茍攀寧，薛應(yīng)鈺，陳軍宏，張欣，張揚(yáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

油桃(Prunuspersicavar.nectarina)是普通桃的變種，因其果面光滑無毛而得名[1].它原產(chǎn)于中國西北地區(qū)，目前，亞洲和北美洲的一些國家已經(jīng)發(fā)展為油桃生產(chǎn)大國[2].中國是全球最大的油桃生產(chǎn)國，油桃不僅成為我國設(shè)施栽培的主要類型，在露地生產(chǎn)中的發(fā)展也相當(dāng)迅速，主要分在山東、北京、河北、河南、陜西、山西和甘肅等地[3].2017年中國油桃的栽培面積占桃栽培總面積的20%以上[4]，2021年油桃產(chǎn)量已超過1 200萬 t[5]，已經(jīng)成為主栽區(qū)主要的水果支柱產(chǎn)業(yè).油桃因其皮光無毛、色鮮味美、營養(yǎng)豐富、食用方便而深受消費(fèi)者的青睞[6].但是，隨著油桃種植面積的擴(kuò)大，樹勢(shì)的衰老以及栽培管理措施不當(dāng)，病害逐年加重，嚴(yán)重影響了油桃的產(chǎn)量和品質(zhì)，給果農(nóng)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失.目前國內(nèi)報(bào)道的油桃病害多為集中在生長期的一些病害，如由樹生黃單胞李致病變種(Xanthomonasarboricolapv.pruni)、嗜果刀孢菌(Clasterosporiumcarpophilum)、核果假尾孢菌(Pseudocercosporacircumscissa)引起的穿孔病[7-8]；由葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的流膠病[9]；由嗜果黑星菌(Venturiacarpophila)引起的瘡痂病[10]；灰葡萄孢(Botrytiscinerea)危害油桃花、葉片和果實(shí)引起的灰霉病[11]；畸形外囊菌(Taphrinadeformans)引起的縮葉病[12]；褐腐病菌(Moniliafructigena)引起油桃褐腐病使果實(shí)脫落腐爛等[13].油桃由于皮薄肉軟，組織含水量高，在采后運(yùn)輸和貯藏過程中易受到微生物侵染發(fā)生腐爛，酸腐病就是一種比較典型的難防治的果蔬采后病害[14].該病自2001年首次在美國圖拉雷縣報(bào)道以來[15]，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，據(jù)報(bào)道，2012年油桃酸腐病在美國加州的發(fā)病率為3.4%～26.1%[16].但是，國內(nèi)未見油桃酸腐病的系統(tǒng)報(bào)道.甘肅省臨夏縣從2000年開始油桃引種、試驗(yàn)和示范，截至目前，油桃栽培面積達(dá)到107 hm2，初果面積57 hm2，產(chǎn)值達(dá)23萬元/hm2以上[17].油桃產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)?shù)厝罕娫鍪罩赂坏闹饕a(chǎn)業(yè).2019年在甘肅省臨夏市臨夏縣油桃成熟采摘期間，在5個(gè)果園均發(fā)現(xiàn)油桃酸腐病，引起果實(shí)腐爛且伴有濃烈酸臭味，造成油桃品質(zhì)和商品率降低，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)赜吞耶a(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益.筆者以油桃酸腐病病果為材料，對(duì)其病原菌進(jìn)行分離鑒定和生物學(xué)特性研究，以期進(jìn)一步確定油桃酸腐病的病原菌，間接明確油桃安全貯藏和影響病害發(fā)生的關(guān)鍵因子，為油桃采后病害防控及保鮮提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試油桃酸腐病病果和健康油桃均采自甘肅省臨夏市南塬鄉(xiāng)張河西村.

供試培養(yǎng)基：葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 000 mL；蔗糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PSA)：蔗糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 000 mL；合成低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA)：葡萄糖0.5 g、蔗糖0.2 g、KNO31.0 g、KH2PO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4· 7H2O 0.5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL；察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g、NaNO32.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g 、FeSO40.01 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 000 mL；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基；馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 000 mL；碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母粉20 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、KH2PO42.0 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、KH2PO42.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原物的分離與純化 病原物的分離參照組織分離法[18]，先用蒸餾水將發(fā)病油桃的表面沖洗干凈，然后在超凈工作臺(tái)中用75%的乙醇在病果表面沖洗30 s進(jìn)行表面消毒，接著用無菌水持續(xù)沖洗60 s.等晾干以后在病健交界處取邊長為5 mm的正方形組織塊，將其置于PDA培養(yǎng)基中，每皿4個(gè)組織塊.放在25 ℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d后挑取菌落邊緣部分再次進(jìn)行分離，最后經(jīng)過單孢純化獲得致病菌株，將分離純化好的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上置于4 ℃冰箱內(nèi)保存.

