周顯飛，張陽，蘭勇，聶寒秋，邢人偉，牟永華

（臺州學(xué)院附屬臺州市立醫(yī)院 肝膽外科，浙江 臺州 318000）

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，病死率仍高居癌癥第二位，在我國每年肝癌新增病例數(shù)占到全球的二分之一[1]。目前在肝癌的早期診斷、手術(shù)切除治療、介入治療以及靶向化療等方面取得了較大進(jìn)展，但肝癌患者的整體生存率并沒有得到明顯的提高[2]。因此，尋找肝癌早期診斷及治療的標(biāo)志物十分重要。HCC的發(fā)生發(fā)展與多種癌基因過度表達(dá)以及腫瘤抑制基因失活密切相關(guān)[3]。研究表明miRNA在肝癌中起到重要的作用[4]，miR-542-3p是近來新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制功能的microRNA，在肺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等中呈低表達(dá)，具有抑制腫瘤生物惡性生物學(xué)行為的特點[5-8]。有研究表明miR-542-3p在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，而且當(dāng)下調(diào)miR-542-3p后肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)[9]。本實驗首先通過RT-PCR檢測miR-542-3p在肝癌細(xì)胞及組織中表達(dá)情況，再通過體外轉(zhuǎn)染miR-542-3p模擬物后，通過體外實驗驗證miR-542-3p對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性的影響，并探討其侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本收集及細(xì)胞培養(yǎng)

收集臺州市立醫(yī)院2014—2018 年收治的40 例肝癌患者病例資料，所有病例經(jīng)病理診斷證實為原發(fā)性肝癌，且術(shù)前均未做任何治療。人肝癌細(xì)胞系HCCLM3、Hep3B、Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L以及人正常肝細(xì)胞LO2均取自臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院中心實驗室。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視細(xì)胞生長情況，更換培養(yǎng)基。

1.2 miR-542-3p在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量檢測

實時熒光定量PCR：用Trizol試劑盒，根據(jù)操作說明提取組織標(biāo)本及各細(xì)胞系細(xì)胞的總RNA，測定總RNA濃度，根據(jù)TaKaRa公司說明書嚴(yán)格進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實時定量聚合酶鏈（RT-PCR）反應(yīng)，每組3個復(fù)孔，以U6作為內(nèi)參，在伯樂（Bio-Rad）實時定量PCR儀器進(jìn)行檢測，miR-542-3p的上游引物序列為5’-GGCGGTGTGACAGATTGATAA-3’，下游引物序列5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACTTTCAG-3’；U6的上游引物序列為5’-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3’，下游引物序列5’-CACTATTGCGGGCTGC-3’，RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。miR-542-3p的相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.3 轉(zhuǎn)染miR-542-3p類似物（mimics）及陰性對照（NC）

miR-542-3p mimics及miR-542-3p NC由廣州銳博生物科技有限公司合成提供。選取miR-542-3p表達(dá)最低的兩株肝癌細(xì)胞MHCC-97H和HCCLM3，按照LiopfectamineTM3000試劑說明書操作，分別將miR-542-3p mimics（miR-542-3p過表達(dá)組）及miR-542-3p NC（陰性對照組）轉(zhuǎn)染入MHCC-97H和HCCLM3中，均設(shè)置3個復(fù)孔。采用RT-PCR法驗證轉(zhuǎn)染48 h后轉(zhuǎn)染效率。

1.4 對肝癌細(xì)胞增殖的檢測

采用CCK-8法：將轉(zhuǎn)染48 h的MHCC-97H和HCCLM3 細(xì)胞常規(guī)消化，PBS洗細(xì)胞兩遍，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以3×103個每孔細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置3個復(fù)孔，每組分別設(shè)24 h、48 h及72 h檢測時間點；檢測前每孔分別加入CCK-8 試劑10 μL，避光37 ℃孵育2 h，輕輕振蕩，保證每孔無氣泡，放置于酶標(biāo)儀上，450 nm波長處測定光密度（OD）值，觀察miR-542-3p對肝癌細(xì)胞增殖的影響。

