王曉，冉馨，高小寬，梁海永，黃曉茜，劉炳響,3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；2.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000；3.河北省城市森林健康技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

全球20%以上的土地正在受到鹽堿脅迫的侵蝕，且狀況不斷惡化[1].我國鹽堿地面積大，在土地資源銳減、人口不斷增加的壓力下，鹽堿地改良利用愈發(fā)受到人們的重視[2].一定適宜范圍的環(huán)境是植物生長發(fā)育的必要條件，一旦環(huán)境因子的變化程度超出了植物正常生活所能忍耐的范圍，便會對植物的生長生理造成損害，甚至導(dǎo)致死亡，土壤鹽堿化便是環(huán)境脅迫的主要類型之一.土壤堿化與鹽化是兩種性質(zhì)不同的非生物脅迫，通常將NaCl和Na2SO4等中性鹽引起的脅迫稱為鹽脅迫，而將由Na2CO3和NaHCO3等堿性鹽為主的脅迫稱為堿脅迫[3]，但因其往往相伴而生，易被混淆.實際上堿脅迫因其土壤溶液pH值較高會使植物遭受鹽分與高pH的雙重損傷，傷害作用較鹽脅迫更為嚴重和復(fù)雜[4-6].一些植物為了生存，能在一定程度上改變自身結(jié)構(gòu)與功能，從而適應(yīng)環(huán)境條件的變化[7].通過生物技術(shù)選育耐堿樹種是目前解決土壤堿化問題最主流且有效的生物學(xué)措施之一，這一舉措不僅能扼制土地鹽漬化，改良土壤，又可以實現(xiàn)鹽堿地的利用，對改良利用鹽堿地意義重大[8].白柳(SalixalbaL.)為楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix))落葉喬木，是一種綠化、材、藥兼用的經(jīng)濟樹種，主要以扦插繁殖為主，對干旱、貧瘠和鹽堿等逆境具有很強的適應(yīng)性[9].目前，有關(guān)白柳繁殖及耐鹽堿造林試驗已有相關(guān)研究報道[10-12]，但有關(guān)堿性鹽脅迫下柳樹的適應(yīng)性機制研究尚未見報道.

根系作為植物進行物質(zhì)交換的主要器官之一，因其與逆境脅迫直接接觸，成為最先且主要的受害器官.已有研究表明，植物的抗堿能力主要取決于根[13-14].光合作用是植物物質(zhì)能量來源的關(guān)鍵代謝過程，堿脅迫能顯著改變?nèi)~片的細胞結(jié)構(gòu)[15]，阻礙光合作用的進行，降低光合速率，同時會對植物的PSⅡ反應(yīng)中心造成損傷，抑制PSⅡ的原初光化學(xué)反應(yīng)和電子傳遞過程[16]，所以光合熒光參數(shù)的改變可以反映光合生產(chǎn)的變化和脅迫因子對植物的作用程度.白柳具有較強的逆境適應(yīng)能力，在鹽堿地生態(tài)治理中具有較大的應(yīng)用推廣潛力.因此，本試驗以白柳插條為對象，人工模擬堿性土環(huán)境下扦插育苗過程，研究不同土壤溶液pH值下的堿脅迫對白柳根系生長狀況的影響，并通過JIP-test分析[17-18]堿脅迫下光合特征參數(shù)的變化，探討白柳耐堿特性，以期為白柳堿脅迫適應(yīng)性機制研究及鹽堿地區(qū)白柳應(yīng)用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

供試材料采自河北省懷安縣金沙灘林場種質(zhì)資源圃，在12月份落葉之后選取長勢基本一致、生長健壯無病蟲害的當(dāng)年生白柳枝條.選取枝條中部的三分之二，截成20 cm長的插條，其中插條最上部的芽離插條頂端距離為 0.5～1 cm，上切口為平切口，下切口為斜切口.隨即于2019年12月23日在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室開展試驗.氣候室設(shè)定溫度為28 ℃/25 ℃(光/暗)，LED冷光源控制光照強度1 000 μmol/(m2·s)，光周期14 h/10 h(光/暗)，相對濕度60%.

