郭 雅 麗，王 競，顧 晨，郭 定 環(huán)

( 大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

近年來，藥品和個人護(hù)理產(chǎn)品(pharmaceutical and personal care products，PPCP)作為一種重要的環(huán)境優(yōu)先污染物，受到越來越廣泛的關(guān)注．布洛芬(ibuprofen，IBP)作為一種典型的PPCP，是目前使用最廣泛的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)之一[1]．由于傳統(tǒng)廢水處理的去除效率相對較低，IBP無法完全去除并被排放入環(huán)境中[2]．已有報道表明，IBP已在污水、地表水、海水甚至地下水中被檢測到，濃度范圍從ng·L-1至μg·L-1[3-4]．毒理學(xué)研究表明，長期暴露于即使是低濃度的IBP，仍可顯著影響生物體的生長和發(fā)育，并降低群落的生物多樣性，對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有潛在威脅[5-6]．

在光照環(huán)境中，直接和間接(敏化)光解均可降解IBP[7]．已有研究表明，溶解性有機(jī)物，尤其是富里酸是重要的光敏劑[8-9]．而Matamoros等發(fā)現(xiàn)，在光照條件下，IBP也可以在海水中降解[10]．在生物降解方面，已有研究報道白腐真菌、黏質(zhì)沙雷氏菌和淡水硅藻舟形藻等從陸地及淡水環(huán)境中分離的微生物，在一定條件下也能夠有效地降解IBP[11-13]．有報道表明，由于IBP對顆粒的相對較高的吸附系數(shù)，能夠吸附于顆粒有機(jī)碳并在湖水中以1 m·d-1的速度沉降，因而易于在沉積物中積累[14]．因此IBP不僅存在于海水中，在沉積物中也被檢出[15-19]，這也就意味著，在海洋環(huán)境中光降解并不是IBP轉(zhuǎn)化的唯一途徑．因此，本研究利用從近海沉積物中分離得到的麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶪CW，考察IBP共代謝降解特性、降解過程中生理特性及胞外活性氧的變化，對研究海洋細(xì)菌對IBP的生物降解、了解IBP在海洋環(huán)境中的歸趨具有重要意義．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用菌株GCW分離自大連市黑石礁近海表層沉積物，經(jīng)富集培養(yǎng)后，反復(fù)利用稀釋涂布平板劃線法分離，從而得到菌株GCW，菌落呈白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊．經(jīng)鑒定為麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶤lteromonasmacleodii(Genbank登錄號：KY583738)．

1.2 IBP降解實驗

實驗培養(yǎng)基均用人工海水配制，用20% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0．

唯一碳源培養(yǎng)基：在人工海水中加入12.5 mg·L-1NH4NO3、2.5 mg·L-1K2HPO4·3H2O和250 mg·L-1IBP．

不同共代謝培養(yǎng)基：向人工海水中分別加入6 g/L的蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉．

1.3 活性物種定位及鑒別

為定位IBP降解發(fā)生在菌株胞內(nèi)還是胞外，對降解活性物種進(jìn)行了定域?qū)嶒灒畬⒕昱囵B(yǎng)72 h，取菌液6 000 r/min離心分離10 min，將上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜去除細(xì)胞后作為胞外提取液．將沉淀洗滌后用濃度10 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)重懸，隨后冰浴超聲破壁5 min，15 000 r/min離心分離20 min，上清液作為胞內(nèi)提取液．在無菌培養(yǎng)基(空白對照)、胞外和胞內(nèi)提取液中分別加入1 mg·L-1的IBP，于25 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床中避光反應(yīng)5 h．為了避免胞內(nèi)活性物質(zhì)在超聲破碎過程中變性失活，又進(jìn)行了完整細(xì)胞實驗．將離心(6 000 r/min，10 min)后的沉淀用預(yù)冷無菌超純水洗滌2次，重懸于滅菌人工海水，在相同條件下進(jìn)行反應(yīng)．

1.4 胞外活性氧及相關(guān)酶檢測

(1)羥基自由基

?OH是一種典型的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，其測定采用苯甲酸高效液相色譜法[20]．色譜柱為Sinochrom ODS-BP (4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為40 ℃．其中，流動相A為超純水(含0.1%三氟乙酸)，流動相B為乙腈，流動相A與流動相B體積比為87∶13，波長為255 nm，單個樣品運行時間為20 min．?OH濃度計算方法如下式所示：

c(?OH)=c(p-HBA)×5.87

(1)

