連瓊宇，李照然，兗攀，姜繼元，葉春秀

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院林園所,新疆 石河子 832000)

文冠果(XanthocerassorbifoliaBunge)屬無患子科(Sapindus Linn.)文冠果屬(XanthocerasBunge)的落葉灌木或小喬木，素有“千花一果”稱號。種子黑褐色，種仁含油率高[1]。文冠果木材紋理致密,是制作家具、農(nóng)具和手工藝品的好材料。文冠果樹形優(yōu)美，是園林綠化及蜜源植物，其具有很高的觀賞價值和生態(tài)效益[2]。主要自然分布區(qū)為暖溫帶大陸性氣候區(qū)，以內(nèi)蒙古、河北、河南、山西、陜西、甘肅6省(區(qū))的資源較多，其根系發(fā)達、保水力強，耐干旱、嚴寒和貧瘠，是山區(qū)綠化、退耕還林和防風(fēng)固沙的首選生態(tài)樹種，具有巨大的開發(fā)和利用潛能[3]。近年來其引種范圍越來越大，在生態(tài)利用與保護方面的價值也發(fā)揮得越來越充分[4],在引種研究過程中，相關(guān)研究[5]表明低溫脅迫是文冠果引種過程中需要考慮的重要生態(tài)因子，低溫不僅導(dǎo)致生長受到嚴重損害，甚至導(dǎo)致植株死亡。植物在低溫脅迫下，膜脂相變及膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量升高[6]，細胞膜透性增大[7]，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸)積累保護酶活性升高[8]。目前對于植物抗寒性研究主要集中在楊樹(PopulusL.)、杏(ArmeniacavulgarisLam.)、李(PrunussalicinaLindl.)等樹種，對于文冠果抗寒性的研究較少[9-11]。曾祥謂對文冠果連續(xù)3 a進行了抗寒性測定，發(fā)現(xiàn)其葉片相對含水率82%，抗寒性能力中等[12]；曹振嶺等[13]證實文冠果能經(jīng)受-35.3 ℃的特大凍害；馬新等[5]發(fā)現(xiàn)低溫傷害使文冠果細胞膜的透性增大，細胞內(nèi)形成大量可溶性物質(zhì)增加滲透勢，參與植物的抗寒過程。曹振嶺等[14]提出引種文冠果時要注意緯度不跨越過大，距離越遠，引種成功的機率越低。本研究在前期形態(tài)學(xué)等指標(biāo)篩選的基礎(chǔ)上，篩選出6個性狀表現(xiàn)優(yōu)異的株系進一步分析其抗寒性，以期為文冠果是否能在石河子地區(qū)進行種植和推廣作出科學(xué)評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗設(shè)在新疆農(nóng)墾科學(xué)院林園所試驗地，位于新疆石河子市(44°17′N，85°51′E)，屬典型的溫帶大陸性氣候，日照時間長，冬季長而嚴寒，夏季短而炎熱，地處天山北麓中段，準(zhǔn)噶爾盆地南部，平均海拔高度450.8 m，年平均氣溫7.5～8.2 ℃，年日照時數(shù)2 721～2 818 h，空氣干燥。年降水量180～270 mm，年蒸發(fā)量1 000～1 500 mm，無霜期168～171 d。試驗地土壤為灌耕灰漠土，耕層為0～20 cm，有機質(zhì)16.7 g/kg，全氮1.13 g/kg，速效磷23.87 mg/kg，速效鉀246.8 mg/kg。

1.2 材料采集及處理

在前期形態(tài)學(xué)指標(biāo)的分析及主成分綜合評價篩選出‘G 27’‘BD特異’‘G 13’‘株系2’‘建2’‘BD 12’這6個文冠果的株系作為抗寒性試驗材料。于2019年11月下旬采集1 a枝條，每個株系采集30個枝條，將采集的枝條用自來水沖洗其表面塵埃，然后用蒸餾水沖洗3遍，用吸水紙吸干水分后剪成長度10 cm的小段，貼上標(biāo)簽放入密封袋保存?zhèn)溆?。? ℃為對照，設(shè)置-10、-20、-30 ℃低溫梯度在人工氣候箱中進行低溫脅迫處理，每個溫度脅迫12 h，然后置于溫度為4 ℃的冰箱中保存解凍，進行生理生化指標(biāo)的測定。

