張 運(yùn) 秋,潘 悅,陶 旭 鋒,肖 桂 山
( 大連理工大學(xué) 化工學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )
乳腺癌的發(fā)病率和致死率位居高位,并且發(fā)病率逐年升高,這導(dǎo)致乳腺癌逐漸成為威脅女性健康的首位惡性腫瘤[1-3].2018年全球乳腺癌占新發(fā)癌癥病例的24.2%,占癌癥死亡病例的15.0%.在全球范圍內(nèi),乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別在154個(gè)和104個(gè)國(guó)家排名第一[4],每4個(gè)女性癌癥患者中就有1個(gè)是乳腺癌患者[5].乳腺癌治療主要以外科手術(shù)和化療為主[6-7].廣大女性乳腺癌患者因手術(shù)治療存在創(chuàng)傷面大、復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)而選擇化療[8],然而大部分的患者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期化療之后會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[9].這一現(xiàn)象嚴(yán)重影響了乳腺癌患者的生活質(zhì)量及疾病預(yù)后[10-12],因此發(fā)現(xiàn)新的抗乳腺癌藥物意義重大.
抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的主要方式有誘導(dǎo)凋亡、影響細(xì)胞周期、自噬和壞死,而凋亡作為主要的方式之一,發(fā)揮著巨大的作用.細(xì)胞凋亡是細(xì)胞通過(guò)遺傳編碼進(jìn)行自殺的過(guò)程,并且整個(gè)凋亡過(guò)程有著嚴(yán)格的調(diào)節(jié)程序[13-14].細(xì)胞凋亡與許多基因有關(guān),其被相關(guān)基因嚴(yán)格把控著.作為一個(gè)與腫瘤增殖和凋亡密切相關(guān)的蛋白,p53的激活可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡起到抗腫瘤的作用[15].誘導(dǎo)線粒體內(nèi)源性凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤活性的主要機(jī)制之一[16-17],大量文獻(xiàn)表明,p53可以激活Bax,從而打開線粒體通道使細(xì)胞色素C釋放到胞漿中,進(jìn)而激活下游的Caspase-9以及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3,從而激活線粒體內(nèi)源性凋亡通路.除此之外,Bad作為Bcl-2家族的促凋亡基因之一,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,Schimmer等[18]發(fā)現(xiàn),Bad蛋白可以直接誘導(dǎo)凋亡.Bim是Bcl-2家族的重要凋亡調(diào)節(jié)因子,有研究表明DNA損傷會(huì)影響B(tài)im的表達(dá)從而引起細(xì)胞的凋亡[19].
十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)主要作為納米材料合成過(guò)程中的打孔劑[20],與陰離子和非離子等均具有良好的配位性,這樣的結(jié)構(gòu)特性導(dǎo)致其也是較好的兩性表面活性劑,并且具有良好的乳化、抗靜電、殺菌及生物降解性.近期有研究表明以CTAB為首的一系列具有長(zhǎng)碳鏈季銨鹽結(jié)構(gòu)的化合物具有抗腫瘤活性,其對(duì)結(jié)腸癌、肺癌和肝癌等均具有明顯的治療作用[21-22],低劑量CTAB能夠增強(qiáng)乳腺癌的藥物敏感性[23],但是CTAB是否能夠具有抗乳腺癌的作用,還有待探索.因此,本研究擬初步探討CTAB是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231的凋亡有影響,以及其是否影響這兩種細(xì)胞系的內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路.
1.1.1 細(xì)胞系 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù).
1.1.2 主要試劑與儀器 CTAB(H9151-100g,純度≥99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,F(xiàn)BS、DMEM高糖培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司.青鏈霉素混合液(100×)、MTT(1g)試劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司.AV-PI雙染色凋亡試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司.RIPA裂解液、Western Blot顯影液購(gòu)自北京普利萊公司.DMSO購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)相關(guān)化學(xué)試劑購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠.Tween20購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.β-actin、p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bim、Bcl-2、P-bcl-2和Bad一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司,二抗羊抗兔和羊抗鼠購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司.其他儀器包括生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Thermo公司、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio TeK公司、熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧森巴斯公司、Life Attune 聲波聚焦流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司、凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司.
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231采用含10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每隔2 d換一次液,細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)傳代培養(yǎng)或用于其他實(shí)驗(yàn).
