翁秀秀，劉婷

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育與其健康和營(yíng)養(yǎng)關(guān)系密切[1].瘤胃組織形態(tài)學(xué)發(fā)育[2-3]，瘤胃發(fā)酵功能完善[4-5]和瘤胃微生物的定植[6]是衡量瘤胃發(fā)育的重要指標(biāo).其中，探討瘤胃微生物區(qū)系的定植規(guī)律是當(dāng)前幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育的研究熱點(diǎn).16S rRNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為一種普遍方法用于瘤胃微生物區(qū)系多樣性的研究.前期研究發(fā)現(xiàn)，幼齡反芻動(dòng)物剛出生時(shí)，瘤胃內(nèi)是一個(gè)無(wú)菌的環(huán)境，出生后24 h，來(lái)自于初乳和環(huán)境的微生物在瘤胃內(nèi)快速定植.變形菌被擬桿菌逐漸代替；第3天到第12天之間，瘤胃尚未發(fā)育成熟，但許多細(xì)菌組成的細(xì)菌群落已經(jīng)能被檢出，第9天到第15天之間，瘤胃微生物迅速定植，門水平變化的研究結(jié)果存在差異；從15 d開(kāi)始，盡管一些微生物在屬的相對(duì)豐度發(fā)生變化，但在門水平不再表現(xiàn)出明顯的時(shí)間相關(guān)性[7-9].這些研究結(jié)果的差異大多歸結(jié)于飼料組成和飼養(yǎng)方式的差異，卻忽略了這些研究中瘤胃微生物基因組DNA提取方法不同引起結(jié)果出現(xiàn)差異的可能性.Yu等[10]提出瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的研究也受DNA提取方法的影響，也有學(xué)者研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)[11-12].目前提取瘤胃微生物基因組DNA的方法眾多，其中對(duì)比成年反芻動(dòng)物瘤胃微生物基因組DNA的方法也有相關(guān)報(bào)道[13-15]，如隋昶生等[13]的結(jié)果表明，凍融法結(jié)合CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)更適合提取嶗山奶山羊瘤胃微生物總DNA；張玲等[14]采用酶解、凍融和SDS(十二烷基磺酸鈉)、CTAB相結(jié)合的方法提取雙峰駝瘤胃微生物總DNA，得到的瘤胃微生物DNA濃度和穩(wěn)定性更高；Durgadevi等[15]對(duì)山羊瘤胃微生物基因組DNA的提取方法做了系統(tǒng)的優(yōu)化.但適合于羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA提取方法的研究卻鮮有報(bào)道.綜上所述，本試驗(yàn)擬改進(jìn)傳統(tǒng)瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA的提取方法，利用q-PCR技術(shù)進(jìn)行瘤胃細(xì)菌和古菌拷貝數(shù)分析，比較不同提取方法對(duì)羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物多樣性的影響，以期篩選出適用于羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA的提取方法.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗(yàn)選用6只健康、體質(zhì)量接近(9.53±0.87 kg)、飼喂同種飼料的56日齡湖羊公羔.羔羊頸靜脈放血屠宰后，迅速分割出瘤胃，混勻瘤胃內(nèi)容物后，用5 mL凍存管(滅菌)收集瘤胃內(nèi)容物，快速放入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃超低溫冰箱中保存，作為瘤胃微生物基因組DNA提取的試驗(yàn)樣品.

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

CTAB、NaCl、EDTA(乙二胺四乙酸)、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇、GITC(異硫氰酸胍)、SDS均為國(guó)產(chǎn)分析純；Tris-HCl(pH 8.0)、蛋白酶K、PBS(磷酸鹽緩沖液，pH 7.2 )購(gòu)自北京Solarbio生物公司；M5 HiPer pTOPO-TA Cloning Kit(快速克隆試劑盒)購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit(質(zhì)粒DNA提取試劑盒)購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；qPCR SuperMix購(gòu)自浙江博而金科技股份有限公司.

ND-1000微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó) Nanodrop公司；q-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；MS 3 basic漩渦振蕩器購(gòu)自艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司.

1.3 微生物基因組DNA提取

液氮研磨+珠磨+CTAB法：將6份冷凍樣品混合于研缽(滅菌)中，加液氮充分研磨并混勻，稱取0.5 g研磨后的樣品于2 mL離心管中并加入0.3 g玻璃珠，再加入1.0 mL提取液[1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、2% CTAB和0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)]，用漩渦振蕩器混勻5 min；加入20 μL蛋白酶K，70 ℃水浴15 min，90 ℃水浴5 min，室溫下14 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL離心管中，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)，劇烈搖勻，室溫14 000 r/min離心10 min，可見(jiàn)有3層，將上清移至1.5 mL離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻；隨后轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱過(guò)夜；過(guò)夜解凍后室溫14 000 r/min離心10 min，棄上清可見(jiàn)有白色DNA沉淀，加入70%酒精沖洗沉淀2次，每次離心10 min，倒置風(fēng)干至半干，用50 μL雙蒸水溶解DNA沉淀，-20 ℃保存.

珠磨+CTAB法：將6份冷凍樣品解凍后混合均勻，并稱取0.5 g混合樣品于2 mL離心管中并加入0.3 g玻璃珠，以下步驟同液氮研磨+珠磨+CTAB法.

液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法：將6份冷凍樣品混合于研缽(滅菌)中，加液氮充分研磨并混勻，取0.5 g研磨后的樣品于2 mL離心管中并加入0.3 g玻璃珠，再加入1 mL提取液(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.5% NaCl、4% SDS和0.1 mol/L EDTA)，渦旋混勻5 min；加入20 μL蛋白酶K，70℃孵育15 min，90℃孵育5 min；加入200 μL 5 mol/L GITC，混勻后繼續(xù) 65 ℃水浴15 min，1 4000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL離心管中，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)500 μL，搖勻后靜置5 min，14 000 r/min離心10 min，抽取上清至1.5 mL離心管中，加入0.8倍體積預(yù)冷的異丙醇，冰上放置1 h；14 000 r/min離心10 min，移除試管內(nèi)液體，保留白色沉淀，加入70%酒精沖洗沉淀2次，每次離心10 min，倒置風(fēng)干至半干，用50 μL雙蒸水溶解DNA沉淀，-20℃保存.

液氮研磨+CTAB+SDS法：將6份冷凍樣品混合于研缽(滅菌)中，加液氮充分研磨并混勻，稱取0.5 g研磨后的樣品于2 mL離心管中，加入1 mL提取液 [100 mmol/LTris- HCl(pH 8.0)、1.5% NaCl、1% CTAB、0.1 mol/L EDTA和10 mmol/L PBS(pH 7.2)]和75 μL 10% SDS，渦旋混勻5 min；加入20 μL蛋白酶K，70 ℃孵育15 min，90 ℃孵育5 min，室溫14 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL離心管中，加入苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)500 μL，搖勻后靜置5 min；以下步驟同液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法.

將提取的微生物基因組DNA樣品置于-20 ℃冰箱中妥善保存，便于后續(xù)試驗(yàn)分析.

1.4 基因組DNA濃度、純度及片段完整性檢測(cè)

提取到的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段完整性，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定微生物基因組DNA濃度(ng/μL)及D260/280和D260/230比值.

1.5 q-PCR分析

1.5.1 q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 用M5 HiPer pTOPO-TA Cloning Kit快速克隆試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行克隆，具體操作嚴(yán)格參考說(shuō)明書.用AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit提取微生物質(zhì)粒DNA.檢測(cè)質(zhì)粒DNA濃度，根據(jù)各質(zhì)粒的分子量與質(zhì)量濃度計(jì)算獲得拷貝數(shù)，并進(jìn)行10倍的連續(xù)梯度稀釋，取8個(gè)稀釋梯度制得標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行q-PCR反應(yīng)，每梯度3個(gè)重復(fù)，繪制Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)間關(guān)系的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線.各菌所用引物序列見(jiàn)表1.

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算公式:

質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=濃度(ng/μL)×10-9(ng/μL與g/μL之間的換算)×6.02×1023(copies/mol) / [660(g/mol/bp) ×質(zhì)粒堿基對(duì)數(shù)(bp)][16].

1.5.2 q-PCR檢測(cè)條件 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和樣品的q-PCR反應(yīng)體系均采用20 μL體系.反應(yīng)體系：2×Biogold qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，質(zhì)粒DNA模板(樣品DNA模板)1 μL，雙蒸水8.2 μL.反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min.

1.5.3 樣品中微生物的拷貝數(shù)計(jì)算 將每種微生物的Ct值代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用公式計(jì)算得到樣品中的微生物拷貝數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

計(jì)算公式：拷貝數(shù)(copies/g)=(MQ×C×VD)/(S×V).其中MQ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值得到的拷貝數(shù)(copies)，C是每個(gè)樣品基因組DNA 的濃度(ng/μL)，VD是提取DNA時(shí)最后溶解DNA 的雙蒸水的體積(μL)，S為用于q-PCR的DNA量(ng)，V為提取DNA時(shí)所稱量的樣品量(g)[23].

表1 微生物引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)測(cè)得的DNA濃度、D260/280、D260/230比值和不同微生物log(拷貝數(shù))進(jìn)行單因子方差(one-way ANOVA)分析，差異顯著時(shí)，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA的濃度、純度及片段完整性比較

從圖1可以看出，4種提取方法均能得到微生物基因組DNA，但提取效果存在差異.液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法條帶較暗且條帶下部有明顯拖尾現(xiàn)象，液氮研磨+CTAB+SDS法條帶較液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法弱，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法條帶最亮，條帶無(wú)拖尾也無(wú)雜質(zhì)污染，說(shuō)明該方法所獲得的基因組DNA產(chǎn)量較高.

由表2可以看出，4種方法所提取的瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA濃度和D260/280、D260/230比值均存在顯著差異(P<0.001).珠磨+CTAB法獲得的DNA樣品濃度最高，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法獲得的DNA濃度次之，平均濃度為1 121.15 ng/μL.OD260/280比值反映蛋白質(zhì)污染情況，測(cè)得液氮研磨+珠磨+CTAB法、珠磨+CTAB法和液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所得DNAD260/280>1.9，液氮研磨+CTAB+SDS法所得DNA樣品D260/280<1.8.D260/230比值表征DNA樣品中碳水化合物、腐殖酸和酚類等污染情況，4種方法所得DNAD260/230比值均小于2.0，其中液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法該值最高為1.92，顯著大于另外3種方法(P<0.001)，液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法低于液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法，液氮研磨+CTAB+SDS法D260/230比值最低.

液氮研磨+珠磨+CTAB法(Ⅰ)；珠磨+CTAB法(Ⅱ)；液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法(Ⅲ)；液氮研磨+CTAB+SDS法(Ⅳ).Liquid nitrogen grinding+bead mill+CTAB method (Ⅰ);Bead mill+CTAB method (Ⅱ);Liquid nitrogen grinding+bead mill+SDS+GITC method (Ⅲ);Liquid nitrogen grinding+CTAB.SDS method (Ⅳ).圖1 羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Microbial genomic DNA agarose gel electrophoresis of rumen contents in lambs

表2 不同提取方法獲得的羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA濃度(ng/μL)和D值

2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

以已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行q-PCR反應(yīng)，10倍為一個(gè)稀釋梯度.建立反映Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)應(yīng)關(guān)系的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線和計(jì)算公式可得樣品中各細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量.標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3.從圖3中可以看出，微生物重組質(zhì)粒DAN的的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-0.279 5～-0.347 3，相關(guān)系數(shù)均大于0.98，符合q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求.