1.3 生理指標(biāo)測定及方法

相對電導(dǎo)率測定參照蔡永萍[15]、高風(fēng)俊[16]的方法，處理后的枝條去除分節(jié)部位，剪去節(jié)間部位，將樣品剪成0.1 cm的小段并混合，取0.1 g放入錐形瓶，加入蒸餾水50 mL，室溫浸泡12 h；用DDS-12A型電導(dǎo)儀測定蒸餾水電導(dǎo)率(SCK)，測定各樣品浸提液的電導(dǎo)率(S1)；隨后所有樣品置于沸水浴處理30 min，恢復(fù)到室溫；測定煮沸后的電導(dǎo)率(S2)，以(1)的公式計算其相對電導(dǎo)率(REC)。各材料每處理各設(shè)3次重復(fù)，用相對電導(dǎo)率結(jié)合Logistic方程計算每份材料的半致死溫度(LT50)。

采用MDA、TP、PRO、POD、SOD活性測定試劑盒進行測定，參照試劑盒說明書進行提取和測定操作，根據(jù)測定的吸光值計算不同指標(biāo)的含量，各指標(biāo)設(shè)定3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

相對電導(dǎo)率(REC)按以下公式進行計算，然后擬合Logistic方程，計算各材料的半致死溫度(LT50)[23]；

相對電導(dǎo)率(%)=S1/S2×100%

①

②

式②中：y為電導(dǎo)率；K為曲線漸近線，即為最大電解質(zhì)滲出率；α、b均為方程參數(shù)；求曲線的拐點(lna/b)，即為低溫半致死溫度(LT50)。利用Excel 2007對其它數(shù)據(jù)進行處理和方差分析。

利用隸屬函數(shù)值對實驗材料抗寒性進行綜合評價。其抗寒性綜合評價隸屬函數(shù)值的計算公式如下，與抗寒性呈正相關(guān)的指標(biāo)的隸屬函數(shù)值用公式③計算，與抗寒性呈負相關(guān)的指標(biāo)的隸屬函數(shù)值用公式④計算，具體如下:

各指標(biāo)與抗性成正相關(guān)，則

各指標(biāo)與抗性成負相關(guān)，則

式中，U(Xi)為隸屬函數(shù)的大小，Xi為各指標(biāo)的當(dāng)測值；Xmax為指標(biāo)最大值；Xmin為指標(biāo)最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對不同株系電導(dǎo)率的影響

在不同低溫的脅迫下，6個文冠果株系的電導(dǎo)率呈現(xiàn)不同的變化(圖1)，‘株系2’‘G 13’‘BD特異’‘G 27’‘建2’這5個株系枝條相對電導(dǎo)率值隨著溫度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，株系‘BD 12’隨著溫度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在-20 ℃達到最大，為36.24%，溫度從4 ℃降到-10 ℃時相對電導(dǎo)率值增加速度較慢；‘株系2’在-10 ℃相對電導(dǎo)率達到最大，為60.92%；溫度從-10 ℃降到-20 ℃時‘G 13’‘BD 12’‘G 27’‘建2’這4個株系相對電導(dǎo)率大幅增加，均在-20 ℃達到最大值，分別為59.69%、36.24%、32.70%、31.58%；溫度從-20 ℃降到-30 ℃時6個株系組織細胞全部死亡，組織液完全滲出，相對電導(dǎo)率值均呈現(xiàn)下降的趨勢，最高電導(dǎo)率與4 ℃差值的大小從大到小依次為‘G 13’>‘G 27’>‘BD 12’>‘BD特異’>‘建2’>‘株系2’。

圖1 不同株系低溫處理下相對電導(dǎo)率變化Fig.1 Changes of relative conductivities of branches from different strains under low temperature stress

2.2 各株系半致死溫度(LT50)

在抗寒性的研究過程中，半致死溫度可以在一定程度上衡量植物的抗寒性[17-18]。6個文冠果株系的相對電導(dǎo)率用Logistic方程擬合后，所得的半致死溫度見表1。

表1 不同株系文冠果低溫處理下的半致死溫度(LT50)Tab.1 LT50 of branches from different material under low temperature treatments

所有材料的Logistic方程擬合度均達到了0.5以上，可以顯示6個株系的半致死溫度，其從高到低依次為‘株系2’>‘G 13’>‘建2’>‘BD 12’>‘G 27’>‘BD特異’，其中‘株系2’‘G13’‘建2’的半致死溫度在-10 ℃以上，其余3個株系的半致死溫度在-10 ℃以下，‘株系2’的半致死溫度最高為-2.64 ℃，‘BD特異’的半致死溫度最低為-13.27 ℃。結(jié)合相對電導(dǎo)率初步分析，‘BD特異’的抗寒性在6個株系中最強。