1.5 肝癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的檢測

Transwell小室侵襲及轉(zhuǎn)移實驗：將轉(zhuǎn)染48 h的MHCC-97H和HCCLM3細(xì)胞常規(guī)消化，PBS洗細(xì)胞兩遍，用無血清的培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按1×108/mL的細(xì)胞密度，分別加200 μL細(xì)胞懸液至無matrigel膠和已經(jīng)鋪好matrigel膠Transwell上室中，下室加入含12%血清的培養(yǎng)液700 μL，每個轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞均設(shè)置3 個復(fù)孔，常規(guī)37 ℃孵育24 h，取出上室，棉球拭去上室未侵襲的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min后，1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗干凈后進(jìn)行風(fēng)干。顯微鏡觀察細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移情況，隨機(jī)選取3個視野，拍照計數(shù)。

1.6 肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的檢測

Western blotting實驗：取轉(zhuǎn)染48 h的MHCC-97H和HCCLM3細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，取2 μL蛋白樣品用于BCA法測蛋白濃度，按50 μg上樣量計算得出上樣體積；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行實驗；敷孵育一抗β-Actin（1:5 000），E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail1（均為1:1 000）4 ℃搖床過夜；室溫敷育二抗2 h后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光，用ImageJ 1.42軟件進(jìn)行灰度分析。

免疫熒光實驗：取轉(zhuǎn)染48 h的MHCC-97H和HCCLM3細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞爬片，于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞固定，0.1% Triton X-100細(xì)胞透化處理，M-緩沖液洗滌細(xì)胞3 次，去除非特異蛋白，1% BSA（牛血清白蛋白，PBS新鮮配制）封閉液細(xì)胞封閉1 h，移去封閉液，在爬片上滴加大約20 μL稀釋好的一抗，4 ℃冰箱中過夜進(jìn)行一抗染色，對應(yīng)一抗的的種屬在相應(yīng)的爬片上滴加大約20 μL稀釋好的二抗，置于濕盒中，在37 ℃培養(yǎng)箱中溫育反應(yīng)2 h進(jìn)行二抗染色，滴加大約10 μL的DAPI于玻片上進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫孵育10 min，PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次5 min。最后將染色處理完畢的玻片蓋在封片劑上，置暗盒里待其風(fēng)干。取制備好的玻片于共聚焦激光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，所得結(jié)果用（±s）表示。兩組之間比較采用配對t檢驗；多組之間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-542-3p在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

miR-542-3p在肝癌組織（n=40）和癌旁組織（n=40）的表達(dá)量[（0.208±0.064）vs（0.746±0.093）]有統(tǒng)計學(xué)差異，肝癌組織表達(dá)明顯低于其癌旁組織（P＜0.05，圖1A）。miR-542-3p在人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HCCLM3、MHCC-97L、Huh7、Hep3B、MHCC-97H表達(dá)量分別為（0.688±0.049）、（0.221±0.034）、（0.473±0.041）、（0.561±0.029）、（0.764±0.059）、（0.162±0.031），均顯著低于其在人正常肝細(xì)胞LO2中的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。

圖1 miR-542-3p在肝癌組織中的表達(dá)水平（A）及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平（B）

2.2 轉(zhuǎn)染miR-542-3p mimics效果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-542-3p在轉(zhuǎn)染miR-542-3p mimics與陰性對照HCCLM3[（1.054±0.156）vs（0.510±0.059）]和MHCC-97H[（1.193±0.244）vs（0.323±0.081）]中的表達(dá)量具有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2），這提示過表達(dá)miR-542-3p在HCCLM3 和MHCC-97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染有效。

2.3 miR-542-3p對肝癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 法檢測結(jié)果表明，miR-542-3p過表達(dá)HCCLM3和MHCC-97H細(xì)胞的吸光度值低于陰性對照，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）；這提示上調(diào)miR-542-3p在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，且轉(zhuǎn)染時間越長，抑制效果越明顯。

2.4 miR-542-3p對肝癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響

圖2 miR-542-3p過表達(dá)后在HCCLM3和MHCC-97H細(xì)胞系中的表達(dá)水平

Transwell小室侵襲轉(zhuǎn)移實驗，結(jié)果顯示：miR-542-3p過表達(dá)組細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于陰性對照組（圖4）。這提示，miR-542-3p過表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

