閔凱麗，晁祥保，滕 露，蔡永生，雷慧辰，嚴(yán)中建，鄭 凱,2，陳全家

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后流動(dòng)站，烏魯木齊 830052 )

0 引 言

【研究意義】中國(guó)棉花總產(chǎn)量占全世界的1/4，消費(fèi)量占全世界的1/3，中國(guó)棉花市場(chǎng)供求關(guān)系變化直接影響國(guó)際棉花市場(chǎng)[1]。棉紡企業(yè)強(qiáng)調(diào)以較強(qiáng)、較細(xì)和纖維更整齊的棉纖維作為紡織原料[2]。新疆具有適合棉花生長(zhǎng)的自然條件和資源優(yōu)勢(shì)，2016年棉花總產(chǎn)占全國(guó)總產(chǎn)的68%[3]。根據(jù)2008～2016年我國(guó)新體制棉花公正檢驗(yàn)質(zhì)量數(shù)據(jù)，比較分析全國(guó)5大植棉省(區(qū))的棉纖維品質(zhì)表明，纖維長(zhǎng)度以新疆地方的最長(zhǎng)，馬克隆值最優(yōu)，斷裂比強(qiáng)度則以新疆最低，僅為28 cN/tex，但近幾年呈明顯升高的趨勢(shì)[4]。在棉花種植中，陸地棉產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣使其占據(jù)主要地位，但棉纖維品質(zhì)較差；海島棉種植面積約占棉花種植總面積的5%～8%，生產(chǎn)規(guī)模較小，但棉纖維具有長(zhǎng)、細(xì)、強(qiáng)等突出的特點(diǎn)。棉纖維的發(fā)育過程是一系列物質(zhì)共同參與的復(fù)雜過程。【前人研究進(jìn)展】成熟的棉花纖維的細(xì)胞壁主要由90%或95%以上纖維素構(gòu)成，其余為纖維素伴生物和部分未知物。木質(zhì)素是芳香族雜多聚合物，是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物，生物合成途徑已經(jīng)較為清楚[5-7]，是纖維素后第2類最豐富的植物生物聚合物，主要沉積在維管植物的次生細(xì)胞壁中，是水分運(yùn)輸、機(jī)械支持和植物病原防御所必須的[8]。木質(zhì)素單體的生物合成途徑涉及到許多酶的參與，C3H/HCT是發(fā)現(xiàn)較晚的2個(gè)酶，在從對(duì)-香豆酰輔酶A(p-coumaroylCoA)到咖啡酰輔酶A(caffeoylCoA)的羥基化過程中起作用，是控制木質(zhì)素H-單體與G/S-單體相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[9]。HCT是一種在木質(zhì)素單體合成途徑中發(fā)現(xiàn)的酶，最早是從煙草中分離得到的[10]，屬于脂肪酰轉(zhuǎn)移酶的大家族，脂肪酰轉(zhuǎn)移酶主要涉及多種次生代謝生物合成過程。HCT不僅可以催化咖啡酰輔酶A與奎尼酸合成綠原酸，還可以逆向催化綠原酸生成咖啡酰輔酶A與奎尼酸，促使更多底物用于木質(zhì)素的合成[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】HCT能將對(duì)香豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的莽草酸/奎尼酸酯，而羥基化的底物來自C3H。莽草酸/奎尼酸酯可通過HCT的逆反應(yīng)過程轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的輔酶A酯。通過分析擬南芥中C3H基因更加證實(shí)了HCT在木質(zhì)素合成途徑中的作用[12]。木質(zhì)素也是影響纖維素水解的一個(gè)重要因素，其存在嚴(yán)重阻礙了纖維生物質(zhì)能源的利用。改變木質(zhì)素含量和組分是當(dāng)前木質(zhì)素研究的主要熱點(diǎn)。HCT基因在調(diào)控木質(zhì)素生物合成中有著重要作用且木質(zhì)素對(duì)棉花不同組織部位都有影響，木質(zhì)素的生物合成及在成熟纖維中的含量與棉花纖維的品質(zhì)有一定的關(guān)系[13]，研究HCT基因在棉纖維發(fā)育中的功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從海島棉新海21號(hào)中克隆GbHCT10基因，通過生物信息學(xué)方法分析GbHCT10的cDNA序列和氨基酸序列并實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析海島棉GbHCT10基因在棉花纖維發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)量差異，分析該基因的氨基酸序列和表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料海島棉新海21號(hào)種植于新疆沙灣縣144團(tuán)棉花遺傳育種基地。以開花當(dāng)天記作0 d(開花后0 d)，分別摘0 d的胚珠和5、10、15、20、25、30、35 d的共8個(gè)時(shí)期棉花纖維，置于液氮中速凍，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 植物總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