2.3 低溫脅迫對不同株系丙二醛(MDA)的影響

在植物受到低溫脅迫時細胞內(nèi)的代謝平衡會遭到破壞，導(dǎo)致對細胞膜結(jié)構(gòu)和膜上相關(guān)大分子有害的活性氧和自由基大量積累，丙二醛是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，大量丙二醛與蛋白質(zhì)結(jié)合將會引起膜蛋白變性，最終導(dǎo)致生物膜嚴重損傷[19]，組織內(nèi)丙二醛的含量越高，組織抗寒性越差，所以丙二醛的含量是抗寒性評價的重要指標(biāo)[17，20]。

如圖2所示，6個文冠果株系在不同梯度低溫的脅迫下，枝條內(nèi)的丙二醛含量均隨著溫度的下降逐漸上升。在達到半致死溫度之前，枝條內(nèi)丙二醛的含量上升較緩慢，當(dāng)?shù)陀诎胫滤罍囟戎?，枝條丙二醛的含量隨著溫度的下降而大幅增加，‘BD特異’和‘建2’低溫達到-10 ℃至-15 ℃之間，枝條的丙二醛合量幾乎不再變化；‘BD特異’的枝條丙二醛含量在-10 ℃達到最大，為1.847 μmol/g；‘G 13’‘BD 12’‘G 27’‘建2’‘株系2’的枝條丙二醛含量在-20℃達到最大，分別為1.300、1.217、1.473、1.308、1.543 μmol/g。根據(jù)丙二醛最大含量與4 ℃差值排序得到從大到小依次為‘G 13’>‘株系2’>‘G27’>‘BD12’>‘建2’>‘BD特異’。‘BD特異’各溫度下丙二醛含量最高且與其他株系差異顯著，判斷‘BD特異’‘建2’這2個株系的抗寒性相較其他株系較強。

圖2 不同株系文冠果低溫處理下的丙二醛含量變化Fig.2 Changes of alondialdehyde content of branches from different strains under low temperature stress

2.4 低溫脅迫對不同株系可溶性蛋白(TP)的影響

可溶性蛋白是親水膠體，可在低溫脅迫下降低原生質(zhì)因結(jié)冰而導(dǎo)致的對細胞的傷害，保持細胞內(nèi)水分。因此，低溫脅迫下植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量也是衡量植物抗寒性的重要指標(biāo)[17，21]。如圖3所示，在不同低溫的脅迫下，6個文冠果株系的可溶性蛋白呈現(xiàn)不同的變化趨勢，‘BD特異’‘株系2’‘G 27’‘BD 12’這4個株系枝條可溶性蛋白值隨著溫度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中‘株系2’‘BD特異’這兩個株系枝條在-10 ℃達到最大分別為3.920、4.137 g/L；‘G27’‘BD 12’這2個株系枝條在-30 ℃達到最大，分別為3.386、3.410 g/L；‘建2’‘G 13’這2個株系可溶性蛋白值隨著溫度的降低呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在-30 ℃達到最大，分別為3.873 g/L。6個株系可溶性蛋白最大含量與4 ℃差值的大小從大到小依次為：‘BD特異’>‘G 13’>‘BD 12’>‘BD 12’>‘G 27’>‘株系2’>‘建2’，可初步推斷‘BD特異’受到低溫脅迫時可溶性蛋白含量上升最快，抗寒性最強。

圖3 不同株系文冠果的低溫處理下可溶性蛋白變化Fig.3 Changes of soluble protein content of branches from different strains under low temperature stress

2.5 低溫脅迫對不同株系脯氨酸(PRO)含量的影響

脯氨酸在植物的抗逆生理代謝過程中，是提供代謝原料和能量的一種重要內(nèi)含物質(zhì)，可以抵抗?jié)B透脅迫，脯氮酸在枝條中含量的高低及變化趨勢是枝條抗寒性的一種主要體現(xiàn)[20]。如圖4所示，在不同低溫的脅迫下，6個文冠果株系的脯氨酸含量呈現(xiàn)不同的變化，‘BD特異’‘株系2’‘建2’這3個株系枝條脯氨酸含量值隨著溫度的降低呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，‘BD 12’‘G 27’‘G 13’這3個株系枝條脯氨酸含量隨著溫度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢?！瓸D特異’‘株系2’‘G 13’‘BD 12’‘G 27’這5個株系枝條中的脯氮酸中含量在-30 ℃達到最大，分別為1.847、1.687、1.857、1.437、1.993 ug/mg，‘建2’枝條中的脯氮酸中含量在-10 ℃達到最大為1.483 ug/mg。