圖2 q-PCR檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線Figure 2 Melting curve of plasmid standard substance detected by q-PCR

2.3 羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物拷貝數(shù)

對(duì)4種方法所獲得的羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA樣品進(jìn)行了q-PCR檢測(cè)，根據(jù)q-PCR得到的Ct值及公式計(jì)算出4種方法所得DNA樣品中各細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的拷貝數(shù).

由表3可知，4種方法提取到的基因組DNA經(jīng)q-PCR分析，瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量存在顯著差異(P<0.001)，其中琥珀酸擬桿菌(Fibrobactersuccinogenes)數(shù)量最高，總細(xì)菌(Total bacteria)次之，白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)數(shù)量最少.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所獲得的DNA樣品經(jīng)檢測(cè)瘤胃總細(xì)菌的數(shù)量顯著大于其它方法(P<0.001)、產(chǎn)甲烷菌的豐富度均顯著高于其它方法(P<0.001)，該方法提取效率較高.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法和液氮研磨+CTAB+SDS法所得羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物DNA樣品中琥珀酸擬桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacteramylophilus)、甲烷桿菌(Methanobacteriales)和瘤胃甲烷短桿菌(Methanobrevibacters)的數(shù)量近似，且顯著高于另外2種方法(P<0.001).液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法得到的DNA樣品中溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)數(shù)量顯著高于其它方法(P<0.001)，液氮研磨+CTAB+SDS法對(duì)該菌的提取效率也較高.珠磨+CTAB法獲得的DNA樣品中瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量顯著低于其他3種方法(P<0.001)，且該方法對(duì)于瘤胃產(chǎn)甲烷菌的提取效率較差，總甲烷菌的豐富度僅為5.52 ng/μL，該法所獲得的羔羊瘤胃微生物DNA多樣性較差.液氮研磨+珠磨+CTAB法得到的DNA經(jīng)q-PCR檢測(cè)瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量較珠磨+CTAB法多.

圖3 微生物重組質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of recombinant plasmid DNA of microorganisms

表3 不同DNA提取方法對(duì)羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物數(shù)量的影響