采用植物多糖多酚RNA提取試劑盒(Quick RNA isolation Kit，北京天根生化科技有限公司)，按照說明書操作，提取不同時(shí)期棉纖維的總RNA，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，將質(zhì)量完好的RNA用于后續(xù)試驗(yàn)。使用Thermo Nano Drop2000C核酸蛋白分析儀(北京賽默飛世爾科技有限公司)檢測(cè)所提RNA的濃度和質(zhì)量，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨hermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)賽默飛)推薦反應(yīng)體系合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和程序參照說明書。

1.2.2 海島棉GbHCT10基因克隆

根據(jù)海島棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)克隆引物，上游引物：GbHCT10-F:5'ATGGAGATTACTATAAAGGAGTCTG-3'和下游引物：GbHCT10-R:5'-TCACAAGCTCCCATCGTTGA-3'。

選用海島棉新海21號(hào)開花后5 d的棉纖維cDNA為模板，用高保真Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，57℃復(fù)性 45 s，72℃延伸 1 min 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，使用紫外凝膠成像儀觀察并切下目的片段。按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根試劑公司)說明書步驟純化回收PCR產(chǎn)物，連接至T5載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(全式金公司)。通過菌液PCR篩選鑒定出陽(yáng)性克隆，送至深圳華大基因有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序?qū)u棉GbHCT10基因的cDNA序列進(jìn)行進(jìn)行相似性搜索，下載不同物種的HCT基因序列，再經(jīng)DNAMAN軟件分析序列的核苷酸組成以及進(jìn)行多重序列比較和相似度比對(duì)，采用ClustalX2.0比對(duì)序列，再利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/or
Fig.cgi)工具分析海島棉GbHCT10基因序列的開放閱讀框。使用Coden Usage Database網(wǎng)站提供的Countcodonprogram(http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html)分析海島棉GbHCT10基因完整ORF序列的密碼子使用頻率。利用blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序?qū)u棉GbHCT10基因的編碼蛋白進(jìn)行相似性搜索。使用ProtParam(physico-chemical parameters of a protein sequences，http://web.expasy.org/protparam/)在線程序計(jì)算海島棉GbHCT10基因編碼蛋白的理化參數(shù)。使用BioEdit軟件的Kyte&Doolittle方法計(jì)算蛋白質(zhì)序列的疏水性分布。使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)在線程序?qū)υ摰鞍踪|(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用在線程序COILS(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)預(yù)測(cè)該蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。該蛋白質(zhì)的可能跨膜區(qū)，用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)在線程序分析。通過https://web.expasy.org/protparam/在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。通過在線預(yù)測(cè)軟件SoftBerry ProtComp9.0(http://www.SoftBerry.com)對(duì)GbHCT10蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過http://swissmodel.expasy.org/在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過Plant care(http://oberon.fvms.ugent.be:8080/PlantCARE/index.html )網(wǎng)站對(duì)GbHCT啟動(dòng)子上游2 000 bp進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)已獲得的目的基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以UBQ7為內(nèi)參基因，將海島棉新海21號(hào)不同時(shí)期棉纖維的cDNA用ddH2O稀釋10倍后作為模板，采用7 500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)GbHCT10基因在不同時(shí)期棉纖維發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)情況，用內(nèi)參基因檢測(cè)擴(kuò)增效率一致性。QPCR擴(kuò)增體系參照說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

