韓加娥，程世亮，戴永剛，于 淼，王 園

1.山東省濟(jì)南市天橋人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南 250031；2.山東省立第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南 250031

女性常見惡性腫瘤中發(fā)病率位居第2的是宮頸癌，位居首位的是乳腺癌[1]。世界衛(wèi)生組織報(bào)道指出，宮頸癌每年的發(fā)病數(shù)量約50萬；而在中國，每年宮頸癌的新發(fā)病例約為14萬，給女性的生活及生命質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響[2]。隨著臨床研究的不斷深入，人乳頭瘤病毒(HPV)開始逐漸進(jìn)入到臨床對(duì)宮頸癌的研究中，有研究表明，感染HPV是導(dǎo)致女性出現(xiàn)宮頸病變的一項(xiàng)主要原因[3]。目前臨床已發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的HPV基因亞型大概有100多種，其中與人類生殖道相關(guān)疾病有聯(lián)系的共有40多種[4]。依據(jù)HPV基因亞型的不同致病能力，其主要分為低危型和高危型。感染HPV與機(jī)體免疫功能、性活躍程度及年齡均存在十分密切的聯(lián)系。本研究采用PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測HPV基因亞型，探討宮頸病變與HPV不同亞型之間的關(guān)系，為宮頸疾病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年在濟(jì)南市天橋人民醫(yī)院婦科就診的864例宮頸病變患者作為研究對(duì)象，年齡18～60歲，平均(38.6±1.3)歲。所有患者均經(jīng)HPV檢測和宮頸病理活檢。

1.2儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀：羅氏480全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。分子雜交儀：亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司Combi_H12分子雜交儀。HPV基因分型檢測試劑盒：亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)。

1.3方法

1.3.1HPV-DNA標(biāo)本采集 采用專用宮頸脫落細(xì)胞采集器進(jìn)行采集，醫(yī)護(hù)人員先以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去，取出宮頸刷置于宮頸口，單向旋轉(zhuǎn)4～5周以獲得足量的上皮細(xì)胞標(biāo)本，然后將宮頸刷頭部放入洗脫管中，沿刷柄折斷，旋緊洗脫管蓋，做好標(biāo)識(shí)并直立放置。統(tǒng)一送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.3.2HPV-DNA提取 充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干，取1 mL洗脫液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min，棄上清液，保留管底的細(xì)胞沉淀。加入50 μL裂解液懸浮沉淀，沸水浴加熱10 min。13 000 r/min離心10 min，保留上清液待測。

1.3.3PCR擴(kuò)增 取出PCR反應(yīng)管，在管蓋上做好標(biāo)記，低速離心，分別加入已提取的待測標(biāo)本DNA 5 μL，反應(yīng)總體積為25 μL(可加入1滴礦物油防止蒸發(fā))，低速離心。每次試驗(yàn)可設(shè)置一個(gè)陰性質(zhì)量控制和一個(gè)陽性質(zhì)量控制，作為產(chǎn)品使用的質(zhì)量控制。PCR按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；然后以94 ℃ 30 s；42 ℃ 90 s；72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.4雜交 取出15 mL塑料離心管，放入標(biāo)有標(biāo)本標(biāo)號(hào)的膜條(應(yīng)在膜條外用中性筆標(biāo)記)，加入A液5～6 mL及所有(25 μL)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將離心管放入沸水加熱10 min(確保A液液面完全位于沸水液面以下)，取出再放入雜交箱51 ℃雜交至少1.5 h。取出50 mL塑料離心管，加入50 mL B液，于雜交箱或水浴箱中預(yù)熱至51 ℃。陰性質(zhì)量控制品和陽性質(zhì)量控制品同步處理。

1.3.5洗膜 取出膜條，移至裝有B液的50 mL離心管中，于51 ℃輕搖洗滌5 min。

1.3.6顯色及HPV結(jié)果判定 按照HPV-DNA檢測試劑盒說明進(jìn)行雜交顯色，顯色結(jié)果按照說明書進(jìn)行判斷。膜條上探針按照規(guī)定序列排列，由藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)位置可判斷HPV亞型。高危型18種，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4型。低危型5種,包括HPV 6、11、42、43、44型。感染HPV:一種HPV-DNA亞型出現(xiàn)陽性；多重感染：兩種及兩種以上HPV-DNA亞型出現(xiàn)陽性。

1.3.7宮頸組織病理活檢 正?；蜓装Y：標(biāo)本檢測結(jié)果提示僅存在炎癥或正常；宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ級(jí)：輕度不典型增生；CINⅡ級(jí)：中度不典型增生；CINⅢ級(jí)：重度不典型增生、宮頸癌[5]。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1觀察所有人群宮頸病理活檢結(jié)果及HPV陽性檢出比率。

1.4.2觀察不同宮頸病變中HPV常見基因亞型的分布情況。

1.4.3觀察不同宮頸病變中單一HPV基因亞型陽性及多重HPV基因亞型陽性檢出情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1864例患者宮頸病理活檢結(jié)果及HPV陽性檢出結(jié)果 864例患者中，正?；蜓装Y宮頸620例，CINⅠ級(jí)58例，CINⅡ級(jí)36例，CINⅢ級(jí)88例，宮頸癌62例。HPV陽性檢出率隨著宮頸病變程度不斷加重而升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 所有患者宮頸病理活檢結(jié)果及HPV陽性檢出結(jié)果

2.2HPV常見基因亞型在不同宮頸病變中的感染情況 HPV 16型在正?；蜓装Y中的陽性檢出率為10.0%(62/620)，在CINⅠ級(jí)中的陽性檢出率為13.8%(8/58)，在CINⅡ級(jí)中的陽性檢出率為38.9%(14/36)，在CINⅢ級(jí)中的陽性檢出率為34.1%(30/88)，在宮頸癌中的陽性檢出率為77.4%(48/62)。伴隨病情的不斷發(fā)展，HPV 16型在不同宮頸病變中的陽性檢出率逐漸升高。在宮頸癌患者中HPV 16型陽性檢出率優(yōu)最高，為77.4%(48/62)。HPV 18型在正?；蜓装Y中的陽性檢出率為5.2%(32/620)，在CINⅠ級(jí)中的陽性檢出率為6.9%(4/58)，在CINⅡ級(jí)中的陽性檢出率為5.6%(2/36)，在CINⅢ級(jí)中的陽性檢出率為4.5%(4/88)，在宮頸癌中的陽性檢出率為3.2%(2/62)。HPV 33型在正?；蜓装Y中的陽性檢出率為5.5%(34/620)，在CINⅠ級(jí)中的陽性檢出率為6.9%(4/58)，在CINⅡ級(jí)中的陽性檢出率為5.6%(2/36)，在CINⅢ級(jí)中的陽性檢出率為13.6%(12/88)，在宮頸癌中的陽性檢出率為4.8%(3/62)。HPV 52型在正?；蜓装Y中的陽性檢出率為2.6%(16/620)，在CINⅢ級(jí)中的陽性檢出率為4.5%(4/88)，在宮頸癌中的陽性檢出率為4.8%(3/62)。HPV 58型在正?；蜓装Y中的陽性檢出率為1.3%(8/620)，在CINⅡ級(jí)中的陽性檢出率為38.9%(14/36)，在CINⅢ級(jí)中的陽性檢出率為13.6%(12/88)。見表2。

表2 HPV常見基因亞型在不同宮頸病變中的感染情況(n)

2.3單一HPV基因亞型及多重HPV基因亞型在不同宮頸病變中感染情況 HPV多重感染在不同宮頸病變中的陽性檢出情況：正常或炎癥為11.3%(70/620)，CIN Ⅰ級(jí)為17.2%(10/58)，CINⅡ級(jí)為27.8%(10/36)，CINⅢ級(jí)為29.5%(26/88)，宮頸癌為9.7%(6/62)；宮頸癌中HPV多重感染占比明顯更少，更多的是單一HPV基因型感染，且感染類型全部為高危型，見表3。

