張 翼，邵冬南，薛 飛，李虎情，王學(xué)峰，李艷軍，張新宇，劉 峰，孫 杰

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】作物矮化不僅能提高抗倒伏能力，也有利于提高栽培密度和增加產(chǎn)量和機(jī)械化作業(yè)[1]。陸地棉(Gossypiumhirsutum)是錦葵科(Malvaceae)棉屬(Gossypium)雙子葉植物，其頂尖具有無(wú)限生長(zhǎng)能力。生產(chǎn)上主要采用人工打頂和和施用縮節(jié)胺、氟節(jié)胺等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[2]調(diào)控其生長(zhǎng)?？寺≈旮呦嚓P(guān)基因，研究棉花株高發(fā)育分子機(jī)制，對(duì)培育適應(yīng)機(jī)械化采收棉花品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)是一類(lèi)具有高生理活性的甾體激素，被稱(chēng)為繼生長(zhǎng)素(Auxin，IAA)、細(xì)胞分裂素(Cytokinins，CTK)、赤霉素(Gibberellins，GA)、脫落酸(Abscisic Acid，ABA)、乙烯(Ethylene，ET)之后的第6大激素，主要參與植物細(xì)胞分裂分化[3]、莖的伸長(zhǎng)[4]、根的發(fā)育[5]、葉片彎曲[6, 7]、花粉管延伸[8]和種子萌發(fā)[6]等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BL)作為生物活性最強(qiáng)的一種BRs，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[9, 10, 11]。細(xì)胞色素P450超家族中的CYP85亞家族在BL生物合成起到關(guān)鍵的催化作用。研究發(fā)現(xiàn)，番茄CYP85A3、擬南芥CYP85A1能將6-脫氧茶甾酮(6-deoxoCS)氧化為茶甾酮(castasterone，CS)，擬南芥CYP85A2進(jìn)一步將CS轉(zhuǎn)化BL，這是植物細(xì)胞中BL合成的最后一步，也是關(guān)鍵的限速步驟[8, 12-14]。植物中CYP85A的突變體大多都表現(xiàn)為植株矮化，如番茄CYP85A1缺陷突變體因缺乏 BL導(dǎo)致植株嚴(yán)重的矮化[7, 9]，豌豆BR缺失型突變體表現(xiàn)出株高介于野生型和BR突變體之間的表型[15]，黃瓜CYP85A1基因突變體表現(xiàn)出節(jié)間縮短的超緊湊表型[16, 17]，竹子CYP85A1基因也被證實(shí)具有促進(jìn)莖稈及節(jié)間伸長(zhǎng)的作用[18]。【本研究切入點(diǎn)】擬南芥CYP85A2介導(dǎo)CS向BL的轉(zhuǎn)化，這是BL生物合成的最后一步，也是重要的限速步驟[14]，但棉花CYP85A基因?qū)γ藁ㄖ旮叩挠绊懮胁磺宄?，研究以擬南芥CYP85A2基因(AT3G30180.1)的氨基酸序列為查詢(xún)序列與陸地棉基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，獲得了該基因在陸地棉的直系同源基因Ghir_A07G008770，命名為GhCYP85A2-1。構(gòu)建該基因VIGS沉默載體，對(duì)棉花幼苗進(jìn)行侵染，分析其對(duì)棉花株高的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究解析GhCYP85A2-1基因在棉花株高發(fā)育中的作用，為棉花矮化分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種新陸早61號(hào)由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花遺傳育種課題組提供。新陸早61號(hào)棉花種子種植于人工培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件設(shè)置：溫度23℃，相對(duì)濕度50%，光周期為14 h光照和10 h黑暗。待子葉完全平展(發(fā)芽后10 d左右)，挑選長(zhǎng)勢(shì)均一的幼苗用于后續(xù)VIGS侵染實(shí)驗(yàn)。病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)體系構(gòu)建方法中用到的煙草脆裂病毒pTRV1、pTRV2、pTRV2-GhCHLI重組載體以及根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101 均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 陸地棉GhCYP85A2亞家族基因生物信息學(xué)

以擬南芥CYP85A2基因(AT3G30180.1)的氨基酸序列為查詢(xún)序列，在陸地棉全基因組數(shù)據(jù)(https://www.cottongen.org/)(Gossypiumhirsutum(AD1) TM-1 Genome HAU v1_a1 / v1.1 a1.1)中進(jìn)行檢索，獲得其在陸地棉直系同源基因。用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定該基因結(jié)構(gòu)域。利用ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)和softberry(http://www.softberry.com/berry.phtml/)對(duì)該基因的蛋白質(zhì)殘基數(shù)(aa)、相對(duì)分子質(zhì)量(kD)、理論等電點(diǎn)(pI)等基本理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用NCBI Conserved Domain Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)工具對(duì)氨基酸序列進(jìn)行保守域分析。以棉花GhCYP85A2-1基因(Ghir_A07G008770)的氨基酸序列作為查詢(xún)(Query)序列，在UniProt (https://www. uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BlastP 搜索其它物種CYP85A亞家族基因及氨基酸序列。利用 MEGA7.0 軟件中的 ClustalW 程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining，NJ，BootStrap = 1 000)構(gòu)建基因家族進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2GhCYP85A2-1基因VIGS載體的構(gòu)建

取棉花幼嫩葉片，用EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取棉花葉片總 RNA。按照 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)合成 cDNA 鏈，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以GhCYP85A2-1基因cDNA為模板，用Primer 3(http://primer3plus.com/)在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物5’端中分別加入EcoRⅠ(GAATTC)和KpnⅠ(GGTACC)酶切位點(diǎn)。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增目的基因片段(312 bp)，PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1.0 μL、10 × Buffer2.0 μL、dNTPs (2.5 mmol/L)1.6 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、Ex-TaqDNA 聚合酶(TaKaRa，5 U/μL)0.2 μL、ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。目的片段利用瓊脂糖膠回收試劑盒(Tiangen)回收純化，具體步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

將回收的PCR產(chǎn)物連接至pGEM- T?Easy載體(Promega)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞獲得pGEM-GhCYP85A2-1，質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證并送公司測(cè)序(北京華大)。用EcoRI和KpnI分別對(duì)pTRV2空載體和pGEM-GhCYP85A2-1進(jìn)行雙酶切，將目標(biāo)片段與pTRV2載體進(jìn)行連接，獲得pTRV2-GhCYP85A2-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的pTRV2-GhCYP85A2-1重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后-80℃保菌備用。

1.2.3 沉默載體的侵染與轉(zhuǎn)化

新鮮培養(yǎng)的重組載體pTRV2-GhCHLI(體系對(duì)照)、pTRV2-GhCYP85A2-1和pTRV2-00(空白對(duì)照)菌液分別與pTRV1按1∶1等體積混勻，離心并收集菌體，以適當(dāng)體積的重懸液(10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，200 mmol/L 乙酰丁香酮)調(diào)節(jié)終濃度(OD600約0.8)。重懸后的侵染菌液于室溫放置3～4 h，用無(wú)菌注射器將侵染菌液注射到新陸早61號(hào)棉花幼苗子葉，未注射的植株為野生型對(duì)照(WT)，每個(gè)處理15株。WT和接種后植株置于培養(yǎng)箱中，2周后pTRV2-GhCHLI處理組可觀(guān)察到真葉被漂白；40 d后觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)pTRV2-GhCYP85A2-1、pTRV2-00(空白對(duì)照)和WT表型，分別采集其幼嫩葉片儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?，重?fù)3次。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，應(yīng)用最小顯著性差數(shù)法(LSD)進(jìn)行單因素方差分析；Duncan多重比對(duì)分析，顯著性水平為P<0.05。

1.2.4GhCYP85A2-1基因沉默效率檢測(cè)

分別提取侵染40 d后的pTRV2-GhCYP85A2-1、pTRV2-00(空白對(duì)照)和WT幼嫩葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以UBQ7作為內(nèi)參基因，Primer 3.0 在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物，qRT-PCR分析相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系(共10 μL)：cDNA模1 μL、SYBR Green Ⅰ染料(Roche)5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL、ddH2O 3.5 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性1 min，94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸1 min，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)3次重復(fù)，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。表1

表1 所用引物Table 1 Primers used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉CYP85A2亞家族基因生物信息學(xué)

研究表明，以擬南芥CYP85A2基因(AT3G30180.1)蛋白序列為查詢(xún)序列在棉花全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cottongen.org/)中進(jìn)行Blastp比對(duì)，共得到6個(gè)陸地棉GhCYP85A2基因。棉花CYP85A2亞家族基因全長(zhǎng)在1 708～2 408 bp，編碼序列(coding sequence，CDS)長(zhǎng)1 116～1 401 bp，編碼371～466個(gè)氨基酸，家族成員蛋白質(zhì)分子量在42.743～53.645 kD，理論等電點(diǎn)(pI)介于8.95～9.31。GhCYP85A2亞家族成員亞細(xì)胞定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum)和質(zhì)膜(Plasma membrane)上。

6個(gè)陸地棉基因與擬南芥CYP85A2氨基酸序列相似性在69.57%～54.89%，按相似性高低分別命名為GhCYP85A2-1至GhCYP85A2-6。利用 NCBI Conserved Domain Search 對(duì)陸地棉GhCYP85A2氨基酸序列進(jìn)行保守域分析，6個(gè)基因均屬于細(xì)胞色素P450超級(jí)家族成員，其中GhCYP85A2-1具有典型的油菜素甾體6-氧化酶保守結(jié)構(gòu)域PLN02774，該基因與油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)。表2

表2 陸地棉CYP85A亞家族成員序列Table 2 Sequence analysis of CYP85A subfamily members in Gossypium hirsutum L.

2.2 陸地棉與其他物種CYP85A氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)

研究表明，利用DNAMAN軟件對(duì)擬南芥CYP85A2(AT3G30180.1)、菜豆CYP85A(Q69F95)、番茄CYP85A1(Q43147)、野生大豆CYP85A(A0A0B2P9K9)、煙草CYP85A1(A5X6P9)和6個(gè)陸地棉CYP85A2家族基因氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GhCYP85A2-6氧分子結(jié)合區(qū)不完整，GhCYP85A2-3和GhCYP85A2-6血紅素結(jié)合區(qū)缺失，其余基因氨基酸序列均含有完整的CYP85A基因家族高度保守的結(jié)構(gòu)域：C-螺旋、脯氨酸富集區(qū)、K-螺旋、Glu-X-X-Arg 結(jié)構(gòu)域、氧分子結(jié)合區(qū)和血紅素結(jié)合區(qū)[14]。圖1

研究表明，GhCYP85A2-1、GhCYP85A2-2、GhCYP85A2-5和GhCYP85A2-6基因聚集在一個(gè)分支，與核桃和豆科植物親緣關(guān)系較近；GhCYP85A2-3和GhCYP85A2-4基因聚集在另一個(gè)分支，與向日葵等菊科植物親緣關(guān)系較近。6個(gè)陸地棉CYP85A蛋白序列中，GhCYP85A2-1與擬南芥CYP85A2(AT3G30180.1)相似性最高，達(dá)到69.57%，GhCYP85A2-1基因是CYP85A亞家族成員，GhCYP85A2-1可能具有CYP85A家族成員相似的生物功能，參與陸地棉BL的合成。圖2

2.3 GhCYP85A2-1基因VIGS載體的構(gòu)建

研究表明，以陸地棉品種新陸早61號(hào)GhCYP85A2-1基因CDS序列為模板，設(shè)計(jì)VIGS沉默片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖3A)，將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(312 bp)連接到pGEM-T'Easy載體。用EcoRI和KpnI將目的片段進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，觀(guān)察到與目的條帶相同大小片段(圖3B)。將酶切所得目的片段回收并連接到pTRV2載體，對(duì)pTRV2-GhCYP85A2-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，可觀(guān)察到目的條帶及載體條帶(圖3C)。將測(cè)序驗(yàn)證正確的pTRV2-GhCYP85A2-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，獲得陽(yáng)性單克隆(圖3D)。圖3

2.4 沉默載體的侵染與轉(zhuǎn)化

研究表明，pTRV2-GhCHLI、pTRV2-GhCYP85A2-1和pTRV2-00分別與pTRV1菌液等量混合，離心收集菌體，懸浮后侵染新陸早61號(hào)棉花幼苗子葉。侵染2周后可觀(guān)察到pTRV2-GhCHLI菌液處理的棉花葉片被漂白，試驗(yàn)材料種植環(huán)境適宜，且該VIGS體系適用于試驗(yàn)中棉花基因功能研究。侵染40 d后分別統(tǒng)計(jì)pTRV2-GhCYP85A2-1、pTRV2-00和WT處理組棉花株高。pTRV2-00和WT處理組棉花株高無(wú)顯著性差異，而pTRV2-GhCYP85A2-1處理組的棉花株高比pTRV2-00和WT顯著(P<0.05)降低。棉花GhCYP85A2-1基因沉默組與pTRV2-00和WT組相比，平均株高分別降低5.3、5.6 cm。圖4