將試材放置于55 cm×38 cm×15 cm(長×寬×高)塑料箱中進行水培.試驗共設(shè)5個處理，每個處理3次重復(fù).以1/2 Hoagland完全營養(yǎng)液為本底配制pH值分別為8.0、8.5、9.0、9.5(mNa2CO3：mNaHCO3=1∶1配制)的水培溶液，并以1/2 Hoagland完全營養(yǎng)液為對照(pH為7.2).每個處理共放置約25株插條，將其直接浸泡在溶液中，溶液約沒過插條高度的一半.在生長過程中每隔5 d更換營養(yǎng)液，換之前將插條取出用清水小心沖洗根部，將上次殘留溶液沖洗掉，防止堿性過度積累.在堿脅迫持續(xù)處理20 d后進行各項生長生理指標(biāo)的測定.

1.2 測定項目及方法

1.2.1 根系生長參數(shù)的測定 在白柳生長過程中統(tǒng)計全部插條的根萌動天數(shù)與生根率，并依據(jù)根萌動天數(shù)計算其生根指數(shù).堿脅迫處理20 d后選取長勢均勻的5株插條，測量其平均根數(shù)和平均根長.

生根指數(shù)=∑Gt/Dt

式中：Dt為生根試驗第t日；Gt為第t日的生根枝條數(shù)，生根指數(shù)是生根枝條數(shù)/逐日之和.

1.2.2 葉片光合參數(shù)的測定 堿脅迫處理20 d后測定白柳葉片光合氣體交換參數(shù).每個處理選取5株長勢均勻插條進行試驗，采用Li-6800便攜式光合作用儀(美國 LI-COR公司)于氣候室正常照光3 h后選擇從上往下數(shù)第3～5片葉位、大小、受光方向一致且完全展開的功能葉片測定其Pn、E、Gs和Ci.測定條件：PAR為1 000 μmol/(m2·s)，固定系統(tǒng)內(nèi)CO2濃度為400 μmol/mol，相對濕度為60%.

1.2.3 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線的測定 堿脅迫處理20 d后，每個處理選取5株長勢平均的白柳插條進行測定.測定前將葉片暗適應(yīng)15 min，然后利用 Pocket PEA 植物效率分析儀(Hansatech，UK)測定其OJIP曲線.將獲得的OJIP曲線用于快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線數(shù)據(jù)分析(JIP-test)，并對相關(guān)參數(shù)進行計算[17-19].其中分析計算可得：暗適應(yīng)后的最大光化學(xué)效率(在t=0時)φPo；反應(yīng)中心捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的激子占用來推動QA還原激子的比率(在t=0時)Ψo；反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(在t=0時)φEo；用于熱耗散的量子比率φDo；以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)PIABS；以單位面積為基礎(chǔ)的性能指數(shù)PICSm；以單位材料面積為基礎(chǔ)的推動力DFCSm.

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016及Origin 2018進行數(shù)據(jù)處理及作圖，采用SPSS 25.0軟件對各項指標(biāo)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法檢驗差異顯著性(α=0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對白柳根系生長的影響

試驗結(jié)果表明堿脅迫下各處理間生根率均可達到100%，但平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)在各處理間差異較大，表現(xiàn)為隨脅迫加劇，抑制作用加重，且根萌動天數(shù)出現(xiàn)延后.

由圖1可以看出，在pH值為8.0時白柳的平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)均有不同程度的下降，但均未與對照產(chǎn)生明顯差異.隨堿脅迫程度進一步加劇，使平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)逐漸下降，在pH為8.5時，3個指標(biāo)分別較對照顯著下降17.9%、27.2%和9.7%.pH增加到9.0和9.5時，平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)下降更加顯著.表明隨堿脅迫加重，根系萌發(fā)與伸長受到明顯的抑制作用且愈加強烈.

圖1 堿脅迫對白柳插條根系生長的影響Figure 1 Effects of alkali stress on root growth of Salix alba L.cuttings

2.2 堿脅迫對白柳葉片光合參數(shù)的影響

由表1可以看出，白柳葉片的光合過程在不同濃度堿脅迫下均受到不同程度的影響，其Pn、E和Gs均隨pH值升高而總體呈逐漸下降趨勢.溶液pH為8.0和8.5時，白柳葉片的Pn雖有所下降，但與對照無明顯變化，當(dāng)pH達到9.0時，葉片Pn較對照顯著降低21.8%，此時堿脅迫顯著抑制了白柳葉片的光合碳同化能力.各處理下E和Gs與對照之間的差異均達到顯著水平，當(dāng)溶液pH為8.0時，白柳葉片E和Gs分別較對照顯著降低19.5%和13%.葉片Ci隨溶液pH升高呈先降后升的變化趨勢，在pH為8.5時降到最低，并較對照顯著降低9.1%，之后逐漸升高，溶液pH為9.5時，葉片Ci與對照差異不顯著，但較最低值顯著升高12.8%.

表1 堿脅迫對白柳葉片光合參數(shù)的影響

2.3 堿脅迫對白柳葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線(OJIP)的影響

OJIP曲線能夠提供豐富的關(guān)于PSⅡ的光化學(xué)信息，準(zhǔn)確反映植物光合機構(gòu)的狀態(tài)及光反應(yīng)中PSⅡ供體側(cè)、受體側(cè)及PSⅡ反應(yīng)中心電子氧化還原狀態(tài)[20-21].圖2為堿脅迫下白柳葉片OJIP曲線的變化狀況.隨堿脅迫加劇，白柳葉片快速葉綠素?zé)晒馇€有不同程度的改變，溶液pH為8.0時，I、P點熒光值與對照差異不顯著；在pH>8.0的堿脅迫條件下I、P點熒光值顯著下降且出現(xiàn)明顯拐點K(300 μs左右)，OJIP 曲線變?yōu)镺KJIP曲線，此時到達最大熒光所需的時間被縮短，表明堿處理濃度越高對白柳葉片脅迫傷害程度越大.

2.4 堿脅迫對量子產(chǎn)額和能量分配比率的影響

由表2可以看出，白柳葉片在不同濃度堿脅迫下吸收、轉(zhuǎn)化、用于電子傳遞以及以熱輻射方式耗散的能量發(fā)生明顯變化.與對照相比，隨堿脅迫加劇，白柳葉片φPo逐漸下降，在pH值為8.5時開始顯著低于對照.此時PSⅡ受到傷害，光合機構(gòu)發(fā)生光抑制，這同時也是植物進行光保護的過程.葉片Ψo與φEo均隨堿脅迫程度加劇與對照相比呈總體逐漸下降的變化趨勢.在pH值為8.0時，葉片Ψo和φEo均未與對照有明顯差異，之后隨脅迫進一步加劇，Ψo和φEo明顯下降，在溶液pH為8.5時，Ψo和φEo分別顯著低于對照12.7%和14.3%.與對照相比，堿脅迫顯著增加了白柳葉片的φDo，且在溶液pH為8.5時開始顯著高于對照.

圖2 堿脅迫對白柳葉片快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)OJIP曲線的影響Figure 2 Effect of alkali stress on the fast induction curves of chlorophyll a fluorescence (OJIP curve) of Salix alba L.leaves

表2 堿脅迫下白柳葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)變化

2.5 堿脅迫對性能指數(shù)及推動力的影響

性能指數(shù)和推動力可以準(zhǔn)確表達植物光合機構(gòu)的狀態(tài)，能較好地反映脅迫對光合機構(gòu)的影響.由表3可以看出，隨堿脅迫程度加劇，PIABS、PICSm和DFCSm總體均呈逐漸下降趨勢.PIABS在溶液pH為8.5、9.0和9.5時較對照顯著降低了26.5%、40.5%和52.6%；PICSm在溶液pH為8.5、9.0和9.5時較對照顯著降低了18.2%、38.0%和46.8%；DFCSm在溶液pH為9.0和9.5時較對照顯著降低了4.8%和6.2%.由上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)堿脅迫嚴重影響了植物對光能的吸收并導(dǎo)致基礎(chǔ)推動力的下降.