2.5 miR-542-3p對肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響

Western blotting實驗結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞系HCCLM3和MHCC-97H中，miR-542-3p過表達(dá)組Ecadherin蛋白的表達(dá)增加，Vimentin、N-cadherin和Snail1 蛋白的表達(dá)減少（圖5A、B）。此結(jié)果說明過表達(dá)miR-542-3p具有抑制肝癌細(xì)胞EMT的作用。為進(jìn)一步證實miR-542-3p對HCC細(xì)胞EMT的影響，我們應(yīng)用免疫熒光檢測過表達(dá)miR-542-3p后HCC細(xì)胞形態(tài)的變化以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果檢測顯示，過表達(dá)miR-542-3p后，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的紅色熒光強(qiáng)度增高，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin、N-cadherin和Snail1的紅色熒光強(qiáng)度降低（圖5C），這表明過表達(dá)miR-542-3p后抑制HCC細(xì)胞EMT。

3 討論

圖3 miR-542-3p過表達(dá)組及陰性對照組在HCCLM3和MHCC-97H細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖情況

圖4 過表達(dá)miR-542-3p對HCCLM3和MHCC-97H細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

圖5 過表達(dá)miRNA-542-3p對EMT相關(guān)蛋白的影響

近年來肝癌發(fā)病率和病死率呈總體上升趨勢，在我國每年約有38萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[10]。由于肝癌臨床癥狀隱匿，且其具有生長速度快、惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點，預(yù)后較差[11]，因此臨床上亟需探索新的肝癌生物標(biāo)志物和新的治療策略。miRNAs已被證實在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。臨床研究表明，miRNA在肝癌中表達(dá)譜變化較大，可用異常表達(dá)的miRNA來輔助診斷肝癌[12]；此外Sato等[13]發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA譜可用于預(yù)測肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)情況。

miRNA-542-3p為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，已經(jīng)被證實在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌[5-8]。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-542-3p在肝癌中呈低表達(dá)，起到抑癌基因的作用。同樣，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)在肝癌組織及細(xì)胞系中miR-542-3p明顯下調(diào)。

多項研究顯示，miR-542-3p可以通過作用于靶基因如生存素[14]、PIM1[15]、p53[16]以及AKT信號通路[17]等共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期等多種生理活動從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-542-3p能下調(diào)存活素，抑制HCC細(xì)胞增殖及裸鼠體內(nèi)HCC瘤體生長。在本研究中，我們通過CCK-8實驗證實miR-542-3p具有抑制肝癌細(xì)胞增殖能力，提示miR-542-3p參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

局部和全身轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌預(yù)后不理想的關(guān)鍵因素。越來越多的研究證實，miRNA是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，包括肝癌[19]。Takeyama等[20]通過miRNA基因芯片及qRT-PCR分析研究發(fā)現(xiàn)，與不伴有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌相比，伴有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中miR-542-3p的表達(dá)水平明顯較低，說明miR-542-3p對結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移有抑制作用。在本研究中，Transwell實驗表明miR-542-3p具有抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[21]。在腫瘤EMT過程中，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、緊密連接蛋白ZO-1（zonula occluden-l）等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）、N型鈣黏蛋白（N-cadherin）等表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)為上皮源性的腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞極性，細(xì)胞間的連接變得疏松，胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組。這一系列的改變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的黏附能力下降，遷移運(yùn)動能力增加，使得腫瘤細(xì)胞更易于離開原有位置，發(fā)生原位浸潤或者隨血行、淋巴等途徑轉(zhuǎn)移到體內(nèi)遠(yuǎn)隔部位，重新定位于新的器官或組織，最終導(dǎo)致腫瘤患者死亡。EMT是肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程[22]，本研究中Western boltting和免疫熒光實驗結(jié)果均提示，當(dāng)miR-542-3p過表達(dá)時，上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)增加，而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin、Snail1蛋白表達(dá)減少，證明了miR-542-3p具有抑制肝癌細(xì)胞EMT的作用，結(jié)果提示miR-542-3p通過抑制EMT表型抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-542-3p可以抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用，且與EMT通路有關(guān)。但其作用的下游靶基因尚不完全清楚，本課題組接下來將通過重點研究miR-542-3p可能的靶基因，進(jìn)一步闡明miR-542-3p在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制及其重要性。