1.2.2 細(xì)胞活性MTT檢測(cè) 用胰酶適度消化生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞,然后用FBS終止消化,離心棄去胰酶和FBS的混合液,用PBS沖洗離心后棄上清,用新的培養(yǎng)基將細(xì)胞按照5 000/孔的密度接種到96孔板中,每孔200 μL培養(yǎng)液.過(guò)夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后,按照設(shè)定的給藥濃度梯度進(jìn)行給藥.設(shè)置每個(gè)濃度梯度6個(gè)復(fù)孔,重復(fù)鋪兩板,在分別給藥24 h和48 h后,每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),在37 ℃ 孵箱孵育4 h后,抽出每孔中含有MTT的培養(yǎng)液,然后每孔加入150 μL DMSO,將96孔板放在搖床上振蕩10 min,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下每組的吸光值,用GraphPad Prism 5.0計(jì)算不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率以及藥物的IC50值.
1.2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 待MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期,取IC50值(相近的濃度值)進(jìn)行給藥,對(duì)照組給同等體積的空白溶劑,給藥24 h后,用PBS輕輕沖洗掉死細(xì)胞,放置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并在光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察拍照.
1.2.4 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 培養(yǎng)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期,根據(jù)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值,設(shè)定MCF-7的給藥濃度為0.75、1.5、3 μg/mL,設(shè)定MDA-MB-231的給藥濃度為0.5、1.0、1.5 μg/mL,給藥24 h后,收集用CTAB處理的細(xì)胞及空白對(duì)照組的細(xì)胞,用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞,消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)以避免假陽(yáng)性,消化適當(dāng)時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng),用PBS清洗兩次得到干凈的細(xì)胞,然后根據(jù)說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率.
1.2.5 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 用胰酶消化待提取的細(xì)胞,PBS清洗2遍,離心留取細(xì)胞,加入RIPA裂解液和PMSF的混合液(混合比例50∶1),置于冰上孵育10 min,每隔5 min渦旋振蕩30 s,離心后留取上清液保存于-80 ℃.使用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒定量蛋白濃度,按比例加入5×上樣緩沖液后95 ℃、10 min,保存于-20 ℃冰箱.每條泳道加入30 μg蛋白樣品,設(shè)置恒壓70 V約30 min跑完濃縮膠,然后調(diào)至恒壓140 V跑完分離膠.切取目標(biāo)蛋白條帶轉(zhuǎn)移至甲醇活化好的PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜恒流300 mA約90 min,牛奶封閉1 h,用TBST清洗膜3次(5 min/次),加入一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃ 孵育過(guò)夜,再用TBST清洗3次(10 min/次),室溫孵育二抗1 h,TBST清洗3次(10 min/次),將膜用ECL高敏顯影液避光孵育2 min,然后置于凝膠成像儀中顯影.
用GraphPad Prism 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為有顯著性差異.
CTAB化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示,本研究選取兩種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)將6.25 μg/mL設(shè)定為MCF-7細(xì)胞系的最大給藥終濃度,按照2/3梯度稀釋依次設(shè)定濃度梯度(0、0.37、0.55、0.82、1.23、1.85、2.78、4.17、6.25 μg/mL).同理,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)將1.56 μg/mL設(shè)定為MDA-MB-231細(xì)胞系的最大給藥終濃度,按照4/5梯度稀釋依次設(shè)定濃度梯度(0、0.33、0.41、0.51、0.64、0.80、1.00、1.25、1.56 μg/mL).用以上設(shè)定濃度分別處理乳腺癌細(xì)胞系24 h和48 h,結(jié)果顯示CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用(圖2,P<0.05),經(jīng)計(jì)算作用24 h,MCF-7的IC50是1.32 μg/mL,MDA-MB-231的IC50是0.82 μg/mL(表1).因此,CTAB對(duì)于乳腺癌細(xì)胞確實(shí)具有一定的殺傷作用.
圖1 CTAB的化學(xué)結(jié)構(gòu)
為了更直觀地觀察CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響,本研究分別選用兩種細(xì)胞系的IC50值(附近濃度值)1.5 μg/mL和1.0 μg/mL處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系,24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CTAB能夠引起乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的明顯變化,與對(duì)照組相比,給藥后細(xì)胞變細(xì)變長(zhǎng)(圖3),說(shuō)明給藥后細(xì)胞狀態(tài)不是很好,可能是發(fā)生了早凋現(xiàn)象.由此本研究得出CTAB能夠引起乳腺癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,推測(cè)CTAB可能能夠引起乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象.