1.2.2 致病性測(cè)定 將分離獲得的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d以后，先用0.02% 吐溫-80溶液洗脫分生孢子并在磁力攪拌器上攪拌15 min，充分混合均勻；接著用雙層醫(yī)用紗布過濾獲得分生孢子懸浮液，最后利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)，加入無菌水制成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液.取成熟度一致的健康油桃，用75%酒精進(jìn)行表面消毒.分別采用針刺[19]和無傷處理方式，噴霧接種油桃，每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，以無菌水為對(duì)照.接種處理完后將其放置在底部鋪有雙層濕潤濾紙的燒杯中，用保鮮膜封口進(jìn)行保濕培養(yǎng)(25 ℃)，每隔24 h觀察其發(fā)病癥狀并記錄.待其發(fā)病后進(jìn)行病原菌的再分離，與初分離獲得的菌株性狀進(jìn)行比較.

1.2.3 菌株鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定，將經(jīng)過柯赫氏法則驗(yàn)證后的菌株打成菌餅(5 mm)接種到PDA培養(yǎng)基的中央，置于25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待菌落面積達(dá)到培養(yǎng)皿面積約2/3時(shí)，觀察記錄菌落的顏色、形狀和氣味等特征，并在光學(xué)顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)以及孢子形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定.

分子學(xué)鑒定，將供試菌株在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d以后收集菌絲體，然后用CTAB法提取DNA，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)以及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增其ITS序列，委托西安擎科生物有限公司對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)序.最后將獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行 BLAST比對(duì)分析，并提交序列獲取GenBank登錄號(hào).利用 MEGA 7.0 軟件以鄰接法(neighbor-joining，NJ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20].

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.2.4.1 溫度對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 將直徑為5 mm的菌餅接種于PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)5次，7 d后用十字交叉法測(cè)量其菌落直徑以及產(chǎn)孢量.

1.2.4.2 光照對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 將直徑為5 mm的菌餅接種于PDA平板上，設(shè)置連續(xù)黑暗、連續(xù)光照、12 h光照黑暗交替3種不同光照條件，于25 ℃下恒溫培養(yǎng).其他同1.2.4.1.

1.2.4.3 不同種類培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 以PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、合成低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、孟加氏培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，將直徑為5 mm的菌餅接種于供試培養(yǎng)基的中央.其他同1.2.4.1.

1.2.4.4 碳源對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 以改良馬丁氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、可溶性淀粉等配制不同碳源的供試培養(yǎng)基，將直徑為 5 mm的菌餅接種在供試培養(yǎng)基的中央.其他同1.2.4.1.

1.2.4.5 氮源對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 以改良馬丁氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入尿素、KNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、牛肉膏等配制不同氮源的供試培養(yǎng)基將直徑為5 mm的菌餅接種在供試培養(yǎng)基的中央.其他同1.2.4.1.

1.2.4.6 pH對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 用無菌的1 mol/L的NaOH和HCL配制4、5、6、7、8、9、10等幾種不同pH的PDA培養(yǎng)基，將直徑為5 mm的菌餅接種于上述不同pH的培養(yǎng)基的中央.其他同1.2.4.1.

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010、SPSS 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，用Origin 9.0作圖，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 油桃酸腐病癥狀

該病主要發(fā)生于油桃果實(shí)成熟期，尤其是儲(chǔ)藏期發(fā)生普遍嚴(yán)重.果實(shí)上發(fā)病初期(圖1-A)有灰褐色的水漬狀病斑出現(xiàn)，隨著病斑的不斷擴(kuò)大，病斑處開始變軟并且有少量的白色霉?fàn)钗锍霈F(xiàn)(圖1-B)，發(fā)病后期整個(gè)果實(shí)變軟腐爛而且有大量酸汁液流出，散發(fā)出濃烈的酸臭味.

圖1 油桃采樣發(fā)病初期(A)及后期(B)癥狀Figure 1 Symptoms of nectarine sampling at early stage (A) and later stage (B)

2.2 致病性測(cè)定

采用組織分離法從發(fā)病的油桃上分離出2株分離物，分別命名為YT-1和YT-2，保存于4 ℃冰箱備用.離體接種結(jié)果表明，接種YT-2分離物的(圖2-A)油桃復(fù)試出現(xiàn)的發(fā)病癥狀與采樣癥狀(圖1)相似，而對(duì)照(圖2-B)和YT-1處理沒有形成任何癥狀；同時(shí)，針刺接種YT-2的油桃果實(shí)在接種3 d后出現(xiàn)明顯病斑，而無傷接種的果實(shí)則在接種5～6 d后出現(xiàn)明顯的癥狀，初期出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，后期長出白色霉層且散發(fā)出臭味.且在發(fā)病部位再次分離得到接種菌，表明YT-2為油桃酸腐病的致病菌.