通過DNAMAN軟件對(duì)新海21號(hào)GbHCT10與樹棉(Gossypiumarboreum)，棕色棉(GossypiumhirsutumLinn.)，煙草(Nicotianatabacum)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)，毛白楊(Populustomentosa)，輻射松(Pinusradiata)，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，蝶豆(ClitoriaternateaL)，一串紅(Salviasplendens)，金銀花(LonicerajaponicaThunb.)，水稻(OryzasativaL)，紫薯(ipomoeabatatas)，可可(Theobromacacao)，小果咖啡(Coffeaarabica)，槿麻(Hibiscuscannabinus)，蓖麻(Ricinuscommunis)，丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)，葡萄(VitisviniferaL.)，番茄(Solanumlycopersicum)的HCT氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GbHCT10基因克隆與生物信息學(xué)

研究表明，GbHCT10基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 248 bp，包含一個(gè)完整的ORF，編碼415個(gè)氨基酸，其中GUA密碼子的使用頻率最高。利用protparam在線預(yù)測(cè)得出，分子式為C2086H3246N552O603S10，蛋白質(zhì)分子量為45.13 kD，等電點(diǎn)為6.01，脂肪系數(shù)為94.43，總平均親水性為-0.144。該蛋白大約在200～220位氨基酸之間含有1個(gè)典型的親水性區(qū)域，屬于親水性蛋白?？缒^(qū)分析顯示該蛋白的1～400個(gè)氨基酸位于細(xì)胞外，不含有跨膜區(qū)，屬于非膜受體蛋白。SoftBerry ProtComp9.0在線預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，GbHCT蛋白可能定位于線粒體(9.15)，卷曲螺旋預(yù)測(cè)顯示，該蛋白含有2個(gè)典型的超螺旋結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，GbHCT10基因編碼的415個(gè)氨基酸中，α-螺旋占3.4%，β-折疊占6.4%，無規(guī)則卷曲占90.2%。GbHCT10蛋白主要由螺旋卷曲構(gòu)成，與之前預(yù)測(cè)結(jié)果一致。啟動(dòng)子序列中含有多種必備啟動(dòng)子元件，如含有脫落酸響應(yīng)元件ABRE、機(jī)械損傷響應(yīng)元件WUN-motif、乙烯響應(yīng)元件ERE、防御與應(yīng)激響應(yīng)元件TC-rich repeats等與逆境脅迫響應(yīng)的順勢(shì)作用元件，GbHCT基因可能在多種逆境脅迫中發(fā)揮作用。還包含多個(gè)與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他信號(hào)運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)的順勢(shì)作用元件，如TGACG-motif等。圖1～6，表1

表1 GbHCT啟動(dòng)子中的順式作用元件預(yù)測(cè)Table 1 Cis-regulatory element prediction in GbHCT promoter

2.2 同源序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹

研究表明，新海21號(hào)GbHCT10與樹棉同源性達(dá)94.5%，其他依次為棕色棉(59.9%)，葡萄(59.1%)，槿麻(58.7%)，毛白楊(58.4%)，小果咖啡(58.2%)，可可(58.2%)，蓖麻(57.7%)，擬南芥(57.4%)，金銀花(57.2%)，蒺藜苜蓿(57.1%)，輻射松(57.0%)，煙草(56.9%)，丹參(56.7%)，蝶豆(56.6%)，番茄(55.5%),水稻(41.1%)，一串紅(25.4%)。通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，新海21號(hào)GbHCT10基因與樹棉HCT基因在同一分支且親緣關(guān)系性最為相近。圖7，圖8

2.3 海島棉GbHCT10基因表達(dá)