表1 CTAB在不同時(shí)間下對(duì)乳腺癌細(xì)胞的IC50值
為了進(jìn)一步明確CTAB殺傷乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制,本研究用AV-PI雙染的方式檢測(cè)CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的作用.根據(jù)MCF-7細(xì)胞給藥24 h的IC50值,設(shè)定給藥濃度為0.75、1.5、3 μg/mL;根據(jù)MDA-MB-231細(xì)胞給藥24 h的IC50值,設(shè)定給藥濃度為0.5、1.0、2.0 μg/mL.結(jié)果表明,CTAB殺傷乳腺癌細(xì)胞可能是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡實(shí)現(xiàn)的,隨著CTAB的濃度增加,其凋亡率也明顯增加(圖4、5).用0.75、1.5、3 μg/mL的CTAB處理MCF-7細(xì)胞24 h后,其凋亡率分別為5.12%、8.68%和22.21%(圖4);用0.5、1.0、2.0 μg/mL的CTAB處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h 后,其凋亡率分別為8.83%、10.19%和17.75%(圖5).以上結(jié)果表明,CTAB能夠一定程度上誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231凋亡.
為了研究CTAB誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,本研究用1.5 μg/mL CTAB處理MCF-7,24 h,檢測(cè)細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)量.結(jié)果顯示,經(jīng)CTAB處理的MCF-7細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)量R明顯增加(圖6),因此本研究認(rèn)為CTAB可能通過(guò)激活p53來(lái)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡.在化療藥物引起的凋亡里,線粒體內(nèi)源性凋亡一直扮演著非常重要的角色.為了進(jìn)一步研究CTAB誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的方式,本研究檢測(cè)了線粒體內(nèi)源性凋亡的相關(guān)蛋白Bcl-2、P-bcl-2、Bax、Bad、Bim、Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Caspase-3以及Cleaved Caspase-3在MCF-7細(xì)胞中給藥前后的表達(dá)量.結(jié)果顯示,CTAB給藥24 h內(nèi)抑制Bcl-2蛋白的磷酸化,并且激活與線粒體內(nèi)源性凋亡相關(guān)的促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bad以及Bim(圖6).因此本研究提出CTAB可能是通過(guò)激活p53誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞線粒體內(nèi)源性凋亡.
目前有文獻(xiàn)表明CTAB對(duì)p53野生型結(jié)腸癌具有更好的抗腫瘤活性.因此本研究猜測(cè)CTAB的抗腫瘤作用可能與p53相關(guān)[14-15].本研究采用Western Blot法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CTAB處理MCF-7細(xì)胞24 h后p53表達(dá)量明顯增加,證明了CTAB確實(shí)與p53相關(guān),且CTAB能夠促進(jìn)p53蛋白的表達(dá),更加直接明了地驗(yàn)證了CTAB能夠激活p53這一關(guān)系.
Bcl-2家族在調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)源性凋亡的通路中發(fā)揮著重要的作用,該家族中和凋亡相關(guān)的成員眾多,其中包括本研究中所探索的Bax等促凋亡蛋白和Bcl-2等抗凋亡蛋白[24],文獻(xiàn)顯示,Bcl-2/Bax可調(diào)控細(xì)胞凋亡并在乳腺癌治療中發(fā)揮著非常重要的作用[25].葉惠榮等[26]研究表明,靈菌紅素通過(guò)上調(diào)Bim抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡.梁歡等[27]研究顯示維生素D可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞的促凋亡蛋白Bax的表達(dá),下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡.本研究采用一系列濃度梯度CTAB處理人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24 h和48 h后,發(fā)現(xiàn)隨著CTAB濃度增加,細(xì)胞增殖明顯被抑制;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率隨著CTAB濃度梯度逐漸增加.并且經(jīng)CTAB處理后,乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的Bax、Bad、Bim等蛋白表達(dá)量升高,P-bcl-2的表達(dá)量降低.Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Caspase-9及Cleaved Caspase-9在細(xì)胞的再生與凋亡代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.本研究中,CTAB用于MCF-7細(xì)胞后,Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達(dá)均較對(duì)照組增加,提示CTAB通過(guò)促進(jìn)線粒體內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡.
目前越來(lái)越多的納米材料被應(yīng)用于抗腫瘤的治療,近期許多研究表明CTAB在一定的劑量范圍內(nèi),也可以起到抗腫瘤作用,同時(shí)還具有一定的選擇性殺傷作用,有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值[28],因此本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明CTAB具有良好的抗乳腺癌作用,為其應(yīng)用于未來(lái)乳腺癌的治療提供了一定的理論依據(jù).但是本研究沒有進(jìn)一步具體驗(yàn)證在CTAB促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231凋亡的進(jìn)程中,p53和線粒體內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白的具體作用關(guān)系,有待進(jìn)一步研究.
本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明CTAB是通過(guò)激活p53抑制Bcl-2的磷酸化,增加Bax、Bad以及Bim蛋白的表達(dá)量,進(jìn)而打開線粒體通道激活下游的Caspase-9以及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3激活線粒體內(nèi)源性凋亡通路,從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡.