鄭燕，劉舒雅，曹映輝，童妍，趙凱，彭東輝，周育真

(1.福建農(nóng)林大學園林學院，福建 福州 350002；2.蘭科植物保護與利用國家林業(yè)與草原局重點試驗室，福建 福州 350002；3.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117)

建蘭(Cymbidiumensifolium)為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)多年生草本植物，以其花姿優(yōu)美、葉藝獨特、香氣馥郁等特點廣受國人喜愛[1].香氣是評價蘭花品質(zhì)的重要標準之一，不僅能提高蘭花的審美價值和經(jīng)濟價值，而且在蘭花授粉和植物防御方面起著重要作用[2].已有研究表明，建蘭的特征性香氣成分茉莉酸甲酯是以亞麻酸或亞油酸等脂肪酸類物質(zhì)為香氣前體代謝產(chǎn)生的[3-6].香氣前體的濃度很大程度上決定揮發(fā)物的濃度，因此需要了解建蘭脂肪酸類花香氣前體物質(zhì)成分及含量，才能更好的調(diào)節(jié)建蘭花香的釋放[7].

花香前體物質(zhì)萃取常用的方法為溶劑萃取法，采用“相似相溶”的原理，用低沸點的有機溶劑加熱提取植物材料[8].脂肪酸類物質(zhì)只有在萃取效率高的情況下才能被更精確地檢測出[9-10].因此，可以對萃取過程中的主要影響因素進行條件優(yōu)化，以達到更佳的萃取效果，然而關(guān)于建蘭花朵內(nèi)脂肪酸類物質(zhì)萃取條件優(yōu)化的研究還未見報道.

建蘭大青(C.ensifoliumDaQing)為濃香型品種，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯為建蘭大青主要花香物質(zhì)成分(未發(fā)表).本研究以建蘭大青為材料，通過有機溶劑萃取法萃取其花朵脂肪酸類前體物質(zhì)后采用GC-MS聯(lián)用儀檢測其含量.采用單因素試驗和正交試驗對建蘭脂肪酸類物質(zhì)的料液比、萃取溫度和萃取時間等萃取條件進行分析，旨在優(yōu)化并建立有效的萃取方法與分析流程，為建蘭大青花朵脂肪酸類物質(zhì)萃取提供一定的理論和實踐參考.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料采自福建農(nóng)林大學(N 26°04′51.3″，E 119°14′19.9″)森林蘭苑大棚中收集的建蘭大青.選擇生長良好、長勢一致的植株，于晴天中午11點～12點采集其盛開期花朵，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱.

1.2 方法

1.2.1 成分萃取 采用改良后的Paul溶劑萃取法[11]萃取建蘭花朵脂肪酸類物質(zhì).將1朵建蘭大青盛花花朵過液氮磨成粉末，收集于10 mL離心管中，加入一定量的正己烷后迅速渦旋混勻.在不同萃取溫度和萃取時間條件下，經(jīng)過200 W超聲波清洗儀(型號200KDB，昆山公司)萃取后，8 000 r/min離心3 min.收集上清液至10 mL容量瓶中，加入0.5 mL的2 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，靜置甲酯化1 h，加入飽和氯化鈉溶液至刻度線以上，瓶口磨砂位置以下約1 cm，待溶液分層后，取上清液過無水硫酸鈉以除去水分(靜置出現(xiàn)結(jié)晶為止).過濾膜裝入進樣瓶，將純度98%的癸酸乙酯稀釋500倍，取1 μL癸酸乙酯加入1.5 mL樣品中，封口膜封口.每個處理3個生物學重復，保存于-20 ℃冰箱.

1.2.2 成分檢測 使用島津GC-MS-TQ8040儀器，氣相色譜條件：色譜柱使用InertCap Pure-WAX氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣，不分流，總流量30 mL；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率上升到180 ℃，以5 ℃/min的速率升到250 ℃，保持2 min.質(zhì)譜條件為：CC-MS的接口溫度250 ℃，電子轟擊源EI；離子源溫度260 ℃；電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍50～600 aum；檢測器電壓為0.3 kV，溶劑延遲時間7 min.

1.2.3 試驗設計 參考葉征美等[8]方法，在料液比為1∶3，萃取溫度為40 ℃、萃取時間為30 min的基礎條件下，保持其他因素不變，只改變其中一個因素，設置料液比分別為1∶1、1∶3、1∶5，萃取溫度為20、40、60 ℃、萃取時間為10、30、50 min，以亞麻酸甲酯、亞油酸甲酯和茉莉酸甲酯3類脂肪酸類物質(zhì)的相對含量總和為指標，每組試驗重復3次進行單因素試驗.得到單因素試驗結(jié)果后進行L9(34)正交試驗.

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 物質(zhì)定性與定量分析 通過G1701BA化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，NIST98譜圖庫檢索法結(jié)合人工譜圖分析法進行定性分析.使用侯佳等[1]的內(nèi)標法進行定量分析，在待測樣品中加入內(nèi)標物后根據(jù)內(nèi)標物峰面積與待測樣品組分峰面積的比值，計算待測樣品中化學組分相對于內(nèi)標的含量.各組分含量計算公式如下：

1.3.2 單因素試驗與正交試驗數(shù)據(jù)分析 所有試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件，進行單因素方差分析(ANOVA)和正交試驗的方差分析.利用Excel統(tǒng)計正交試驗的極差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

通過單因素試驗探討不同料液比、不同萃取溫度和不同萃取時間對脂肪酸類物質(zhì)萃取量的影響(圖1).結(jié)果表明：在其他條件相同的條件下，單一因素的料液比、萃取溫度和萃取時間隨著水平增加，脂肪酸類物質(zhì)相對含量均呈現(xiàn)先增后降的趨勢.當料液比為1∶3時，脂肪酸類物質(zhì)萃取量達到最大值；隨著萃取溫度的升高，脂肪酸類物質(zhì)在40 ℃時萃取量達到最大值；當超聲時間達到30 min時，脂肪酸類物質(zhì)萃取量最高.因此，只考慮單因素變化時，料液比為1∶3較佳，萃取溫度40 ℃較佳，萃取時間30 min較佳.

圖1 單因素試驗結(jié)果Figure 1 Results of single factor experiment

2.2 正交試驗結(jié)果

由于料液比(A)、萃取溫度(B)、萃取時間(C)3個因素間能相互影響，因此在上述單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗，以獲取最佳組合條件.R值反映了因素的水平變動時，試驗指標的變動幅度.依據(jù)R值的大小，可以判斷因素的主次.由表2可知：本試驗中R值大小為RA>RB>RC，3個因素的主次關(guān)系是：A(料液比)>B(萃取溫度)>C(萃取時間).k值的大小反映了因素對試驗指標影響的大小.料液比的k1>k2>k3，可判斷A1為料液比的優(yōu)水平；同理判斷萃取溫度和萃取時間的優(yōu)水平分別是B1和C1.因此，最優(yōu)萃取組合條件為A1B1C1，即：料液比為1∶2，萃取溫度為30 ℃，萃取時間為20 min.

通過進一步的方差分析發(fā)現(xiàn)(表3)，料液比(A)和萃取溫度(B)對脂肪酸類物質(zhì)萃取有顯著影響(P<0.05)，而萃取時間(C)影響不顯著(P>0.05).

2.3 建蘭大青花朵內(nèi)源物質(zhì)成分及含量

有機溶劑萃取建蘭大青內(nèi)源物質(zhì)的GC-MS總離子流圖見圖2.由圖2可見，含量較高的內(nèi)源物質(zhì)主要在20 min后被檢測到，本試驗總共檢測出46種化學物質(zhì).通過成分歸類，主要物質(zhì)成分為酯、烷、醇、萜類等(表3).脂肪酸類物質(zhì)的相對含量最高，共13種，占累計檢出化合物的93.07%，其中亞麻酸甲酯最高，占39.56%，其次為亞油酸甲酯(32.19%)、棕櫚酸甲酯(13.10%)和反-9-十八碳烯酸甲酯(3.80%).同時還檢測出一些非脂肪酸成分，含量較高的為烷烴類，共22種，占累計檢出化合物的5.38%；其余醇類、萜烯類等共占累計檢出化合物的1.59%.

表1 L9(34)正交試驗設計及極差分析

表2 正交試驗的方差分析

圖2 建蘭大青花朵內(nèi)源物質(zhì)的GC-MS總離子流圖Figure 2 Total ion chromatograms of endogenous compounds from C.ensifolium Daqing flowers

表3 建蘭大青花朵甲酯后內(nèi)源物質(zhì)成分含量

3 討論

為探究建蘭內(nèi)源脂肪酸類香氣前體的含量，本研究采用單因素結(jié)合正交試驗方法優(yōu)化了建蘭大青花朵內(nèi)源脂肪酸類物質(zhì)的萃取條件，并利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其花朵內(nèi)源物質(zhì)進行分析，確定料液比1∶2、萃取溫度30 ℃、萃取時間20 min為最適條件組合.白三葉草籽[12]、杜仲籽[13]和沙棘果等提取[14]脂肪酸試驗與本試驗結(jié)果相似，提取過程中增加萃取溶劑，溶劑與樣品接觸面積越大，萃取效率越好.但植物材料不同，最適液料比差別較大，白三葉草籽和杜仲籽液料比大約為1∶10，而沙棘果油的提取液料比為1∶70.與黃芪籽[15]和千層金等[8]精油提取的結(jié)果類似，過高溫度會造成萃取溶劑的揮發(fā)，導致萃取物質(zhì)得率下降.本試驗中溶劑正己烷的沸點較低，推測是由于溫度持續(xù)升高正己烷損失導致最后含量減少.因此，液料比、萃取溫度和時長設置需考慮到所萃取物質(zhì)以及萃取溶劑的沸點和穩(wěn)定性.

從建蘭大青花朵中總共檢測出46種內(nèi)源物質(zhì)，脂肪酸類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)含量最高，其中亞麻酸甲酯的相對含量最高，達到39.56%.劉運權(quán)等[1]在建蘭原生種、鐵骨素、金絲鳳尾素的揮發(fā)性成分中發(fā)現(xiàn)脂肪酸類衍生物的相對含量較高；建蘭品種小桃紅的揮發(fā)物各類成分主要為酯類、烷類和萜烯類等[2].這些建蘭品種的揮發(fā)性花香物質(zhì)的成分與建蘭大青花朵內(nèi)源物質(zhì)的分類大致相同.本研究結(jié)果與墨蘭精油的研究結(jié)果相似，墨蘭精油主要物質(zhì)成分也為脂肪酸類，但脂肪酸的種類不同.采用同時蒸餾萃取法萃取的墨蘭品種小香和企黑的花蕾精油，結(jié)果表明其主要組分為棕櫚酸[16-17].而苯環(huán)類4-甲基苯酚和β-紫羅蘭酮在盛花期的含量增加最多.墨蘭的主要揮發(fā)性花香物質(zhì)成分為甲基-異丁子香酚和6-氧代庚酸甲酯等[18].因此建蘭與墨蘭的揮發(fā)性物質(zhì)成分不同，可能是由于花香內(nèi)源前體物質(zhì)具有差異，這需要后續(xù)進一步驗證.

本研究采用不同的前期處理方法，對建蘭大青脂肪酸類物質(zhì)進行萃取和鑒定，得到的最適條件可用于后續(xù)對建蘭不同時期、不同品種花朵內(nèi)源物質(zhì)的檢測，有助于探究建蘭花香的產(chǎn)生、匯集儲存和釋放規(guī)律，為建蘭香氣形成機理及其香花品種的產(chǎn)生和利用提供一定的理論參考.

4 結(jié)論

1) 建蘭大青脂肪酸類物質(zhì)萃取最佳條件為：料液比1∶2，萃取溫度30 ℃，萃取時間20 min，提取質(zhì)量分數(shù)為97.87 μg/g.

2) 建蘭大青花朵的物質(zhì)成分中脂肪酸類物質(zhì)占累計檢出化合物的93.07%，其中亞麻酸甲酯相對含量最高，為39.56%；其次為烷烴類，占累計檢出化合物的5.38%.