邵萌 ，吳芳，張杰，董江濤，柳小玲，吳江東，章樂，趙海軍*，張萬江*

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的嚴重危害人類健康的世界性傳染病。2015—2018 年全球結核病死亡總人數(shù)減少了11%，卻未實現(xiàn)2020 年減少35%這一終結結核病戰(zhàn)略里程碑目標的1/3［1］。可見結核病的預防和診治任務依然艱巨。目前，雖然唯一批準并被廣泛應用的卡介苗（BCG）對兒童粟粒性結核病和結核性腦膜炎的預防效果較好，但其對成人的保護率很不穩(wěn)定（0～80%）［2］，保護期只能維持約15 年［3］，因此研發(fā)新的結核病疫苗來替代或促進BCG 的長久保護十分必要。

本課題組前期利用原生質(zhì)體技術及電穿孔技術，以BCG 和結核分枝桿菌國際標準無毒株——H37Ra 菌株（以下簡稱H37Ra 菌株）為親本，構建及選育的新型結核病疫苗菌株——B/R 菌株（詳細制備方法已申請國家發(fā)明專利，專利申請?zhí)?019100713800，公布號CN109825497A）在使用的安全性、毒性、定殖能力及傳代穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出較好的候選結核病疫苗的潛能［4-5］。不可忽略的是，T 淋巴細胞特異性免疫應答是評價結核病疫苗保護效果的重要指標，其主要特征是免疫記憶和特異性［6］，因此，該研究以B/R 菌株為研究對象，比較BCG、H37Ra 菌株和B/R 菌株分別免疫小鼠后，在遇到相同抗原刺激時，對T 淋巴細胞免疫記憶的影響，并進一步探討B(tài)/R 菌株誘導的特異性細胞免疫應答類型，以及T 淋巴細胞的增殖能力，為B/R 菌株作為新型結核病疫苗的臨床前研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 BCG 和H37Ra 菌株由中國食品藥品檢定研究院提供，B/R 菌株由本研究室構建保存。

1.2 實驗動物 2019 年1 月，選取6～8 周齡、SPF 級雌性C57BL/6 小鼠48 只，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物研究中心，飼養(yǎng)于石河子大學醫(yī)學院實驗動物中心，每籠3～5 只，自由飲食，定期通風消毒。研究按國家實驗動物學會的指導方針進行。

1.3 主要試劑 小鼠脾淋巴細胞分離液試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，1640 培養(yǎng)基購自HyClone 公司，胎牛血清購自Gibco 公司，CFSE、anti-CD28、Anti-Mouse CD4PE-Cy5、Anti-Mouse CD8a PE-Cy5、Anti-Mouse CD62L PE、Anti-Human/Mouse CD44FITC 購 自eBioscience 公 司，Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4 ELISA Kit 購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司。

1.4 動物分組及免疫方案 48 只小鼠隨機分為磷酸鹽緩沖液（PBS）組、BCG 組、H37Ra 組和B/R 菌株組，各12 只。BCG 組、H37Ra 組和B/R 菌株組分別取0.1 ml新鮮制備的菌懸液（含菌量為1.0×106CFU）背部皮下注射，均免疫1 次，PBS 組注射等體積的PBS。4 組分別于免疫后8、12、16 周各取3 只小鼠檢測記憶性T 淋巴細胞的分型和抗原特異性細胞因子，免疫后16 周各取3 只小鼠檢測T 淋巴細胞的增殖能力。

1.5 小鼠脾淋巴細胞的分離及制備 無菌條件下根據(jù)小鼠脾臟淋巴細胞提取試劑盒說明書，采用密度梯度離心法提取脾淋巴細胞；將吸出的淋巴細胞轉移至15 ml離心管，加預冷PBS 至8 ml，1 500 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清，重復2 次；1 ml RPMI-1640 完全培養(yǎng)基重懸脾淋巴細胞，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml，臺盼藍染色觀察活細胞率97%以上。

