任英俊 鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南省鄭州市 450000

卵巢癌是最常見的女性生殖器官惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性生命健康[1]。目前，外科手術聯(lián)合化療是卵巢癌的主要治療方法。順鉑是常用的化療藥物，臨床用于卵巢癌、食道癌、宮頸癌等實體腫瘤均有一定療效，但其存在神經(jīng)、血液等方面毒副作用，且易產(chǎn)生耐藥性，嚴重影響化療效果甚至導致化療失敗[2]。因此，尋找新的抗腫瘤化療輔助藥物，以改善順鉑耐藥性，增強化療效果，對臨床提高卵巢癌患者生存率非常必要?？鄥⑺ǖ闹饕煞譃榭鄥⒖倝A，苦參堿是從苦參中提取的一種生物堿，多項研究證實，苦參堿具有抗腫瘤作用，并且能夠逆轉化療藥物的耐藥性，減輕化療藥物毒副作用及增強其化療效果的作用[3]。本研究探索不同濃度苦參栓對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響，分析苦參栓聯(lián)合順鉑對SKOV3細胞增殖抑制及促凋亡作用，旨在為卵巢癌臨床化療用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 卵巢癌SKOV3細胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司，苦參栓(1.5g/粒，含氧化苦參堿100mg)來自陜西摩美得制藥有限公司，順鉑來自廣東嶺南制藥有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于Thermo Fisher Scientific公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜溶液(DMSO)、碘化丙啶(PI)購于Sigma公司，兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體購于美國LifeSpan Biosciences公司，CytoFLEX流式細胞儀來自貝克曼庫爾特公司，SpectraMax iD5多功能酶標儀來自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：取SKOV3細胞在37℃水浴鍋中復蘇后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃，5%CO2恒溫無菌培養(yǎng)箱。待細胞生長至80%融合時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 MTT實驗及分組：取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板中，分別加入苦參栓濃度0g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L，MLL實驗檢測苦參栓對SKOV3細胞的最佳凋亡濃度。結果顯示：不同濃度苦參栓處理的SKOV3細胞培養(yǎng)48h后均表現(xiàn)出對細胞增殖的抑制作用，其中1.5g/L的細胞抑制率高于0.5g/L和1.0g/L(P<0.05)，與2.0g/L的細胞抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，1.5g/L為最佳濃度。將SKOV3細胞分為4組：A組(添加生理鹽水作為對照組)；B組(添加順鉑，濃度3μg/L)；C組(添加苦參栓，最佳濃度1.5g/L)；D組(添加順鉑聯(lián)合苦參栓最佳濃度，順鉑3μg/L+苦參栓1.5g/L)。采用MTT法檢測各組細胞增殖情況：取各組SKOV3細胞，以1×104/孔接種于96孔板中，37℃，5%CO2恒溫無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，分別加入20μg MTT溶液，震蕩混勻，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育4h，棄上清，分別加入DMSO溶液200μl，震蕩反應1min至晶體完全溶解。使用SpectraMax iD5多功能酶標儀檢測各組細胞在570nm波長處吸光度值(OD值)。計算細胞抑制率[抑制率=(對照組OD值-藥物各組OD值)/對照組OD值×100%]。每組細胞設置3次實驗重復。

1.2.3 流式細胞術：采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。取各組SKOV3細胞，以1×104/孔接種于96孔板中，37℃，5%CO2恒溫無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，分別加入胰酶消化，收集細胞，用PBS沖洗細胞后，加入70%低溫乙醇，4℃下固定2h，PBS沖洗并調整細胞濃度1×106個/ml，加入150μl PI避光染色30min，使用300目尼龍網(wǎng)過濾細胞，CytoFLEX流式細胞儀分析細胞周期及凋亡率。

1.2.4 Western blot：采用Western blot檢測各組細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平。試劑盒法提取細胞總蛋白，SDS-PAGE分離目的蛋白，轉膜，封閉2h，分別加入兔抗人Bcl-2抗體(1∶500)、兔抗人Bax抗體(1∶500)及內參β-Actin抗體(1∶1 000)，4℃低速震蕩過夜，洗膜，加入1∶10 000稀釋比例的辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2h，洗膜。加入顯色液顯色，凝膠系統(tǒng)下掃描、成像，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度，計算目的蛋白表達量(目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/內參β-Actin灰度值)。