表3 單一HPV基因亞型及多重HPV基因亞型在不同宮頸病變中感染情況(n)

3 討 論

目前，臨床上已充分明確了宮頸癌與HPV之間的關(guān)系。HPV在早期復(fù)制及表達(dá)時(shí)會(huì)出現(xiàn)E6癌蛋白和E7癌蛋白，而在晚期時(shí)則會(huì)出現(xiàn)衣鞘蛋白L1和衣鞘蛋白L2[6]。假如機(jī)體持續(xù)性感染HPV，早期表達(dá)的E6癌蛋白就會(huì)使p53分解水平明顯增加，進(jìn)而使宮頸細(xì)胞特異性明顯增加。E7癌蛋白會(huì)對(duì)E2F/pRb這一復(fù)合物產(chǎn)生干擾作用，主要作用是使擁有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子E2F能被激活，導(dǎo)致發(fā)生翻譯異常及HPV轉(zhuǎn)錄[7]。當(dāng)損傷DNA時(shí)，會(huì)導(dǎo)致宮頸病變持續(xù)加重。本研究結(jié)果提示，HPV陽性檢出率隨宮頸病變程度的不斷加重而升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在宮頸癌中HPV陽性檢出率更是高達(dá)90.3%。

本研究結(jié)果顯示，在不同類型宮頸病變中，HPV基因分型感染情況各不相同，不同亞型高危HPV基因其潛在的致病能力也各不相同，同時(shí)也反映了在不同宮頸病變中的流行性特征。相關(guān)研究指出，宮頸癌及CIN級(jí)中最常見的一種HPV基因亞型就是高危型HPV 16型，這與本研究結(jié)果一致[8]。本研究結(jié)果提示，在宮頸癌患者中同樣也是HPV 16型的陽性檢出率優(yōu)勢(shì)明顯，為77.4%(48/62)。相關(guān)研究指出，連續(xù)性感染同一高危型HPV基因而導(dǎo)致的持續(xù)性感染，引發(fā)宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)最大[8]。有研究指出，針對(duì)常見的HPV 16、18、31、33型實(shí)施動(dòng)態(tài)持續(xù)性檢測，結(jié)果提示，HPV 16型與其他HPV基因亞型比較其持續(xù)性感染更加明顯[9]。本研究結(jié)果提示，伴隨病情不斷發(fā)展，HPV 16型在不同宮頸病變中的感染率逐漸升高，分析其原因可能是因?yàn)镠PV 16型更容易導(dǎo)致持續(xù)性感染，且機(jī)體很難將其進(jìn)行清除[10]。HPV 16型是最常見的一種宮頸癌HPV基因亞型，一定要引起臨床的重視及關(guān)注。

目前，針對(duì)多重感染HPV基因會(huì)導(dǎo)致宮頸病變的發(fā)生比率明顯增加這一觀點(diǎn)，臨床上并無統(tǒng)一看法。有研究指出，多重感染表明，HPV基因會(huì)增加宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且會(huì)伴隨宮頸病變的不斷加重而增加HPV的感染率[11]。由此提示多重感染HPV基因亞型可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體更難對(duì)體內(nèi)的相關(guān)病毒進(jìn)行清除，使機(jī)體內(nèi)持續(xù)性發(fā)生HPV感染，增加宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[12]。本研究結(jié)果提示，宮頸癌中HPV多重感染占比明顯更少，在宮頸癌中更多的是單一HPV基因型感染，分析其原因可能是因?yàn)榇搜芯康臉?biāo)本病例數(shù)較少所致。

綜上所述，隨著宮頸病變程度的不斷加重，HPV陽性檢出率也隨之逐漸升高；宮頸癌中HPV基因亞型主要包括HPV 16、33、52型。