1.6 流式細胞技術檢測T 淋巴細胞的分型及數(shù)量 將提取的各組脾淋巴細胞，加入24 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔含5×106個細胞，分別加入20 μl anti-CD28mcAb 工作液，并以結核菌素純蛋白衍生物（PPD）作為特異性抗原進行刺激，終濃度為10 μg/ml，加RPMI-1640 完全培養(yǎng)基至1 ml；細胞培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)72 h 后收集各組細胞，2 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液，100 μl PBS 重懸后分別加入CD4/CD8a、CD44、CD62L 熒光標記抗體，同時設置空白管、單標管，4 ℃避光孵育30 min；經(jīng)PBS 洗滌后加350 μl PBS 重懸細胞，上機檢測；檢測結果以CD4/CD8a、CD44、CD62L 為分選標記，分別檢測、T 淋巴細胞的中央型T 淋巴細胞（TCM，包含CD62Lhi、CD44hi）和效應型T 淋巴細胞（TEM，包含水平，見圖1，即先根據(jù)細胞的大小和折光分類圈出淋巴細胞群（圖中以LYM 表示），再根據(jù)PE-Cy5 熒光染料標記的或圈出相對應的T 淋巴細胞群（圖中分別以或表示），再從圈出的或群中，根據(jù)PE 熒光標記的CD62L 和FITC 熒光標記的CD44的表達高低圈出TCM和TEM。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測脾淋巴細胞分泌的抗原特異性Th1/Th2 型細胞因子 在24 孔板中加入各組脾淋巴細胞（5×106/孔），并加入終濃度為10μg/ml 的PPD 進行刺激，添加RPMI-1640 完全培養(yǎng)基至1 ml，置于細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 時收集脾淋巴細胞上清用于檢測白介素2（IL-2），培養(yǎng)72 h 時的上清用于干擾素γ（IFN-γ）和白介素4（IL-4）檢測。實驗步驟根據(jù)各檢測試劑盒說明書進行操作，在波長450 nm 處檢測光密度（OD）值。

圖1 和記憶性T 淋巴細胞流式結果圈門示意圖Figure 1 Circled diagram of memory and T cells detected using flow cytometry

1.8 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）標記法檢測T 淋巴細胞增殖情況 按上述方法提取小鼠脾淋巴細胞，用含1% BSA 的1 ml PBS 重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml，每毫升細胞懸液中加入1 μl CFSE 工作液，使其終濃度為5 μM，室溫避光孵育10 min；加5 ml RPMI-1640 完全培養(yǎng)基終止反應，冰上繼續(xù)孵育5 min；完全培養(yǎng)基洗滌3 次，1 ml 重懸細胞，分別加入至96 孔圓底板，細胞數(shù)量為1×105/孔，PPD刺激（10 μg/ml），補充RPMI-1640 完全培養(yǎng)基至200 μl，同時設置陰性對照，不加PPD，只含有CFSE，培養(yǎng)72 h 后收集細胞，CD4或CD8a 流式抗體孵育30 min，洗滌后重懸，流式細胞儀檢測、T淋巴細胞的增殖水平。分析時，先以淋巴細胞設P1 門，再分別以CFSE 為第一熒光、PE-CY5 標記的CD4/CD8a為第二熒光設淋巴細胞增殖門，結果通過CFSE 熒光強度直方圖顯示，并統(tǒng)計比較、T 淋巴細胞的增殖率。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

表1 4 組小鼠的TCM 和TEM 比較（，%）Table 1 Levels of central and effector memory subsets of T cells in splenic lymphocytes in four groups of mice at 8，12 and 16 weeks post-inoculation

表1 4 組小鼠的TCM 和TEM 比較（，%）Table 1 Levels of central and effector memory subsets of T cells in splenic lymphocytes in four groups of mice at 8，12 and 16 weeks post-inoculation

注：與PBS 組比較，aP＜0.05；與BCG 組比較，bP＜0.05；與H37Ra 組比較，cP＜0.05；TCM=中央型T 淋巴細胞，TEM=效應型T 淋巴細胞，PBS=磷酸鹽緩沖液，BCG=卡介苗，H37Ra=結核分枝桿菌國際標準無毒株，B/R=新型結核病疫苗

表2 4 組小鼠的TCM 和TEM 比較（，%）Table 2 Levels of central and effector memory subsets of T cells in splenic lymphocytes in four groups of mice at 8，12 and 16 weeks post-inoculation

表2 4 組小鼠的TCM 和TEM 比較（，%）Table 2 Levels of central and effector memory subsets of T cells in splenic lymphocytes in four groups of mice at 8，12 and 16 weeks post-inoculation

注：與PBS 組比較，aP＜0.05；與BCG 組比較，bP＜0.05；與H37Ra 組比較，cP＜0.05

2.3 4組IL-2、IFN-γ和IL-4比較 免疫后8、12、16周，4 組IL-2 和IFN-γ 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，免疫后8、12、16 周PBS 組IL-2 和IFN-γ 低于BCG 組、H37Ra 組、B/R 菌株組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；免疫后8 周，BCG 組、H37Ra 組、B/R菌株組IL-2 和IFN-γ 組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；免疫后12 周，B/R 菌株組IFN-γ 高于BCG 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；免疫后16 周，B/R 菌株組IFN-γ 和IL-2 高于BCG 組和H37Ra 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。免疫后8、12、16 周，4 組IL-4 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表3）。

3 討論

免疫記憶是指相同抗原再次入侵機體時，引起較初次免疫應答更快速而強烈的免疫反應［7］。預防接種就是利用免疫反應具有記憶的特征，用目標病原體的滅活或減毒株刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生記憶性淋巴細胞，不僅避免了初次感染的風險，而且還為機體再次接觸有害病原體提供了免疫保護作用［8］。目前公認的和的T 淋巴細胞主要是TCM和TEM。抗原重復暴露時，TCM的增殖能力強于TEM，可迅速分化為效應T 淋巴細胞和TEM，并介導長期的免疫保護，而TEM則具有更強的免疫活性，但生存時間較TCM短［9］。本研究結果顯示，B/R 菌株免疫小鼠后，經(jīng)體外特異性抗原PPD 刺激后，免疫后8 周和的TCM和TEM高于PBS 組，與BCG 組比較無差異，證明B/R 菌株有能力在二次免疫應答中刺激機體產(chǎn)生免疫保護反應。免疫后12 周，B/R 菌株組TEM與H37Ra 組、BCG 組無差異，而TEM較高。有研究證明，BCG 分泌的抗原成分主要經(jīng)MHC Ⅱ類分子誘導Th1 型應答，誘導的T 淋巴細胞應答相對較弱，而T 淋巴細胞可以阻止體內(nèi)結核分枝桿菌潛伏感染的再激活［10］。提示，B/R 菌株可提高特異性T 淋巴細胞的產(chǎn)生，這可能與B/R菌株初次進入機體時誘導的T 淋巴細胞擴增程度有關。相關研究表明，特異性細胞毒性T 淋巴細胞的頻率和數(shù)量取決于最初抗原或疫苗誘導的T 淋巴細胞擴增的程度［11-12］。免疫后16 周，無論是T 淋巴細胞還是T 淋巴細胞，B/R 菌株組均可喚醒較親代BCG 組更高水平的TCM和TEM。有研究認為BCG 的免疫保護效果隨年齡增長而減低與其主要誘導TEM有關，而不是壽命更長的TCM［13-14］。提示B/R 菌株在繼承了親代優(yōu)點的基礎上，在免疫保護期上更具有優(yōu)勢。

表3 4 組IL-2、IFN-γ 和IL-4 比較（，pg/ml）Table 3 Levels of IL-2，IFN-γ and IL-4 in the culture supernatant of splenic lymphocytes in four groups of mice at 8，12 and 16 weeks post-inoculation

表3 4 組IL-2、IFN-γ 和IL-4 比較（，pg/ml）Table 3 Levels of IL-2，IFN-γ and IL-4 in the culture supernatant of splenic lymphocytes in four groups of mice at 8，12 and 16 weeks post-inoculation

注：與PBS 組比較，aP＜0.05；與BCG 組比較，bP＜0.05；與H37Ra 組比較，cP＜0.05；IL=白介素，IFN-γ=干擾素γ

圖2 和 T 淋巴細胞CFSE 熒光強度直方圖Figure 2 Histogram of CFSE fluorescence intensity of and T cells

