朱小芳，張曉波，錢秀娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes，EPN)是指蟲體內(nèi)帶有病原性共生細(xì)菌、能引起昆蟲致病的一類線蟲[1]，主要包括斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲屬(Heterorhabditis).昆蟲病原線蟲具有寄主范圍廣、能主動搜尋寄主昆蟲、可在侵染寄主后28～48 h內(nèi)引起寄主昆蟲死亡和對動植物和人類及生態(tài)環(huán)境安全等特點[2-3].昆蟲病原線蟲具有天敵昆蟲兼病原微生物的雙重特點，可部分替代化學(xué)殺蟲劑[4-6].昆蟲病原線蟲對多種地下害蟲控制效能較高，且具有一定的抵抗力，可以與一些殺蟲劑混用來防治地下害蟲的危害.作為一種高效安全且對環(huán)境友好的生防因子，昆蟲病原線蟲已成為害蟲綠色防控中倍受重視和最具發(fā)展前景的高效生物殺蟲劑之一[7].昆蟲病原線蟲對250多種隱蔽性害蟲有控害作用[8-9]，在已描述的90多種昆蟲病原線蟲中，至少有12種已被商品化用于生物防治[10-11].因此，昆蟲病原線蟲不僅在各個領(lǐng)域被廣泛用作生物殺蟲劑，而且成為害蟲持續(xù)控制的研究方向[12-13]；目前，全球約60多個國家的100多個實驗室在開展昆蟲病原線蟲的研究，致力于這種新型生物殺蟲劑的推廣應(yīng)用[7,14].

影響昆蟲病原線蟲防治效果的因素有環(huán)境條件、田間施用技術(shù)和線蟲特性等，只有明確各因素的作用，才能充分發(fā)揮其控制害蟲的潛力.其中，施用技術(shù)直接影響防治效果，田間施用位置越接近害蟲，防治效果越佳[13].Serwe-Rodriguez等[15]研究表明，在環(huán)境脅迫下,蟲尸劑(感染昆蟲病原線蟲的昆蟲尸體)能夠幫助昆蟲病原線蟲抵御不良環(huán)境.Bornstein-Forst等[16]對線蟲S.carpocapsaeA10的研究結(jié)果表明,低溫脅迫會對線蟲在大蠟螟寄主體內(nèi)的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響,其在低溫條件下發(fā)育過程會停止,并且大蠟螟體內(nèi)的的線蟲會死亡很大一部分；同時,溫度升高到適合線蟲發(fā)育后,大蠟螟體內(nèi)的線蟲會發(fā)育成為侵染期線蟲.Monteiro等[17]研究表明，與噴灑線蟲懸浮液的施用方式相比,田間直接施用蟲尸劑的防治效果更明顯.如何使用蟲尸劑對有害靶標(biāo)昆蟲進(jìn)行高效防治,已經(jīng)成為昆蟲病原線蟲應(yīng)用研究的熱點之一[18-19].

昆蟲病原線蟲對害蟲的控制效果主要取決于其田間適應(yīng)能力，尤其是其越冬越夏情況.昆蟲病原線蟲在大田環(huán)境下的種群消長情況及越冬越夏存活情況直接決定了線蟲的使用頻率和防治成本，對于利用線蟲防治地下害蟲的推廣意義重大.因此，對于昆蟲病原線蟲越冬越夏能力的調(diào)查，能夠更好地在生產(chǎn)實踐中指導(dǎo)人們選擇優(yōu)良的方法進(jìn)行害蟲防治[20-21].

西北地區(qū)氣候干旱，晝夜溫差大，引進(jìn)的昆蟲病原線蟲適應(yīng)性差，為開發(fā)本地資源，谷黎娜對甘肅省內(nèi)誘集的29個昆蟲病原線蟲品系進(jìn)行了初步篩選[22].本試驗以篩選出的2種侵染力較高的昆蟲病原線蟲異小桿線蟲H.megidis0627M和斯氏線蟲S.feltiae0619HT為研究對象，通過不同施用方法及施用劑量下斯氏線蟲和異小桿線蟲的越冬越夏及其分布情況(田間動態(tài)分布)的調(diào)查研究，以期篩選出昆蟲病原線蟲較好的施用方法，并為其在田間的大規(guī)模施用提供一定的理論支撐，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

大蠟螟(Galleriamellonella)5齡老熟幼蟲由天津惠裕德生物科技有限公司提供，試驗前經(jīng)滯育處理以防止大蠟螟幼蟲吐絲、結(jié)繭.

異小桿線蟲H.megidis0627M和斯氏線蟲S.feltiae0619HT由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)蟲室提供，貯存方法為低溫保存線蟲懸浮液，每2個月擴繁1次[23].

1.2 試驗樣地

甘肅蘭州市位于N 36°03′,E 103°40′，年降水量為250～350 mm，屬溫帶大陸性氣候,年平均氣溫10.3 ℃.試驗地為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)地下害蟲研究試驗用地，每塊大小為1.2 m×0.6 m，田塊之間以水泥隔開，且都以水泥封底，試驗前對各田塊土壤進(jìn)行滅菌處理.在試驗田內(nèi)種上韭菜(模擬田間生長環(huán)境)，待韭菜長勢良好時，在10塊試驗田內(nèi)施入韭蛆(以紗網(wǎng)覆蓋)，使韭蛆在田間建立種群.試驗開始之前對這些田塊的土壤進(jìn)行了多次取樣調(diào)查，均未得到昆蟲病原線蟲以及植物性寄生線蟲和腐生線蟲.

1.3 試驗方法

1.3.1 昆蟲病原線蟲懸浮液和蟲尸劑的獲取及施用 本試驗采用線蟲懸浮液3×105、線蟲懸浮液4×105、線蟲懸浮液5×105、蟲尸劑8頭和線蟲懸浮液3×105+蟲尸劑8頭五種的處理方法.

蟲尸劑的獲?。涸囼炃? d，選取體重基本一致(約0.35 g)的大蠟螟置于24孔板內(nèi)，分別用斯氏線蟲S.feltiae0619HT和異小桿線蟲H.megidis0627M的侵染期線蟲侵染大蠟螟，置于室溫(25 ℃)下培養(yǎng)[24].并收集蟲尸留用.

懸浮液的獲取方法：在室溫(25 ℃)下，用大蠟螟進(jìn)行活體擴繁，并用White trap法收集侵染期線蟲.收集得到的線蟲懸浮液保存于4 ℃冰箱中，試驗所用的線蟲為新鮮培養(yǎng).

線蟲懸浮液及蟲尸劑的施用：2018年10月，分別將異小桿線蟲H.megidis0627M 和斯氏線蟲S.feltiae0619HT的懸浮液噴灑施入試驗地表層土壤、蟲尸劑置于土表.之后覆蓋一層薄土，以防止紫外線對昆蟲病原線蟲的影響[25].

1.3.2 昆蟲病原線蟲田間種群消長規(guī)律測定 每月統(tǒng)計試驗地中昆蟲病原線蟲的種群數(shù)量.統(tǒng)計方法為五點取樣法，采集深度分別為0～10、11～20、21～30 cm，每個土層分別采集100 g左右土壤樣品，帶回實驗室.

采集后稱取100 g土壤樣品，加入500 mL水，用貝爾曼漏斗法分離線蟲，獲得的線蟲懸浮液，搖勻后取45 mL懸浮液置于離心管中離心5 min(5 400 r/min)，棄去上清液40 mL，在體式顯微鏡下觀察并統(tǒng)計昆蟲病原線蟲的數(shù)量.

1.2.3 越冬越夏情況調(diào)查 分別在越夏(6～8月)和越冬(12月和次年1～2月)時期每隔15 d進(jìn)行1次昆蟲病原線蟲種群數(shù)量測定，了解昆蟲病原線蟲越冬越夏情況.

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 旱區(qū)昆蟲病原線蟲田間種群消長規(guī)律

研究結(jié)果表明，在施用后為期1 a的調(diào)查中，11月份以懸浮液3×105頭+蟲尸劑8頭的施用方法施用后，2種昆蟲病原線蟲H.megidis0627M和S.feltiae0619HT均能在田間建立種群.之后H.megidis0627M和S.feltiae0619HT 2種品系線蟲數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢，12月份出現(xiàn)第1個峰值，說明線蟲在田間定殖后進(jìn)行了擴繁.1月份和2月份線蟲數(shù)量均處于低谷，為線蟲的越冬期；翌年4月份出現(xiàn)第2個峰值，因越冬代幼蟲復(fù)蘇后，再一次進(jìn)行擴繁.此后，線蟲種群數(shù)量出現(xiàn)平緩的下降趨勢，但是種群數(shù)量與剛施入田間1月后的種群數(shù)量差異不顯著(P>0.05).說明懸浮液+蟲尸劑施用后，昆蟲病原線蟲H.megidis0627M和S.feltiae0619HT施入甘肅地區(qū)田間后，均能建植種群并定殖、安全越冬越夏.2種昆蟲病原線蟲H.megidis0627M和S.feltiae0619HT在1 a內(nèi)的種群數(shù)量變化趨勢一致，且在為期1 a的觀察中，S.feltiae0619HT的田間種群數(shù)量顯著高于H.megidis0627M(圖1).

2.2 旱區(qū)昆蟲病原線蟲越冬觀測

2.2.1 不同施用方法對越冬的影響 研究結(jié)果表明，在不同的施用方法下，昆蟲病原線蟲S.feltiae0619HT和H.megidis0627M越冬數(shù)量有差異，但均可安全越冬.以3×105懸浮液、4×105懸浮液、5×105懸浮液、蟲尸劑8頭和3×105懸浮液+蟲尸劑8頭施入后，在 11～20 cm土層中的S.feltiae0619HT的種群數(shù)量分別為896.45、904.27、953.64、821.44、1 296.28頭，均高于0～10 cm和21～30 cm土層中的種群數(shù)量，且差異顯著(P<0.05).且在11～20 cm土層中，3×105懸浮液+蟲尸劑8頭的施用方法下昆蟲病原線蟲S.feltiae0619HT的種群數(shù)量為1 296.28頭，均高于其他施用方法，且差異顯著(P<0.05)；以3×105懸浮液、4×105懸浮液、5×105懸浮液、蟲尸劑8頭和3×105懸浮液+蟲尸劑8頭施入后，在0～10 cm土層中的H.megidis0627M的種群數(shù)量分別為615.14、708.52、798.27、684.35和940.35頭，均顯著高于11～20 cm和21～30 cm土層中的種群數(shù)量.且在0～10 cm土層中，3×105懸浮液+蟲尸8頭的施用方法下昆蟲病原線蟲H.megidis0627M的種群數(shù)量為940.35，顯著高于其他4種施用方法(表1).

圖 昆蟲病原線蟲的田間消長規(guī)律Figure 1 Population dynamics of entomopathogenic nematodes in field

表1 昆蟲病原線蟲H.megidis 0627M和S.feltiae 0619H T越冬情況

2.2.2 昆蟲病原線蟲越冬時在土壤中的空間分布 研究結(jié)果表明，不同品系的昆蟲病原線蟲越冬分布情況存在差異，其中斯氏線蟲S.feltiae0619HT主要分布在11～20 cm土層越冬，在11～20 cm土層中的分布占總數(shù)58%,顯著大于0～10 cm和21～30 cm土層(P<0.05)，0～10 cm和21～30 cm土層分布之間差異不顯著(P>0.05)；異小桿H.megidis0627M主要分布在0～10 cm土層越冬，在0～10 cm土層中的分布占總數(shù)56%,顯著大于11～20 cm和21～30 cm土層(P<0.05)，11～20 cm和21～30 cm土層分布之間差異顯著(P<0.05，圖2).

2.3 旱區(qū)昆蟲病原線蟲的越夏觀測

2.3.1 不同施用方法對越夏的影響 研究結(jié)果表明，在不同的施用方法下，S.feltiae0619HT和H.megidis0627M越夏種群數(shù)量有差異，但均可安全越夏.其中在6～8月，在3×105懸浮液+蟲尸劑8頭的施用方法下，S.feltiae0619HT越冬種群數(shù)量分別為593頭、582頭、585頭，均顯著高于其他施用方法(P<0.05).6～8月之間種群數(shù)量差異不顯著(P>0.05)；在8月份時，3×105懸浮液+蟲尸8頭的施用方法下昆蟲病原線蟲H.megidis0627M越冬種群數(shù)量為432頭，顯著高于其他施用方法(P<0.05).6～8月之間種群數(shù)量差異不顯著(P>0.05，表2).

圖2 昆蟲病原線蟲越冬分布情況Figure 2 Distribution of entomopathogenic nematodes during over wintering period

表2 昆蟲病原線蟲H.megidis 0627M和S.feltiae 0619H T越夏情況

2.3.2 昆蟲病原線蟲越夏時在土壤中的空間分布 研究結(jié)果表明，S.feltiae0619HT與H.megidis0627M的越夏分布情況無明顯差異，都集中在11～20 cm土層中.其中斯氏線蟲S.feltiae0619HT主要在11～20 cm土壤層中進(jìn)行越夏活動，在11～20 cm土層中的分布占總數(shù)57%,顯著大于0～10 cm和21～30 cm土層(P<0.05)，0～10 cm和21～30 cm土層分布之間差異不顯著(P>0.05)，異小桿H.megidis0627M主要分布在11～20 cm土層越冬，在11～20 cm土層中的分布占總數(shù)60%,顯著大于0～10 cm和21～30 cm土層(P<0.05)，11～20 cm和21～30 cm土層分布之間差異不顯著(P>0.05，圖3).

3 討論

李春杰等[26]研究發(fā)現(xiàn)，越冬過程中隨溫度的降低，異小桿線蟲Heterorhabditisbacteriophora-HBN有向深層土壤遷移的趨勢，但移動距離很??；Susurluk[27]認(rèn)為在低溫條件下，線蟲會進(jìn)行垂直向上的遷移運動，低溫對異小桿H.bacteriophora線蟲的遷移能力抑制性較強，而對斯氏線蟲的抑制力弱.本試驗調(diào)查結(jié)果與他們的研究結(jié)果相符合，2種昆蟲病原線蟲斯氏線蟲S.feltiae0619HT和異小桿線蟲H.megidis0627M在施用時處于同一深度，而在越冬調(diào)查時其種群空間分布情況有了較大的差異，斯氏線蟲S.feltiae0619HT主要分布在11～20 cm土壤深度中，異小桿線蟲H.megidis0627M則主要分布在0～10 cm土壤深度中，說明斯氏線蟲的空間移動能力要比異小桿線蟲強.

圖3 昆蟲病原線蟲越夏分布情況Figure 3 Distribution of entomopathogenic nematodes during oversummering period

Kung等[28]研究表明土壤溫度較高不利于昆蟲病原線蟲活動，甚至?xí)?dǎo)致線蟲的死亡.本試驗調(diào)查結(jié)果顯示，越夏時2種昆蟲病原線蟲的種群數(shù)量降低，且隨著溫度的升高，2種昆蟲病原線蟲越夏時在0～10 cm的土層中的線蟲數(shù)量最少，主要集中在21～30 cm，說明夏季高溫對昆蟲病原線蟲的活動和種群數(shù)量造成了影響.因此在夏季施用昆蟲病原線蟲時，應(yīng)考慮溫度對昆蟲病原線蟲活動和種群數(shù)量的影響，盡量在低溫天氣施用，且應(yīng)將線蟲施入較深土層.

在大田環(huán)境下，僅施用昆蟲病原線蟲懸浮液能夠保證在施用初期擁有一個較高的種群密度，提高防治效果，但短時間內(nèi)其種群密度下降明顯；單一施用蟲尸劑在越冬后其種群數(shù)量會有明顯上升，但在施用初期種群密度小，在寒冷環(huán)境下昆蟲病原線蟲釋放較慢.而施用懸浮液+蟲尸劑后，懸浮液可以使昆蟲病原線蟲在施用初期有一個較大的種群密度，蟲尸劑在低溫下又減緩了線蟲的發(fā)育和釋放并且?guī)椭ハx病原線蟲躲避惡劣環(huán)境、安全越冬.因此，施用懸浮液+蟲尸劑既確保了初始種群密度，又可以保證在越冬后仍保持一個較高的種群密度，是一種較為優(yōu)秀的田間施用方法.

本試驗研究了不同施用方式下2種昆蟲病原線蟲在蘭州地區(qū)的越冬越夏及田間消長規(guī)律，為兩種昆蟲病原線蟲在旱區(qū)應(yīng)用提供了一定理論依據(jù).但昆蟲病原線蟲在田間實際應(yīng)用中還受到很多因素的影響，如紫外輻射、土壤質(zhì)地類型、寄主昆蟲的種類和數(shù)量、噴施殺蟲劑和日常的農(nóng)田管理等.因此，在實際運用時還需綜合考慮其他因素.

4 結(jié)論

S.feltiae0619HT和H.megidis0627M施用后，均能在田間建立穩(wěn)定種群，在田間推廣應(yīng)用的前景較為廣闊.在3×105懸浮液+蟲尸劑8頭的施用方法下，S.feltiae0619HT比H.megidis0627M更易在田間建立種群和定殖生存；兩種昆蟲病原線蟲在越夏期6～8月時種群數(shù)量和其他月份差異不顯著，但其空間分布發(fā)生變化.

不同施用方法下，斯氏線蟲S.feltiae0619HT和異小桿H.megidis0627M均可在甘肅蘭州田間安全越冬.3×105懸浮液+蟲尸劑8頭施用方法下，2種昆蟲病原線蟲的越冬種群數(shù)量均顯著高于其他施用方法；不同品系的線蟲越冬分布情況存在差異，斯氏線蟲S.feltiae0619HT主要在11～20 cm土壤深度越冬；異小桿線蟲H.megidis0627M主要在0～10 cm土壤深度越冬，2種品系的昆蟲病原線蟲在21～30 cm土壤深度均分布較少.

不同施用方法下，斯氏線蟲S.feltiae0619H和異小桿線蟲H.megidis0627M均可在甘肅蘭州田間安全越夏.其中3×105懸浮液+蟲尸劑8頭的施用方法下，2種昆蟲病原線蟲的越夏種群數(shù)量均顯著高于其他施用方法；斯氏線蟲S.feltiae0619HT和異小桿線蟲H.megidis0627M越夏土壤深度都為11～20 cm.

懸浮液+蟲尸劑的施用方法既能確保施用初期的昆蟲病原線蟲種群密度，有利于昆蟲病原線蟲建立穩(wěn)定種群，同時可保證昆蟲病原線蟲在越冬越夏后有較高的種群密度，是一種較為優(yōu)秀的田間施用方法.