其中c(?OH)為?OH濃度，c(p-HBA)為對羥基苯甲酸濃度．

(2)超氧陰離子自由基

(3)過氧化氫

H2O2檢測采用的是DPD/POD法[22]．向2 mL 的胞外提取液中加入0.2 mL濃度為0.5 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH=6)，再加入37 μL 用濃度為0.05 mol·L-1的H2SO4配制的10 g·L-1DPD溶液和37 μL的1 g·L-1POD溶液，利用紫外-可見分光光度計測量吸光度，波長為551 nm，體系以不加POD為空白對照．

(4)鐵載體

鐵載體的檢測基于鉻天青(chrome azurol S，CAS)法[22]．將CAS檢測液與胞外提取液等體積充分混勻后放置1 h，利用紫外-可見分光光度計測定吸光度，波長為630 nm，以酵母浸粉培養(yǎng)基作為空白對照．

(5)L-氨基酸氧化酶

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)的檢測同樣基于DPD/POD法[23]．取1 mL 胞外提取液，加入等體積的5 g·L-1亮氨酸溶液作為底物，以不作處理的胞外提取液作對照，一同在25 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床中反應(yīng)1 h，用DPD/POD法分別測定反應(yīng)后體系的H2O2濃度，相減則為1 h內(nèi)產(chǎn)生的H2O2．

1.5 生理特性分析

(1)生長曲線

生長曲線的測定采用比濁法，利用紫外-可見分光光度計測定菌懸液的光密度來推測菌體的濃度，測定波長為600 nm．

(2)胞外聚合物

利用堿法提取菌株經(jīng)過72 h培養(yǎng)后的胞外聚合物(EPS)．取10 mL菌液，10 000 r/min離心分離20 min，上清液即為溶解態(tài)EPS．在沉淀中加入10 mL超純水充分混勻，加入0.06 mL濃度為36.5%的甲醛溶液，靜置于4 ℃條件下反應(yīng)1 h，隨后向體系內(nèi)加入4 mL濃度為1 mol·L-1的NaOH溶液靜置于4 ℃條件下培養(yǎng)3 h，離心分離(10 000 r/min，4 ℃，20 min)，收集上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾后即為結(jié)合態(tài)EPS．EPS中多糖測定采用苯酚-硫酸法，蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)法．

(3)胞外脫氫酶活性

脫氫酶活性(dehydrogenase activity，DHA)的檢測采用氯化三苯基四氮唑-脫氫酶活性法[24]．

(4)電子傳遞系統(tǒng)活性

電子傳遞系統(tǒng)活性(electron transport system activity，ETSA)的檢測是基于四唑還原作用來體現(xiàn)耗氧值，底物是碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)[25]．

1.6 IBP分析方法

IBP的測定采用高效液相色譜法．色譜柱為Supersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為40 ℃．其中，流動相A為含有0.02 mmol·L-1磷酸二氫鈉的超純水(用磷酸調(diào)pH=3.0±0.05)，流動相B為乙腈，流動相A與流動相B的體積比為40∶60，流速為0.8 mL·min-1，在222 nm 波長下對IBP濃度進(jìn)行測定．單個樣品運行時間為12 min．

2 結(jié)果與討論

2.1 IBP降解特性

首先，為了考察菌株GCW能否以IBP為唯一碳源生長，進(jìn)行了唯一碳源降解實驗(圖1)．實驗發(fā)現(xiàn)，IBP未發(fā)生明顯降解，表明在實驗條件下，GCW不能夠以IBP為唯一碳源生長．而IBP在自然環(huán)境中可能與各種易降解物質(zhì)共存，因此，選取常見的有機(jī)質(zhì)作為共代謝底物考察了IBP的共代謝降解效果(圖1)．實驗表明，在無細(xì)胞接入和經(jīng)過熱失活細(xì)胞的兩個不同空白對照組中，72 h 后IBP未發(fā)生明顯降解(<5%)．而牛肉膏和蛋白胨培養(yǎng)基中的3 d降解率分別為85%和69%，酵母浸粉培養(yǎng)基最高，為90%．因此，后續(xù)實驗選擇酵母浸粉作為共代謝底物．對菌株GCW好氧共代謝降解IBP進(jìn)行動力學(xué)研究，實驗結(jié)果如圖2所示．在經(jīng)歷24 h的停滯期后，對24～72 h的IBP濃度基于c/c0值取對數(shù)，按一級反應(yīng)動力學(xué)方程線性擬合，擬合結(jié)果符合準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)，IBP降解速率常數(shù)為0.061 h-1，相對應(yīng)的半衰期T1/2為35.4 h．