圖4 不同株系文冠果的低溫處理下脯氨酸含量變化Fig.4 Changes of proline content of branches from different strains under low temperature stress

2.6 低溫脅迫下不同株系超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

植物在受到低溫脅迫時超氧化物歧化酶能夠調(diào)節(jié)細胞膜的透性，有效地清除活性超氧自由基，保護細胞不被傷害并維持正常的代謝，保護細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定[21-22]。在不同低溫脅迫下，6個不同株系的超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)不同的變化趨勢(圖5)，其中‘BD特異’‘株系2’‘G 13’‘G 27’的超氧化物歧化酶活性值隨著溫度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，‘株系2’‘BD 12’枝條的超氧化物歧化酶活性隨著溫度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。‘BD特異’‘G 13’‘G 27’‘建2’的超氧化物歧化酶在-10 ℃達到最大值，分別為25.777、17.013、19.507、16.330 U/mg，‘BD 12’枝條在-30 ℃達到最大為12.513 U/mg，‘株系2’枝條在-20 ℃達到最大為21.873 U/mg。根據(jù)最高SOD含量與4 ℃差值的大小從大到小依次為‘株系2’‘BD特異’>‘G 27’>‘G 13’>‘建2’>‘BD 12’，初步推斷‘BD特異’‘G 27’‘株系2’的文冠果枝條抗寒性較強。

圖5 不同株系文冠果低溫處理下的超氧化物歧化酶活性變化Fig.5 Changes of content of superoxide dismutase of branches from different strains under low temperature stress

2.7 低溫脅迫下不同株系過氧化物酶(POD)活性變化趨勢

過氧化物酶清除細胞內(nèi)氧化還原產(chǎn)生的H2O2等過氧化物，在抗氧化防御系統(tǒng)中有非常重要的位置[21-22]。

如圖6所示，在不同低溫的脅迫下，過氧化物酶活性呈現(xiàn)不同的變化，6個株系枝條的過氧化物酶活性隨著溫度的降低呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢?！晗?’‘BD 12’‘G 13’‘建2’在受到低溫脅迫過程中整體活力與4 ℃相比呈現(xiàn)下降趨勢，都受到了低溫脅迫的影響?！瓸D特異’‘G 27’枝條在受到低溫脅迫時，過氧化物酶活性最大值相對4 ℃分別增加了0.48、1.45，抗寒性較強。6個株系枝條過氧化物酶活性的最高值與4 ℃的差值從大到小依次是‘G 27’>‘BD特異’>‘BD 12’>‘株系2’>‘建2’>‘G 13’，初步推斷‘BD特異’‘G 27’抗寒性較強。

2.8 不同材料各單項抗寒指標(biāo)的隸屬度值與綜合抗寒性的關(guān)系

植物的抗寒能力是一個綜合的表現(xiàn)，不是靠單一的指標(biāo)就能得出來的結(jié)果。因此采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法來對6個文冠果株系的抗寒性的強弱進行綜合評價，綜合評價排序越靠前，抗寒性越強。評價指標(biāo)中電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶與抗寒性成正相關(guān)，丙二醛與抗寒性成負相關(guān)[20-25]。從表2可以看出，6個文冠果株系相對隸屬函數(shù)值的大小順序為：‘BD特異’>‘株系2’>‘G 27’>‘建2’>‘G 13’>‘BD 12’，結(jié)合半致死溫度及各項生理指標(biāo)、形態(tài)指標(biāo)分析結(jié)果，篩選出‘BD特異’這個株系在物候期、形態(tài)學(xué)指標(biāo)、抗寒性各個方面均表現(xiàn)很好，綜合評價生長適應(yīng)性最好，可以作為優(yōu)良株系進行繁殖推廣。

表2 不同株系文冠果的抗寒性指標(biāo)隸屬值Tab.2 Subordination values of cold resistance indexes of different materials