表3 不同堿脅迫下性能指數(shù)及推動力的變化

3 討 論

3.1 堿脅迫對白柳根系生長狀況的影響

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，同時也是植物進行物質(zhì)交換的器官之一[22]，對維持植物地上部的生長發(fā)育，發(fā)揮正常生理功能具有重要意義[23-24].堿脅迫對植物的傷害之所以甚于鹽脅迫，主要是由于高pH明顯抑制了根系生長，根系因與逆境脅迫直接接觸，成為最直接且主要的受害器官.其抑制作用主要表現(xiàn)為根系的長度、表面積等參數(shù)處于較低水平，根系生長變慢等.高pH值會通過引起根系周圍金屬離子和磷的積累沉淀，使根系附近離子失衡，影響其對營養(yǎng)元素的吸收，減少液泡中質(zhì)子的數(shù)量，進而抑制或破壞根細胞跨膜電化學(xué)勢梯度[25]，導(dǎo)致細胞膜透性增大，造成植物大量失水，最終輕則影響根系生理功能，重則使根細胞解體.破壞根系結(jié)構(gòu)[26]，造成植株根系活力降低，根系吸收功能下降，導(dǎo)致地上部葉片萎蔫，影響光合作用的正常進行，從而使植物生長代謝紊亂甚至喪失生理功能.

根系生長狀況的改變以及根萌動時期的早晚能直觀反映堿脅迫對植物傷害程度的大小.本研究表明，在較低堿脅迫下(溶液pH為8.0)白柳的平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)并未與對照有明顯差異，但隨堿脅迫程度加劇，根系萌發(fā)與伸長受到明顯的抑制，根萌動天數(shù)出現(xiàn)延后.研究表明白柳根系生長狀況在堿脅迫下受到全面抑制，進而影響植物的正常生長發(fā)育過程.

3.2 堿脅迫對白柳光合參數(shù)的影響

光合作用能為植物的正常生長發(fā)育提供物質(zhì)與能量，且對逆境環(huán)境較為敏感[27].堿脅迫通過植物根際高pH脅迫、滲透脅迫、離子毒害及光合產(chǎn)物積累所引起的反饋抑制等途徑綜合影響光合作用[28]，表現(xiàn)為破壞膜結(jié)構(gòu)從而影響組織細胞內(nèi)離子分布、影響植物對光能的吸收、電子傳遞以及碳同化等過程[29]，造成植物代謝紊亂.氣孔作為植物葉片與外界聯(lián)系的通道，直接影響和控制植物的凈光合速率和蒸騰速率[30].以往研究表明，逆境脅迫下氣孔限制、非氣孔限制及二者的相互作用等均會使植物光合速率下降[31-33].氣孔因素即是氣孔導(dǎo)度下降，CO2進入葉片受阻；非氣孔因素主要指光合器官的光合活性下降，包括光合膜系統(tǒng)損傷、光合電子傳遞能力下降、CO2同化能力下降等[34].若逆境脅迫下植物凈光合速率降低時，伴隨著氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度的同時降低，說明此時氣孔因子是限制凈光合速率的主要原因；氣孔導(dǎo)度若與胞間CO2濃度未同時降低，則表明凈光合速率的降低是由非氣孔限制因子所致[35].本試驗中，堿脅迫下白柳葉片的凈光合速率明顯降低，且隨脅迫加劇，葉片的氣孔導(dǎo)度呈降低趨勢.當(dāng)溶液pH小于8.5時，均有白柳葉片胞間CO2濃度隨氣孔導(dǎo)度的下降而下降，說明此時氣孔限制是白柳葉片光合作用降低的主要原因；但在pH大于8.5處理條件下，白柳葉片胞間CO2濃度隨氣孔導(dǎo)度下降而升高，說明此時白柳葉片光合器官結(jié)構(gòu)受損，凈光合速率降低主要受非氣孔限制因素的影響，這與張?zhí)兜萚36]在枸杞、劉建新等[37]在燕麥上的研究結(jié)果類似.