表4 PPD 體外刺激72h 后各組小鼠T 淋巴細胞的增殖率（，%） Table4 The proliferati on rateof and Tcells in mice of four groups after PPD stimulation in vitro for 72 hours

表4 PPD 體外刺激72h 后各組小鼠T 淋巴細胞的增殖率（，%） Table4 The proliferati on rateof and Tcells in mice of four groups after PPD stimulation in vitro for 72 hours

注：與PBS 組比較，aP＜0.05；與BCG 組比較，bP＜0.05；與H37Ra 組比較，cP＜0.05

IFN-γ 和IL-2 是Th1 細胞分泌的抗結核分枝桿菌的代表性細胞因子，其可高度活化巨噬細胞，促進細胞免疫，介導其殺滅結核分枝桿菌。研究證明，IFN-γ基因敲除的小鼠很容易受到結核分枝桿菌的感染［18］。IL-2 可通過與IL-2 受體結合促進T 淋巴細胞的增殖和分化［19］，并參與記憶性T 淋巴細胞的形成［20］。研究結果顯示，免疫后16 周，B/R 菌株組IFN-γ 和IL-2 均高于BCG 組，證明B/R 菌株具有較好的免疫原性，同時，這與產(chǎn)生較高水平T 淋巴細胞的結果相一致。IL-4 是由Th2 細胞分泌的特異性因子，可促進Th0 細胞向Th2 細胞的極化。研究表明，IL-4 可促進結核分枝桿菌在巨噬細胞中的增殖，抑制巨噬細胞的殺菌活性，從而導致結核病的進展［21］。在本研究結果中，不同時期的各疫苗組誘導產(chǎn)生的IL-4 水平雖較PBS 組有所升高，但并無統(tǒng)計學差異，結合特異性Th1 型細胞因子高水平的產(chǎn)生結果，表明B/R 菌株誘導的免疫類型以Th1型細胞免疫應答為主。

T 淋巴細胞增殖結果顯示，PPD 體外刺激各組脾淋巴細胞72 h 后，CFSE 的熒光強度逐漸遞減，說明PPD作為特異性抗原刺激劑，可顯著促進記憶細胞性T 淋巴細胞分裂和增殖，這與LILIANA 等［22］研究的用PPD體外刺激5 d 的結果相似。但并未出現(xiàn)如抗CD3/28 抗體或PHA 刺激形成的“五指峰”樣圖，考慮可能與刺激細胞增殖的機制和刺激時間以及細胞因子傳遞的外源信號因素有關［22-24］。無論是T 淋巴細胞還是T淋巴細胞，B/R 菌株組的T 淋巴細胞增殖率均高于BCG組和H37Ra 組，結合16 周時B/R 菌株組可產(chǎn)生較高水平TM和特異性Th1 型細胞因子的結果，B/R 菌株的這一優(yōu)勢可能與其本身的結構或者抗原成分有關。經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，T 淋巴細胞可識別機體在不同的結核分枝桿菌感染階段表達的抗原，同時，抗原表達的豐度和持續(xù)時間決定了小鼠和人類T 淋巴細胞的功能［25-26］，關于B/R 菌株對機體影響的具體機制還需進一步的實驗驗證。

綜上所述，B/R 菌株免疫小鼠后，隨時間延長，在免疫保護期上更具有優(yōu)勢，即可促進機體產(chǎn)生更高水平的免疫保護性記憶細胞，以Th1 型細胞免疫應答為主，并可增強T 淋巴細胞增殖能力。同時，關于B/R 菌株的蛋白組學分析，以及其對于T 淋巴細胞免疫記憶的具體調(diào)控機制值得進一步研究，從而為B/R 菌株作為有潛力的新型結核病疫苗提供理論依據(jù)。

作者貢獻：邵萌、張萬江進行文章的構思與設計并撰寫論文；吳芳、張杰、董江濤進行實驗研究的實施與可行性分析以及統(tǒng)計學處理；邵萌、柳小玲、吳江東完成實驗并進行實驗數(shù)據(jù)的整理；章樂、趙海軍、張萬江進行論文的修訂；張萬江負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。