李晨，宋洪亮，俞海波，單云峰

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院 肝膽胰外科，2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325000）

胰腺癌是具有較高病死率的消化道惡性腫瘤之一，并在未來(lái)的20～30年有可能成為惡性腫瘤患者中第二大死因[1-2]。在美國(guó)，目前胰腺癌的5年生存率約為10%，而在不發(fā)達(dá)國(guó)家其5年生存率低于5%。80%～85%的患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，腫瘤難以切除[3]，部分可以切除的患者中其5年生存率不到20%[4]。雖然近幾年生物技術(shù)不斷發(fā)展，圍手術(shù)期管理不斷進(jìn)步，放化療研究不斷深入，但是胰腺癌仍缺少特異性強(qiáng)、敏感性高的診斷標(biāo)志物以及有效的治療手段。層粘連蛋白3（LAMA3）的編碼基因位于18號(hào)染色體上，有76 個(gè)外顯子，包括短鏈LAMA3 A轉(zhuǎn)錄本和長(zhǎng)鏈LAMA3 B轉(zhuǎn)錄本，其轉(zhuǎn)錄本由39 至76 位外顯子轉(zhuǎn)錄剪接而成。LAMA3目前已被證實(shí)廣泛參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[5-7]。大量的文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道LAMA3在胃癌[8]、卵巢癌[9]、肝癌[10]、膀胱癌[11]等腫瘤中表達(dá)異常，其在腫瘤中表達(dá)異?？赡芘c其參與DNA甲基化以及組蛋白的去乙酰化相關(guān)。LAMA3在胰腺癌的研究鮮有報(bào)道，本課題擬分析LAMA3在胰腺癌患者中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理特征及腫瘤預(yù)后的相關(guān)性，以期判斷其是否可以作為胰腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析2011年5月至2018年12月溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院收住的胰腺癌患者40例，術(shù)后病理均確診為胰腺導(dǎo)管腺癌，均行手術(shù)治療，其中胰十二指腸切除術(shù)28例，胰腺體尾部12例，術(shù)前未進(jìn)行輔助化療。其中男17例，女23例，年齡56～74歲，平均65.2 歲，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19 例。根據(jù)最新的AJCC胰腺癌TMN分期，I～I(xiàn)I期15例，III～I(xiàn)V期25例。本研究方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院/溫州市中心醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

重組人抗LAMA3抗體[EPR8266]（ab151715），購(gòu)自美國(guó)Abcam。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化評(píng)估LAMA3的表達(dá)情況：將胰腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本固定在10%中性福爾馬林緩沖液中，并用石蠟包埋。切割，脫蠟并重新水化后，對(duì)5 μm切片進(jìn)行抗原修復(fù)。組織切片與抗LAMA3的一抗（1:100稀釋）在4 ℃孵育過(guò)夜。使用Image-Pro plus（IPP）6.0軟件，通過(guò)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比評(píng)估LAMA3的表達(dá)。根據(jù)IPP評(píng)分將染色強(qiáng)度分為四個(gè)等級(jí)：0（癌細(xì)胞無(wú)染色），1（弱染色），2（中度染色），3（強(qiáng)度染色）。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分如下：0（0），1（1%～25%），2（26%～50%），3（＞50%）。染色總分=陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分×強(qiáng)度得分。總分0～2定義為低表達(dá)，3～9分為高表達(dá)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)LAMA3 的mRNA水平：采用Trizol試劑，將總RNA（0.5 μg）反轉(zhuǎn)為cDNA，用SYBR Green PCR測(cè)定LAMA3的mRNA水平，所有檢測(cè)均重復(fù)三次。LAMA3 的相對(duì)表達(dá)分別相對(duì)于內(nèi)參GAPDH進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。使用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。GAPDH正向引物：5’-ATGGGGAAGGT GAAGGTCG-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGG CAACAATA-3’；LAMA3正向引物：5’-GTTTCACTG ATTTGGGCTTACC-3’，反向引物：5’-AGTCCAGAG TTGTCGCTTATTACA-3’。

1.3.3 Western blotting檢測(cè)LAMA3蛋白水平：將胰腺癌組織和癌旁組織在含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解緩沖液中于冰中裂解1 h，使用BCA蛋白測(cè)定對(duì)樣品蛋白進(jìn)行定量。通過(guò)SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用抗體進(jìn)行檢測(cè)。一抗LAMA3和GAPDH的濃度為1:1 000，相應(yīng)的二抗的濃度為1:2 000。

1.3.4 LAMA3 生物信息學(xué)分析：癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）及Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org/resource/login.html）被用于驗(yàn)證LAMA3在胰腺癌組織中的表達(dá)情況。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)總共包括87 個(gè)胰腺癌組織樣本及80個(gè)正常組織樣品。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 19.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier方法，并進(jìn)行對(duì)數(shù)秩（Log-rank）檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織及癌旁組織中LAMA3的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色顯示，在40對(duì)胰腺癌和癌旁組織中，24例癌組織LAMA3高表達(dá)（24/40，60%），而在癌旁組織中僅有10例LAMA3呈高表達(dá)（10/40，25%），兩組高表達(dá)率對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)圖1。同時(shí)我們從40 例胰腺癌患者中隨機(jī)選擇了15組配對(duì)的胰腺癌組織和癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，并隨機(jī)從其中選擇6組配對(duì)的胰腺癌組織和癌旁正常組織中進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示了癌組織中LAMA3 表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖2A和2B）。