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

在鑒定植物抗寒性時，相對電導(dǎo)率是一種較為直觀的表示植物在低溫脅迫下細胞質(zhì)膜透性變化的方法，細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與植物抗寒性存在密切關(guān)系，其直接反映植物受害程度[26-28]，電解質(zhì)外滲率結(jié)合Logistic曲線方程推導(dǎo)半致死低溫能準(zhǔn)確地反映植物耐受的低溫極限[23-24]。多數(shù)研究認為電導(dǎo)率與植物抗寒性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[20-21]。通過測定分析發(fā)現(xiàn)：在不同低溫的脅迫下，6個文冠果株系的電導(dǎo)率呈現(xiàn)不同的變化，6個株系的半致死溫度從高到低依次為‘株系2’>‘G 13’>‘建2’>‘BD 12’>‘G 27’>‘BD特異’，其中‘株系2’的半致死溫度最高為-2.64 ℃，‘BD特異’的半致死溫度最低為-13.27 ℃，可初步推斷‘BD特異’的抗寒性最強。

活性氧超過正常水平時，可導(dǎo)致膜脂過氧化、蛋白質(zhì)變性等一系列不良反應(yīng)。丙二醛是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，常作為反映生物膜受傷害程度的指標(biāo)[25-29]。6個文冠果株系在不同梯度低溫的脅迫下，枝條內(nèi)的丙二醛含量均隨著溫度的下降逐漸上升。在達到半致死溫度之前，枝條內(nèi)丙二醛的含量上升較緩慢，當(dāng)?shù)陀诎胫滤罍囟戎?，枝條丙二醛的含量隨著溫度的下降而大幅增加，這與馬新等人對文冠果抗寒性的研究結(jié)果一致[5，13]。

SOD和POD等保護酶系統(tǒng)在低溫條件下積極發(fā)揮作用，減輕由膜脂過氧化所引起的膜傷害，SOD能清除超氧陰離子自由基，而POD能清除產(chǎn)生的過氧化氫[22-23]?？扇苄缘鞍卓梢哉{(diào)節(jié)細胞的滲透勢，同時也使細胞的水合度增大，保水能力增強，降低細胞結(jié)冰的溫度[20-31]。多數(shù)研究認為低溫脅迫下可溶性蛋白、超氧化物歧化酶、過氧化物酶與植物抗寒性正相關(guān)[32-34]，‘BD特異’各溫度下丙二醛、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶含量均隨著溫度的降低出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與馬新等[5]對文冠果抗寒性研究結(jié)果一致。

隸屬函數(shù)法作為能夠綜合所有指標(biāo)對植物抗寒性進行綜合評價的一種方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于長柄扁桃(AmygdaluspedunculataL.)、木瓜(ChaenomelessinensisKoehne)等植物的抗寒性評價[34-36]。文冠果株系相對隸屬函數(shù)值的大小順序為：‘BD特異’>‘株系2’>‘G 27’>‘建2’>‘G 13’>‘BD 12’，綜合抗寒性生理生化指標(biāo)、物候期適應(yīng)性和形態(tài)學(xué)指標(biāo)篩選，最終篩選出‘BD特異’這個株系，其在開花結(jié)實能力，抗寒性各個方面均表現(xiàn)很好，綜合評價生長適應(yīng)性最好，可以作為優(yōu)良株系進行繁殖推廣。

3.2 結(jié)論

通過前期的形態(tài)學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果，結(jié)合抗寒性研究結(jié)果得出：(1)6個文冠果株系的電導(dǎo)率呈現(xiàn)不同的變化，半致死溫度從高到低依次為‘株系2’>‘G 13’>‘建2’>‘BD 12’>‘G 27’>‘BD特異’，其中‘株系2’的半致死溫度最高，為-2.64 ℃，‘BD特異’的半致死溫度最低，為-13.27℃，可初步推斷‘BD特異’的抗寒性最強。(2)6個文冠果株系枝條內(nèi)的丙二醛含量均隨著溫度的下降逐漸上升，在達到半致死溫度之前，枝條內(nèi)丙二醛的含量上升較緩慢；當(dāng)?shù)陀诎胫滤罍囟戎螅l中丙二醛的含量隨著溫度的下降而大幅增加。(3)‘BD特異’在各溫度下其丙二醛、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶含量均隨著溫度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。(4)文冠果6個株系相對隸屬函數(shù)值的大小順序為：‘BD特異’>‘株系2’>‘G 27’>‘建2’>‘G 13’>‘BD 12’。最終篩選出‘BD特異’這個株系在各個方面均表現(xiàn)很好，綜合評價生長適應(yīng)性最好，既可作為油料樹種備選株系，又可作為生態(tài)樹種備選株系，在新疆石河子地區(qū)進行進一步推廣種植。