3 討論

羔羊瘤胃內(nèi)容物成分復(fù)雜，含有龐大的微生物種群、飼料殘?jiān)约跋烂撀浼?xì)胞和許多不明生物物質(zhì)[24]，這使得提取高質(zhì)量的羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA有一定難度.本試驗(yàn)中，4種方法提取得到的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，4條泳道均有DNA譜帶出現(xiàn)，每種方法均加入蛋白酶K，促使微生物細(xì)胞破裂而釋放更多的DNA[25]，雖然方法不同，但最終目的都是有效地使微生物細(xì)胞壁裂解，去除非核酸成分且避免核酸的損失而得到高質(zhì)量的基因組DNA[26].液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法條帶有明顯拖尾現(xiàn)象，且泳道下方有亮的核酸短片段，DNA條帶也較液氮研磨+珠磨+SDS +GITC法暗.液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法均使用了CTAB抽提液，CTAB是一種常用的陽(yáng)離子洗滌劑，可以沉淀多糖和蛋白質(zhì)，但是不能有效地裂解細(xì)胞[27].研究發(fā)現(xiàn)，CTAB更適合于提取真菌基因組DNA[28]，CTAB法主要用于植物性總DNA的提取[29].本試驗(yàn)中珠磨+CTAB法得到DNA樣品濃度較高但q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量顯著低于其它3種方法(P<0.001)，可能是提取到了部分瘤胃真菌和瘤胃內(nèi)容物中未完全降解的植物纖維的DNA而導(dǎo)致核酸濃度較高.D260/280、D260/230是評(píng)價(jià)DNA純度的常用指標(biāo)，Henderson等[11]提出用于分子生物學(xué)研究的參考標(biāo)準(zhǔn)，基因組DNAD260/280≈ 1.8，D260/230值在2.0～2.2為宜.結(jié)合表1分析，這兩種方法得到的DNA樣品D260/280值均大于1.9(D260/280≈ 1.8，大于1.9表明有RNA污染；小于1.7表明有蛋白質(zhì)污染)，泳道下部短的核酸片段可能是植物細(xì)胞的DNA或者RNA.試驗(yàn)中液氮研磨+珠磨+CTAB法同時(shí)使用了珠磨和液氮研磨兩種物理破壁方法再結(jié)合CTAB法提取到的DNA樣品經(jīng)q-PCR檢測(cè)瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均高于珠磨+CTAB法(僅用了珠磨)，說(shuō)明增強(qiáng)前期細(xì)胞破壁處理能夠彌補(bǔ)CTAB不能有效裂解微生物細(xì)胞壁的缺陷而得到高質(zhì)量的基因組DNA.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法和液氮研磨+CTAB+SDS法主要采用SDS裂解微生物細(xì)胞，SDS是一種陰離子清洗劑，它能夠破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用，溶解細(xì)胞膜[30].SDS對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的裂解效果，能夠得到高質(zhì)量的微生物基因組DNA[31]，提取過(guò)程中加入SDS裂解液后70 ℃水浴加強(qiáng)了裂解效果.本試驗(yàn)中，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法加入了GITC，其使得蛋白變性，提高了DNA的產(chǎn)量，該方法所得DNA樣品濃度為1121.15 ng/μL，D260/280比值為1.94，D260/230比值為1.92，從q-PCR檢測(cè)結(jié)果(表3)可知，革蘭氏陽(yáng)性菌溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)的數(shù)量均顯著大于其它方法，這一結(jié)果與曾波[32]等的研究結(jié)果一致.但Yu等[33]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用蛋白酶K和GITC提取地表水中鞭毛蟲DNA的產(chǎn)率較低.Myer等[34]利用反復(fù)珠磨結(jié)合SDS提取的肉牛瘤胃微生物基因組DNA可用于16S rRNA測(cè)序分析.本試驗(yàn)結(jié)果表明，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所獲得的羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物DNA樣品用于q-PCR檢測(cè)表明，革蘭氏陽(yáng)性菌溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)的數(shù)量較高，說(shuō)明SDS和GITC對(duì)羔羊瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌有良好的作用，能夠有效地裂解細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞壁上的DNA充分釋放出來(lái)，該方法所獲得的微生物DNA樣品能夠用于羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物的多樣性分析.液氮研磨+CTAB+SDS法提取得到的DNA樣品濃度較液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法低，其D260/230比值為1.64，表明所得DNA樣品存在碳水化合物或者化學(xué)試劑污染，需要進(jìn)一步純化.液氮研磨+CTAB+SDS法對(duì)于瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌DNA的提取效果略低于液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法.

本試驗(yàn)中，珠磨+CTAB法所得DNA樣品濃度較高，利用q-PCR不能高效地檢測(cè)到瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量，液氮研磨+珠磨+CTAB法得到的DNA樣品經(jīng)q-PCR檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于珠磨+CTAB法，這可能是因?yàn)樘崛∵^(guò)程中DNA降解嚴(yán)重，片段不完整，無(wú)法用于分子生物學(xué)研究.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法能夠得到較純的DNA樣品，利用q-PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌.液氮研磨+CTAB+SDS法所獲得DNA樣品濃度和純度低于液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法，需要進(jìn)一步純化，液氮研磨+CTAB+SDS法得到的DNA樣品中瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量與液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法相近.由此得出，SDS較CTAB更適合于提取羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA.綜上所述，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法提取的羔羊瘤胃微生物基因組DNA濃度和純度較高，且q-PCR檢測(cè)出瘤胃細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量最多，能夠提供質(zhì)量較高的羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA用于分子生物學(xué)研究.

4 結(jié)論

本研究采用液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所獲得的羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物基因組DNA質(zhì)量較高，可用于研究羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物的定植.為全面了解羔羊瘤胃健康發(fā)育奠定基礎(chǔ).