2.2 病原菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征 將保存的YT-2在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后得到的菌落直徑為7.1～7.6 cm，菌落正反面均為乳白色，表面近絨狀，菌絲極短，分布有少數(shù)白粉狀物，菌落放射狀生長(圖3-A、3-B)，且揮發(fā)出酒香味.在顯微鏡下可以觀察到有隔膜的菌絲，無色，有較短的分生孢子梗，老熟菌絲斷裂為兩頭鈍圓的長筒形或者橢圓形分生孢子，單個(gè)孢子呈不規(guī)則分布，大小為4.7～10 μm×3.4～7.5 μm，產(chǎn)孢量多(圖3-C、3-D).

圖2 油桃果實(shí)刺傷接種YT-2分離物的癥狀(A)及對(duì)照組(B)Figure 2 Symptoms of nectarine fruit inoculated with YT-2 isolate (A) and control group (B)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 菌株YT-2的基因序列經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到大約247 pb的片段，GenBank登錄號(hào)為MW320456，其序列經(jīng)過Blast比對(duì)表明該菌株與白地霉(Geotrichumcandidum)的同源性較高，相似度高達(dá)97.34%，進(jìn)一步從GenBank數(shù)據(jù)庫選擇白地霉及其近緣種的rDNA-ITS序列，與供試菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由系統(tǒng)發(fā)育樹圖4可知，菌株YT-2和Geotrichumcandidum(AB000652.1)以99%的支持率聚在同一分支上，再結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果確定其為白地霉.

A：菌落正面；B：菌落反面；C、D：孢子形態(tài)特征.A is the front side of the colony;B is the opposite side of the colony.Both C and D represent the morphological characteristics of spores.圖3 菌落特征及孢子形態(tài)Figure 3 Colony characteristics and spore morphology

圖4 菌株YT-2的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 ITS sequence phylogenetic tree of strain YT-2

2.3 病原菌生物學(xué)特性

2.3.1 不同溫度對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 由圖5可知，供試菌株在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中生長7 d以后的菌落直徑顯著高于(P<0.05)其他幾個(gè)處理，菌落直徑高達(dá)7.85 mm；在該溫度條件下的產(chǎn)孢量為1.26×108個(gè)/mL，也顯著高于(P<0.05)其他幾個(gè)溫度處理，且由圖5可以看到，在5～25 ℃該菌株菌落直徑和產(chǎn)孢量都在逐漸增加，超過25 ℃以后，兩者逐漸降低.說明該菌株在25 ℃的恒溫環(huán)境中生長的最好，溫度過高過低都不利于菌株菌落的生長和產(chǎn)孢.

圖5 溫度對(duì)菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響Figure 5 Influence of temperature on mycelial growth and sporulation

2.3.2 不同光照對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 通過光照對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量影響的試驗(yàn)結(jié)果(圖6)可以看到，12 h光照黑暗交替條件下的菌落直徑最高為7.9 cm，顯著高于(P<0.05)其他兩個(gè)處理.但是連續(xù)黑暗處理和光照交替處理組的產(chǎn)孢量沒有顯著差異，都顯著高于連續(xù)光照處理組.

2.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 由圖7 可知，供試菌株在PDA培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和孟加氏培養(yǎng)基上菌絲生長的較好，菌落直徑都達(dá)到了6.0 cm以上，且在PDA培養(yǎng)基上菌落直徑可以達(dá)到7.37 cm，顯著高于其他五種培養(yǎng)基(P<0.05)，但是菌落比較疏松稀薄.孟加氏培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基的菌落直徑?jīng)]有顯著差異(P>0.05)，僅次于PDA培養(yǎng)基，菌落生長密集且產(chǎn)孢量極高，馬丁氏培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量顯著高于(P<0.05)產(chǎn)孢量排在第二的孟加氏培養(yǎng)基，可達(dá)2.22×109個(gè)/mL.其他四種培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量之間無顯著差異(P>0.05)，試驗(yàn)結(jié)果表明，最有利于菌絲生長的培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)基；產(chǎn)孢量最高的則是馬丁氏培養(yǎng)基；不同培養(yǎng)基的類型對(duì)供試菌株的菌落生長以及產(chǎn)孢量都有一定的影響.

圖6 光照對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響Figure 6 Influence of light on mycelial growth and sporulation

圖7 不同培養(yǎng)基類型對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響Figure 7 Effects of different medium types on hypha growth and sporulation quantity

2.3.4 碳源對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 由圖8 可知，以葡萄糖和果糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長的最好，兩者之間沒有明顯差異(P>0.05)，但是顯著高于其他五種碳源培養(yǎng)基(P<0.05)，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中菌落直徑最高可達(dá)7.32 cm，且產(chǎn)孢量也顯著高于其他6種(P<0.05)，最高達(dá)4.43×109個(gè)/mL.結(jié)果表明，無論從菌絲生長及產(chǎn)孢量來說，最佳的碳源都是葡萄糖，其次就是果糖.說明碳源對(duì)于菌絲生長還是產(chǎn)孢量都有著重要的影響.

