎo)ZmWRKY53的表達(dá)［21-22，35］。本研究中還發(fā)現(xiàn)，NtWRKY53基因能夠被鹽脅迫、干旱脅迫、CMV和黑脛病病原物所誘導(dǎo)，暗示在煙草中NtWRKY53基因很可能參與多種生物、非生物逆境的響應(yīng)和調(diào)控過(guò)程。而有關(guān)利用過(guò)表達(dá)、基因編輯等手段揭示NtWRKY53基因功能方面還有待深入研究。

4 結(jié)論

通過(guò)比較基因組學(xué)的方法從普通煙草K326中克隆到NtWRKY53基因。NtWRKY53基因可編碼典型WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并且是擬南芥AtWRKY53的同源基因。而NtWRKY53是核定位的轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，NtWRKY53基因的表達(dá)具有明顯的組織和時(shí)間特異性，在衰老、落黃的煙草葉片中表達(dá)量較高。NtWRKY53基因受到鹽脅迫和干旱脅迫的誘導(dǎo)，參與了干旱和鹽脅迫的逆境響應(yīng)。接種CMV和黑脛病后，NtWRKY53基因表達(dá)量顯著上調(diào)，NtWRKY53基因同樣也參與了相應(yīng)的生物脅迫的逆境響應(yīng)。