植物在逆境脅迫環(huán)境下能否協(xié)調(diào)好碳同化與水分消耗之間的關(guān)系對自身的正常生長至關(guān)重要[38].通過控制氣孔開度，以在植物得到CO2和失去水分的調(diào)節(jié)中達到平衡是植物發(fā)揮正常生理功能的關(guān)鍵，這在許多研究中被證實[39-40].本研究中，隨堿脅迫加劇，白柳蒸騰速率一開始便受到顯著抑制，隨后凈光合速率也明顯下降，但凈光合速率下降程度明顯低于蒸騰速率，表明白柳能在一定程度上提高對水分的利用效率，以此來維持光合速率的相對穩(wěn)定.這一過程表明白柳對堿脅迫具有一定的調(diào)節(jié)適應(yīng)能力，并且這種適應(yīng)性對植物本身在逆境下的生存和延續(xù)具有重要意義.

3.3 堿脅迫對白柳葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)的影響

OJIP曲線主要反映了PSⅡ的原初光化學(xué)反應(yīng)及光合機構(gòu)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)等的變化[41].JIP-test數(shù)據(jù)分析技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于植物生理研究.堿脅迫能夠直接或間接地影響植物PSⅡ的功能，通過對快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線的分析，可深入探究環(huán)境條件的改變對植物PSⅡ的影響以及光合機構(gòu)對環(huán)境變化的適應(yīng)機制[41].典型的植物快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線一般在熒光上升階段為OJIP曲線.本研究表明，白柳在溶液pH>8.0時熒光曲線變?yōu)镺KJIP曲線，I、P點熒光值顯著下降且出現(xiàn)明顯拐點K.K點的出現(xiàn)是由于水裂解系統(tǒng)和QA之前受體側(cè)部分被抑制從而引起PSⅡ供體側(cè)放氧復(fù)合體(OEC)受損所導(dǎo)致的，K點的相對可變熒光可作為OEC被破壞的標(biāo)志[42-43].同時高堿濃度處理極大地縮短了達到P點(最大熒光值)所需的時間，這表明pH越高對白柳葉片PSⅡ供體側(cè)脅迫傷害程度越大，向下游提供電子的能力越弱，PSⅡ受體側(cè)的還原受阻礙程度越強.

φPo、φEo、Ψo、φDo反映了植物的能量分配比率.隨堿脅迫加劇，白柳葉片φPo、φEo和Ψo逐漸下降且在pH為8.5時即顯著低于對照.說明堿脅迫使光合機構(gòu)受到明顯損傷，PSⅡ受體側(cè)功能受到傷害，QB和PQ被還原的能力下降，QA傳遞電子的能力以及有活性的反應(yīng)中心開放程度下降.φDo顯著升高，表明光合系統(tǒng)吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的占比下降，用于熱耗散的量子比率升高，該結(jié)論與張會慧等[32]和劉建新等[44]的研究具有一致性.說明此時葉片具有較高的耗散過剩能量的能力，可能通過葉黃素循環(huán)耗散掉過剩的激發(fā)能以進行光保護[45]，從而調(diào)控光合系統(tǒng)能量分配.植物在逆境脅迫條件下易發(fā)生或加重光抑制[42],本研究中，隨溶液pH升高，白柳PIABS、PICSm和DFCSm均呈現(xiàn)較明顯的下降趨勢，說明堿脅迫下白柳葉片發(fā)生了光抑制，光合機構(gòu)的功能受到損傷，光能轉(zhuǎn)化效率顯著降低，PSII反應(yīng)中心部分失活，進而限制了其光合作用的正常進行.

4 結(jié)論

堿脅迫對白柳根系生長狀況、光合作用和快速葉綠素?zé)晒馓匦跃杏绊懀S著堿脅迫加劇，受害癥狀表現(xiàn)明顯.平均根數(shù)、平均根長和生根指數(shù)顯著降低，根系生長狀況受到全面抑制；光合速率顯著降低，PSⅡ反應(yīng)中心部分失活、PSⅡ供體側(cè)OEC與受體側(cè)電子受體受到損傷，這是堿脅迫下白柳葉片光合能力下降的原因之一.但白柳也可通過調(diào)節(jié)凈光合速率與蒸騰速率的下降幅度在一定程度上確保自身蒸騰耗水的利用能力，以提高用于熱耗散的量子比率等方法來應(yīng)對堿脅迫，由此可見白柳對堿脅迫環(huán)境表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性和耐受能力.