1.3 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學軟件SPSS22.0用于數(shù)據(jù)分析，計量資料用平均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析(F)檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同分組細胞增殖情況 B、C、D組處理均對SKOV3細胞增殖有抑制作用，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組細胞抑制率高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組處理對SKOV3細胞的抑制率最高。見表1。

表1 不同處理對細胞增殖的抑制率

2.2 不同分組細胞周期變化 與A組比較，B、C、D組G1/G0期細胞百分比均升高，S期和G2/M期細胞百分比均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組G1/G0期、S期、G2/M期細胞百分比與B組和C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同分組SKOV3細胞周期變化

2.3 不同分組細胞凋亡情況 與A組相比，B、C、D組SKOV3細胞凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組SKOV3細胞凋亡率高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 不同分組細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平 與A組比較，B、C、D組細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組細胞中Bcl-2蛋白表達水平低于B組和C組，Bax蛋白表達水平高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 不同分組SKOV3細胞凋亡情況

表4 不同分組細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達量

3 討論

順鉑是卵巢癌化療中常用的藥物，但隨著其廣泛應用，腫瘤細胞對其敏感性逐漸降低，耐藥性增強，因此增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性成為提高卵巢癌治療療效的關鍵[4]。苦參堿注射液輔助宮頸癌化療具有較好的增敏效果，提高患者生活質量[5]?？鄥A抗腫瘤機制主要表現(xiàn)在：抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲和轉移、逆轉腫瘤細胞耐藥性等[6]。

無限增殖是腫瘤細胞的顯著特點之一，抑制腫瘤細胞增殖是抗腫瘤藥物的主要作用[7]。研究表明，苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞、肝癌HepG2細胞等多種腫瘤細胞的增殖具有一定抑制作用[8]。本研究表明，1.5g/L苦參栓對卵巢癌SKOV3細胞的抑制率達45.73%，低于2.0g/L苦參栓作用且差異無統(tǒng)計學意義，因此選擇1.5g/L苦參栓為體外抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖的最佳濃度，進一步探究其聯(lián)合順鉑對卵巢癌SKOV3細胞增殖和凋亡的影響。

本研究結果顯示，苦參栓和順鉑單獨處理卵巢癌細胞均對細胞增殖具有一定抑制作用，但兩者聯(lián)合使用對細胞增殖的抑制率明顯高于其單獨使用，說明苦參栓能夠增強順鉑對細胞增殖的抑制。本研究通過流式細胞術分析不同處理對卵巢癌SKOV3細胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，苦參栓和順鉑處理后G1/G0期細胞百分比明顯升高，且兩者聯(lián)合處理組G1/G0期細胞百分比最高，說明苦參栓和順鉑可誘導SKOV3細胞G1/G0期阻滯，導致DNA合成受阻而抑制細胞增殖，且兩者聯(lián)合效果最顯著。

細胞凋亡是機體清除受損、突變、衰老細胞的重要方式，臨床研究認為，細胞凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的重要原因，而抗腫瘤藥物的作用之一就是誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，苦參栓和順鉑處理后SKOV3細胞出現(xiàn)明顯凋亡，且聯(lián)合使用苦參栓和順鉑處理細胞凋亡率最高。苦參栓和順鉑處理后SKOV3細胞中Bcl-2蛋白表達降低，而Bax蛋白表達升高，且兩者聯(lián)合使用對細胞中Bcl-2和Bax蛋白水平影響最大。說明苦參栓和順鉑可能通過改變細胞凋亡相關蛋白誘導腫瘤細胞凋亡，與王東暉等研究結果一致[9]。

綜上所述，苦參栓和順鉑均能抑制SKOV3細胞增殖，促進其凋亡，兩者聯(lián)合使用效果更顯著，提示苦參栓用于卵巢癌化療輔助治療具有一定價值。