關(guān)于海洋環(huán)境中IBP生物降解目前還未見報道，本研究中的降解速率與IBP在海水中光降解的相關(guān)研究結(jié)果(0.14 h-1)也相當(dāng)[10]．對比淡水及陸地環(huán)境中IBP生物降解的研究，Marco-Urrea等發(fā)現(xiàn)白腐真菌對IBP的7 d降解率約為70%[11]，Xu等分離的黏質(zhì)沙雷氏菌對IBP的5 d降解率為93%[12]，本研究在降解周期及降解率方面具有一定優(yōu)勢．

圖1 不同培養(yǎng)基中的IBP降解曲線

圖2 IBP降解曲線

為了明確降解發(fā)生的位置，進(jìn)行了降解活性物種定位實驗(圖3)．實驗結(jié)果表明，菌株GCW胞內(nèi)提取液和完整細(xì)胞中的IBP均不發(fā)生降解，而胞外提取液中IBP發(fā)生明顯降解，降解率達(dá)79%．因此，降解IBP的活性物質(zhì)位于胞外．

圖3 GCW不同部分的IBP降解

為了分辨降解活性物質(zhì)的種類，進(jìn)行了活性物種淬滅實驗(圖4)．發(fā)現(xiàn)煮沸抑制了97.2%的IBP降解，說明降解活性物質(zhì)為熱敏性物質(zhì)．而蛋白酶K抑制了56.9%的降解，說明菌株GCW降解IBP為酶和非酶物質(zhì)共同作用，其中酶的作用占56.9%．隨后進(jìn)行了ROS淬滅實驗，發(fā)現(xiàn)SOD抑制了3.4%的降解，CAT抑制了31.2%的降解，硫脲抑制了56.8%的降解．結(jié)果表明，ROS參與了菌株GCW對IBP的降解，且H2O2和?OH起主要作用．

圖4 淬滅實驗的IBP相對降解率

2.2 降解過程中的生理特性變化

為了探究IBP對菌株GCW的影響，考察了菌株在含與不含IBP的培養(yǎng)基中的生長曲線、胞外聚合物、脫氫酶活性等生理特性，這些生理特性也在一定程度上反映了其降解IBP的機(jī)理．

菌株GCW在含與不含IBP體系中的生長曲線如圖5所示．GCW經(jīng)過6 h左右生長到達(dá)對數(shù)期，經(jīng)過約36 h生長到達(dá)對數(shù)末期并進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后直至72 h菌量不再有明顯變化．同時還可以看出，1 mg·L-1的IBP對菌株GCW的生長無顯著影響．

胞外聚合物是微生物分泌于細(xì)胞外的高分子聚合物，它覆蓋在微生物表面，在微生物與外部環(huán)境之間形成一個緩沖層，能夠幫助細(xì)胞抵御有害物質(zhì)的毒害．同時，已有報道表明Alteromonasmacleodii菌屬能夠產(chǎn)生EPS[26]．經(jīng)72 h培養(yǎng)后，IBP對菌株GCW分泌EPS的影響如圖6所示．結(jié)果表明，加入IBP的實驗組比對照組EPS的蛋白質(zhì)含量提高了15.5%，多糖含量提高了

圖5 含/不含IBP培養(yǎng)基中GCW的生長曲線

圖6 IBP對EPS分泌的影響

16.7%，這一結(jié)果表明加入IBP促進(jìn)了EPS的分泌，這可能是由于菌株通過分泌EPS來抵御外界環(huán)境的毒害．

脫氫酶是細(xì)菌關(guān)鍵的氧化還原酶之一，在細(xì)菌生長和降解污染物過程中起到重要作用．本實驗測定了IBP對菌株胞外脫氫酶活性的影響，實驗結(jié)果如圖7所示．結(jié)果表明，含IBP實驗組的DHA相對于不含IBP的對照組有顯著提高，尤其是在前60 h內(nèi)，提高了10.8%～35.5%．以上結(jié)果說明，IBP會刺激菌株GCW胞外脫氫酶活性，進(jìn)而有利于污染物的降解．