2.5 GhCYP85A2-1基因沉默效率

研究表明，利用qRT-PCR檢測(cè)GhCYP85A2-1基因在棉花侵染植株中的表達(dá)量， WT和pTRV2-00侵染組中，GhCYP85A2-1基因表達(dá)量無(wú)明顯差異，pTRV2-GhCYP85A2-1侵染組中GhCYP85A2-1基因表達(dá)量極顯著性(P<0.01)降低，pTRV2-GhCYP85A2-1侵染組中棉花GhCYP85A2-1基因的表達(dá)被成功抑制。圖4

3 討 論

油菜素內(nèi)酯(BRs)是一類(lèi)對(duì)植物莖稈伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的高活性物質(zhì)，能有效調(diào)節(jié)植株莖稈高度[19, 20]。植物BR缺陷突變體和BR不敏感型突變體普遍矮化，伴有葉柄、下胚軸短等特征[4, 21, 22]。大多數(shù)BR缺陷突變體在編碼細(xì)胞色素P450(CYP450)的基因活性方面存在缺陷[23]，其中CYP85A亞家族蛋白催化BL生物合成最后的氧化反應(yīng)，CYP85A亞族基因功能缺失將直接影響植物株高發(fā)育。研究表明，CYP85A在竹類(lèi)植物生長(zhǎng)快速階段的基因表達(dá)量明顯高于生長(zhǎng)緩慢期，對(duì)竹類(lèi)植物莖稈及節(jié)間伸長(zhǎng)具有重要作用[18]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，多種植物BR突變體株高出現(xiàn)極端矮化表型[14, 16, 24]。擬南芥CYP85A2敲除突變體表現(xiàn)出與BR缺陷矮化植株相同的表型缺陷，雖然擬南芥CYP85A1活性缺陷的個(gè)體沒(méi)有任何明顯的表型，但CYP85A1、CYP85A2雙重突變體會(huì)加劇CYP85A2突變體的表型，表明CYP85A1和CYP85A2具有重疊的功能[9, 14]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜CsCYP85A1基因突變體植株表現(xiàn)為超緊湊型，節(jié)間幾乎沒(méi)有伸長(zhǎng)，原因可能是黃瓜基因組中雖然有3個(gè)CsCYP85A基因，但只有CsCYP85A1基因有活性。

試驗(yàn)將陸地棉GhCYP85A2-1基因構(gòu)建VIGS基因沉默載體，并對(duì)棉花幼苗進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)pTRV2-GhCYP85A2-1處理組與pTRV2-00和WT組相比，GhCYP85A2-1基因沉默后棉花株高顯著性降低(P<0.05)，平均株高分別降低5.3、5.6 cm。株高矮化程度較低原因可能是陸地棉基因組為異源四倍體，陸地棉基因組中有6個(gè)GhCYP85A2同源基因，GhCYP85A2亞族基因成員之間可能存在功能冗余。另一方面，試驗(yàn)通過(guò)VIGS技術(shù)使陸地棉中GhCYP85A2-1表達(dá)量極顯著降低，但植株中該基因并未被完全沉默，可能會(huì)影響棉花矮化程度，沒(méi)有出現(xiàn)極端矮化表型。已有研究表明，BR與其它激素也存在相互作用，共同調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。如植物中BR通過(guò)誘導(dǎo)GA合成基因D18/GA3ox-2、GA20ox-1、GA20ox-2和GA20ox-5的表達(dá)導(dǎo)致植株中活性GA的積累，促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)[25, 26]；BR也能通過(guò)調(diào)節(jié)葉片節(jié)點(diǎn)生長(zhǎng)素信號(hào)來(lái)促進(jìn)芽的生長(zhǎng)[7]。試驗(yàn)中GhCYP85A2-1基因被沉默后在降低植株中BR生物合成的同時(shí)，可能會(huì)進(jìn)一步影響B(tài)R與多種激素間的相互調(diào)節(jié)作用，最終導(dǎo)致棉花植株矮化。該基因與其他5個(gè)GhCYP85A2同源基因在調(diào)控棉花株高發(fā)育中的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

利用擬南芥CYP85A2基因蛋白序列在陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，獲得6個(gè)陸地棉GhCYP85A2同源基因。陸地棉GhCYP85A2-1基因被沉默后，棉花株高顯著降低，GhCYP85A2-1基因?qū)γ藁ㄖ旮甙l(fā)育有重要調(diào)控作用。