圖8 不同碳源對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響Figure 8 Effects of different carbon sources on mycelia growth and spore production

2.3.5 氮源對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 由圖9 可知，在不同的氮源培養(yǎng)基上菌落的生長直徑和產(chǎn)孢量都有很大的差異，蛋白胨做氮源的時(shí)候菌落直徑最大，可達(dá)7.13 cm，顯著高于其他幾種氮源培養(yǎng)基(P<0.05)，且產(chǎn)孢量最高達(dá)3.35×109個(gè)/mL.牛肉膏和硝酸鉀的菌落直徑次于蛋白胨，兩者之間沒有顯著差異(P>0.05)，但是牛肉膏的產(chǎn)孢量卻顯著高于硝酸鉀(P<0.05).試驗(yàn)結(jié)果表明，適合菌絲生長的最佳氮源是蛋白胨，產(chǎn)孢量最高的是蛋白胨和牛肉膏，氮源對(duì)于菌絲生長和產(chǎn)孢量有著重要的影響.

圖9 不同氮源對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響Figure 9 Effects of different nitrogen sources on hypha growth and spore production

2.3.6 pH對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響 由圖10 可知，不同pH值的培養(yǎng)基中菌落直徑和產(chǎn)孢量都是不同的，pH等于10的時(shí)候菌落直徑最大為7.15 cm，顯著高于其他(P<0.05)，隨著pH值的降低，菌落直徑的大小也在下降.然而pH值為4的時(shí)候產(chǎn)孢量最高且顯著高于其他(P<0.05)，pH為8時(shí)產(chǎn)孢量最低.該菌隨著pH值的增大菌落直徑也在緩慢增大，但是隨著pH值的增大產(chǎn)孢量不斷減小，說明該菌適應(yīng)的pH范圍比較廣.

圖10 不同pH值對(duì)菌絲生長以及產(chǎn)孢量的影響Figure 10 Effects of different pH values on mycelia growth and spore production

3 討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)油桃酸腐病癥狀的觀察、病菌的分離純化、致病性測(cè)定、以及形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，證明引起油桃酸腐病的病原為白地霉(Geotrichumcandidum).這是國內(nèi)首次比較系統(tǒng)的對(duì)油桃酸腐病的報(bào)道.白地霉寄主范圍比較廣泛，可侵染荔枝[21]、番茄[22]、胡蘿卜[23]、歐李[24]和太子參[25]等多種蔬菜、水果和中藥材引起酸腐病，造成果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響其商品價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

本研究發(fā)現(xiàn)，該病原菌最適生長溫度為25 ℃，最適菌絲生長的光照條件為12 h光暗交替，在4～10的pH范圍內(nèi)該病原菌均可以生長，pH為10時(shí)菌落直徑最大，其中溫度和光照條件的研究結(jié)果與蔡學(xué)清等[26]的研究結(jié)果相似.白地霉(G.candidum)在不同種類的培養(yǎng)基上都可以生長，在PDA培養(yǎng)基中菌絲生長的最好，在馬丁氏培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最高，而在查氏培養(yǎng)基和合成低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中菌絲生長緩慢且產(chǎn)孢量都不高，這可能是因?yàn)榘椎孛共⒉贿m合在微量成分復(fù)雜的培養(yǎng)基中生長，影響其生長的微量元素還需進(jìn)一步研究.無論是從菌絲生長還是從產(chǎn)孢量來看，該菌株生長的最佳碳源均為葡萄糖，其次是果糖和蔗糖，在無碳培養(yǎng)基和可溶性淀粉培養(yǎng)基中生長差異最低且兩者之間不顯著，這與果實(shí)成熟期果糖和葡萄糖含量達(dá)最大值一致.最佳的氮源是蛋白胨，在無氮源的培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基中生長狀況差，說明白地霉的生長對(duì)于氮源有很嚴(yán)格的要求，成分復(fù)雜的有機(jī)氮源比無機(jī)氮更有利于該病原菌的生長，這與高瑩等[27]的研究結(jié)果相似.

酸腐病主要發(fā)生在果實(shí)采后儲(chǔ)藏期，研究發(fā)現(xiàn)，病原菌容易從傷口侵入，同時(shí)低溫(5 ℃)條件下病原菌生長緩慢，因此，在油桃采收時(shí)，為了避免酸腐病的嚴(yán)重發(fā)生，應(yīng)當(dāng)盡量使果實(shí)少受機(jī)械損傷，并且及時(shí)進(jìn)行低溫保存.對(duì)油桃酸腐病的病原菌鑒定及生物學(xué)特性的研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究和防治油桃酸腐病提供相關(guān)理論依據(jù).