圖7 IBP對胞外脫氫酶活性的影響

電子傳遞系統(tǒng)活性是檢測微生物潛在代謝活性的重要生化指標(biāo)之一，可作為降解能力測定的有力補(bǔ)充．測定其活力是測定電子傳遞過程中的限速步驟酶反應(yīng)即CoQ-Cytb復(fù)合體的氧化活力．本實驗測定了菌株胞內(nèi)電子傳遞系統(tǒng)活性的變化，如圖8所示．結(jié)果表明，菌株GCW在培養(yǎng)至36 h后ETSA最高，含IBP與不含IBP分別為1.11和0.85 μg·g-1·min-1，隨后菌體的電子傳遞系統(tǒng)活性隨時間呈降低趨勢．菌株GCW在培養(yǎng)的前60 h內(nèi)，含IBP實驗組的ETSA相對于不含IBP的對照組有顯著提高，提高了10.1%～30.7%．以上結(jié)果表明，IBP會刺激菌株GCW電子傳遞系統(tǒng)活性．

圖8 IBP對電子傳遞系統(tǒng)活性的影響

2.3 ROS形成與IBP降解

隨后還測定了降解過程中H2O2濃度及IBP降解情況，如圖10(a)所示．結(jié)果表明，H2O2濃度在降解過程中呈上升趨勢，并在72 h結(jié)束時達(dá)到峰值，分別為0.93和1.21 μmol·L-1．同時發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)至指數(shù)期后期(36 h)之前，H2O2的產(chǎn)生幾乎可以忽略不計．已有研究表明，LAAO在細(xì)胞外H2O2產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用，廣泛分布于包括細(xì)菌在內(nèi)的不同生物中．Gómez等首次報道海洋細(xì)菌Marinomonasmediterranea可以合成L-賴氨酸-ε-氧化酶(lodA)，該酶可以催化L-賴氨酸的氧化脫氨反應(yīng)釋放H2O2[30]．他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，lodA在生長的穩(wěn)定期會分泌到細(xì)胞外環(huán)境中[31]，這與本文的研究結(jié)果相一致．此外，在IBP降解過程中(24～60 h)，含IBP的H2O2濃度低于不含IBP的；而通過對兩組中LAAO活性檢測發(fā)現(xiàn)，含IBP中LAAO的活性明顯高于不含IBP的(圖10(b)所示)．這意味著含IBP的產(chǎn)胞外H2O2能力高于不含IBP的，進(jìn)而說明含IBP的H2O2濃度下降并不是由于IBP抑制了H2O2的產(chǎn)生，而是降解IBP消耗了H2O2所致．這也解釋了IBP降解結(jié)束后(72 h)，含IBP的H2O2濃度高于不含IBP的這一現(xiàn)象．

圖9 IBP對NADH氧化還原酶的影響

而研究表明，H2O2本身并不能降解IBP，需要轉(zhuǎn)化為其他活性物質(zhì)才能起到降解作用．已有研究表明，海洋系統(tǒng)中有機(jī)Fe(Ⅱ)絡(luò)合物可以催化H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生?OH[32]．在蘇榮葵對UV/H2O2高級氧化技術(shù)降解布洛芬的研究中，?OH也被證明是導(dǎo)致IBP降解的最主要原因[33]．因此，本研究測定了體系中的胞外?OH濃度和鐵載體的活性．在胞外提取液中檢測到?OH濃度分別為1.7和1.0 μmol·L-1，且在達(dá)到穩(wěn)定期(60 h)后，濃度趨于穩(wěn)定(圖11(a))．同時，含IBP鐵載體的活性顯著高于不含IBP(圖11(b))，結(jié)合H2O2的測定結(jié)果，含IBP的胞外?OH濃度應(yīng)高于不含IBP的．然而含IBP的胞外?OH濃度卻明顯低于不含IBP的，因此這可能是由于在IBP降解中消耗了?OH，這也是IBP非酶降解的主要途徑．

3 結(jié) 語

本研究首次探討了海洋環(huán)境中IBP的生物降解，證實了麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶪CW能夠共代謝降解IBP，以酵母浸粉為共基質(zhì)時具有最好的降解效果，并且在降解周期及降解率方面具有一定優(yōu)勢．IBP的加入可以提高菌株EPS、DHA和ETSA等生理特性，并且促進(jìn)與胞外ROS產(chǎn)生相關(guān)的NADH氧化還原酶、LAAO和鐵載體的活性．GCW降解IBP發(fā)生在胞外，由酶和非酶物質(zhì)共同介導(dǎo)．降解IBP的非酶物質(zhì)主要為ROS，且?OH起最主要作用．本研究加深了對海洋環(huán)境中IBP生物降解的了解，對研究IBP在海洋環(huán)境中的歸趨具有啟示作用．