圖1 胰腺癌組織及癌旁組織LAMA3陽(yáng)性表達(dá)情況，陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為棕色顆粒（免疫組化，×100）。

圖2 胰腺癌組織及癌旁組織LAMA3 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果

2.2 胰腺癌組織中LAMA3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

分析表明胰腺癌組織中LAMA3的表達(dá)與患者的腫瘤大小、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），腫瘤大于2 cm以及TNM分期III～I(xiàn)V期的患者其表達(dá)水平更高。LAMA3 的表達(dá)與患者的性別、年齡、CA199 水平、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 LAMA3高表達(dá)組和低表達(dá)組胰腺癌患者的生存曲線

LAMA3 高表達(dá)組和低表達(dá)組胰腺癌患者的生存曲線如圖3 所示。LAMA3 高表達(dá)的患者預(yù)后較LAMA3低表達(dá)更差（P＜0.001）。

2.4 LAMA3在GEO及Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)情況

對(duì)GEO及Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，LAMA3在GSE16515（P＜0.0001）、GSE15471（P＜0.0001）、GSE3654（P＜0.0001）中的表達(dá)明顯升高，其結(jié)果見(jiàn)圖4。

表1 LAMA3表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

圖3 LAMA3高表達(dá)組和低表達(dá)組胰腺癌患者的生存曲線

圖4 GEO及Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析提示胰腺癌患者LAMA3表達(dá)明顯升高（P＜0.0001）。

3 討論

層粘連蛋白是由α、β和γ亞基組成的異三聚體分子，它們通過(guò)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組裝。層粘連蛋白對(duì)于基底膜的形成和功能至關(guān)重要，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有比較重要的功能[12]。而LAMA3基因則主要編碼層粘連蛋白α亞單位，其變異會(huì)影響層粘連蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響層粘連蛋白的生物活性。LAMA3蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。研究表明，在卵巢癌中LAMA3的表達(dá)水平低于正常組織和癌旁組織，LAMA3高表達(dá)組無(wú)復(fù)發(fā)生存率和總生存率明顯高于LAMA3低表達(dá)組[9]。一項(xiàng)關(guān)于cDNA芯片研究與HCV感染相關(guān)的肝癌患者中，LAMA3表達(dá)顯著上調(diào)[10]。LAMA3在腫瘤中的作用機(jī)制可能與DNA甲基化以及被miRNA調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中LAMA3甲基化水平顯著升高，提示LAMA通過(guò)DNA的甲基化參與了癌細(xì)胞的發(fā)展[13]。另有研究表明miRNA-17/20a通過(guò)靶向LAMA3參與口腔癌的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。

課題組前期通過(guò)文獻(xiàn)檢索及生物信息學(xué)篩選，發(fā)現(xiàn)LAMA3在胰腺癌中存在差異表達(dá)，可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。為了進(jìn)一步明確LAMA3在胰腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，我們對(duì)40例胰腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)，同時(shí)對(duì)部分組織進(jìn)行了Western blotting檢測(cè)以及qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LAMA3蛋白和mRNA在胰腺癌組織中呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，三者結(jié)果相符，以上結(jié)果證實(shí)了LAMA3在胰腺癌的發(fā)展發(fā)展中可能扮演著癌基因的角色。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果證實(shí)了LAMA3表達(dá)水平與患者的腫瘤大小、TNM分期明顯相關(guān)，而與患者的性別、年齡、CA199水平、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)，腫瘤大于2 cm以及TNM分期III～I(xiàn)V期的患者其表達(dá)水平更高。本研究結(jié)果提示LAMA3 可能成為判斷胰腺癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。為進(jìn)一步了解LAMA3表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性，我們進(jìn)行了生存曲線分析，該結(jié)果驗(yàn)證了我們的假設(shè)，LAMA3低表達(dá)的胰腺癌患者具有更長(zhǎng)的生存時(shí)間。

本研究結(jié)果提示LAMA3 可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但是由于我們的研究樣本量小，為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)果，我們進(jìn)行了在線生物信息分析，從臨床樣本庫(kù)的生信分析中，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與我們的研究相符，臨床樣本庫(kù)的結(jié)果同樣提示在胰腺癌患者中LAMA3的表達(dá)水平明顯升高。

綜上所述，在胰腺癌中LAMA3高表達(dá)，提示預(yù)后不良，其可能成為判斷胰腺癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，并且可能成為胰腺癌患者靶向治療的潛在靶點(diǎn)，但其在胰腺癌中發(fā)揮作用的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。