研究表明，GbHCT10基因在棉花不同纖維發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá)，該基因在開花后第5 d和第10 d表達(dá)量高，第25 d表達(dá)量最低，呈現(xiàn)出先上升再下降再上升再下降的波動(dòng)趨勢(shì)。圖9

3 討 論

棉花纖維是由胚珠表皮細(xì)胞在受精前后經(jīng)分化突起、伸長(zhǎng)、次生壁增厚和脫水成熟而形成的，各時(shí)期具有不同特點(diǎn)但又相互重疊[14]。伸長(zhǎng)期是生化反應(yīng)最活躍的時(shí)期，也是影響纖維品質(zhì)的關(guān)鍵時(shí)期[15]。已有研究表明，成熟棉花纖維細(xì)胞壁中含有苯丙烷代謝途徑的產(chǎn)物木質(zhì)素[16]。暗示木質(zhì)素的生物合成及在成熟纖維中的含量與棉花纖維的品質(zhì)可能有關(guān)系。木質(zhì)素的合成過程會(huì)受到不同基因的調(diào)控,是一個(gè)復(fù)雜的過程。當(dāng)合成過程中某個(gè)酶的表達(dá)活性降低時(shí),其他酶的表達(dá)活性也會(huì)受到影響[17-18]。HCT作為調(diào)控木質(zhì)素G/S-單體生物合成及H-單體和G/S-單體生物轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，對(duì)木質(zhì)素的單體組成及含量具有重要作用。HCT在高等植物上由一個(gè)小的基因家族組成[19-20]，到目前為止，已從檸條錦雞兒[21]，楊樹[22]，紅腺忍冬[23]，金銀花[24]，鴨梨[25]，野生鴨兒芹[26]等植物中克隆得到HCT基因，但是研究HCT基因在棉纖維發(fā)育中的功能報(bào)道還比較少有。從海島棉中克隆了木質(zhì)素合成途徑中的HCT基因全長(zhǎng)cDNA，該序列全長(zhǎng)1 248 bp，編碼415氨基酸。并通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)方法分析研究了GbHCT10的cDNA序列和氨基酸序列，對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了海島棉GbHCT10基因在棉花纖維發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)量差異。發(fā)現(xiàn)GbHCT10基因在分化突起期(0～3 d)表達(dá)量逐漸上升，纖維迅速伸長(zhǎng)期(5～15 d)基因表達(dá)量最高，15～25 d纖維生長(zhǎng)減緩時(shí)期，該基因表達(dá)量隨之降低，纖維加厚期(25～50 d)的早期表達(dá)量高，后期逐漸降低，總體表達(dá)呈現(xiàn)波動(dòng)變化，研究HCT基因在棉纖維發(fā)育中的作用，進(jìn)一步研究該基因的表達(dá)對(duì)纖維發(fā)育過程中木質(zhì)素含量的影響，對(duì)改善棉花纖維品質(zhì)有著重要研究意義。

4 結(jié) 論

克隆了1個(gè)海島棉HCT基因，命名為GbHCT10，該基因具有長(zhǎng)度為1 248 bp的開放閱讀框，編碼了415個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為45.13 kD，等電點(diǎn)為6.01，并對(duì)GbHCT10蛋白的跨膜區(qū)，親水性，亞細(xì)胞定位，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等序列特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)。同源序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹表明GbHCT10基因序列與樹棉HCT基因序列相似度最高，通過對(duì)海島棉GbHCT10啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件分析，發(fā)現(xiàn)了ABRE、WUN-motif、MYB、TC-rich repeats等在不同逆境中參與防御和脅迫反應(yīng)的順勢(shì)作用元件，GbHCT10基因可能參與到不同種非生物脅迫響應(yīng)過程中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)海島棉GbHCT10基因在棉花不同纖維發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá)，主要在纖維伸長(zhǎng)期和次生壁加厚時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，該基因可能參與棉花纖維發(fā)育進(jìn)程。