劉 博，張傳鳳，馬克龍，汪長(zhǎng)中，顏貴明

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

炎癥性腸病是一類腸道的慢性炎癥性病變，主要包括潰病性結(jié)腸炎和克羅恩病。在炎癥—不典型增生—腫瘤的演變過(guò)程中牽涉眾多因子的異常表達(dá)和釋放。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)是一種炎癥因子啟動(dòng)子，也被稱為“免疫應(yīng)答的中心調(diào)節(jié)劑”。在腫瘤中，激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transduction-3，STAT-3)通過(guò)抑制NF-κB的核輸出來(lái)維持NF-κB的活性。有關(guān)研究證實(shí)了STAT3和NF-κB在腫瘤中的協(xié)同作用?；罨腟TAT3可以促進(jìn)一些促癌基因的表達(dá)，NF-κB信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)其下游炎癥因子或細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)作為一種炎癥遞質(zhì)，可反映機(jī)體是否存在異常免疫狀態(tài)，其可使炎癥部位產(chǎn)生粘連，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化，使其更容易穿透內(nèi)皮細(xì)胞。

丹皮酚能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，還可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。研究表明，由脂多糖誘導(dǎo)的肺炎損傷的小鼠模型給予一定的丹皮酚治療，能使白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6等細(xì)胞因子的含量明顯降低，說(shuō)明丹皮酚對(duì)炎癥有一定的抑制作用。然而，丹皮酚是否能夠減輕腸道的炎癥反應(yīng)，抑制炎癥向腫瘤的惡化，目前尚不清楚。本研究通過(guò)丹皮酚干預(yù)氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌，探討丹皮酚在其過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為(23±2)g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2014—0007]。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 美沙拉嗪(國(guó)藥準(zhǔn)字 H20143164)：上海愛(ài)的發(fā)制藥有限公司；DSS(批號(hào) S0948)：美國(guó)MP Biomedicals公司；丹皮酚(批號(hào) ZL150806)：南京澤郎生物科技有限公司；STAT-3(批號(hào) AF6294)、NF-κB p65(批號(hào) AF5006)、ICAM-1抗體(批號(hào) AF6088)、一抗稀釋液(批號(hào) P0023A)：碧云天生物技術(shù)公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-1β和IL-10 ELISA試劑盒(批號(hào) 06/2019)：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 儀器 YD-6L生物組織冷凍包埋機(jī)、YD-315輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、YD-AB攤烤片機(jī)：金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；H1-16KR型冷凍離心機(jī)：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；K3型酶標(biāo)儀：LabServ公司；OLYMPUSBX51正置顯微鏡：上海富萊光學(xué)公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制 雄性6～8周C57BL/6小鼠120只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，被隨機(jī)分為空白組、模型組，空白組20只，模型組100只。其中空白組全程自由飲食；模型組小鼠按12.5 mg/kg腹腔注射AOM 1周，后飲用含3% DSS水溶液1周，接著飲用蒸餾水2周，全程共3個(gè)周期，每個(gè)周期分為1周致病期和2周恢復(fù)期。3% DSS致炎劑第二輪結(jié)束后，隨機(jī)取3只小鼠，肉眼可見(jiàn)結(jié)腸有水腫、充血和增生癥狀，留取結(jié)腸，對(duì)其進(jìn)行病理切片、染色，觀察到結(jié)腸組織有腺體縮短、增生，腫瘤生成的狀況，表明炎癥模型復(fù)制成功。

2.2 分組與給藥 將模型復(fù)制成功的小鼠隨機(jī)分為5組：模型組，丹皮酚高劑量(480 mg/kg)、中劑量(240 mg/kg)、低劑量組(120 mg/kg)組，美沙拉嗪組(200 mg/kg)。灌胃容積：10 mL/kg。

2.3 標(biāo)本處理 取標(biāo)本前一晚小鼠禁食不禁水，次日上午麻醉、取眼球血。取血后開(kāi)腹，摘取結(jié)腸，對(duì)腫瘤進(jìn)行計(jì)數(shù)，將一部分結(jié)腸固定于10%甲醛中，用于病理檢測(cè)，將另一部分保存于-80 ℃冰箱，用于Western blot檢測(cè)。稱脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。

2.4 結(jié)腸的組織形態(tài)學(xué)觀察 取甲醛固定的結(jié)腸，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成4 μm薄片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸的組織形態(tài)學(xué)變化。

2.5 血清炎癥因子檢測(cè) 從小鼠眼球取血，室溫靜置1 h，4 ℃下4 000 r/min離心15 min，取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平。

2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取4 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原，PBS洗滌3次，滴加一抗STAT-3、NF-κB p65、ICAM-1，4 ℃孵育過(guò)夜，隔天用PBS緩沖液沖洗3次后，滴加通用型二抗適量，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片。顯微鏡觀察蛋白的表達(dá)情況。

2.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取結(jié)腸組織，根據(jù)組織蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取蛋白樣品。SDS-PAGE制膠電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌3次。加一抗STAT-3(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、ICAM-1(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，二抗(羊抗兔，1∶10 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次。配制顯影液，曝光顯影。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠結(jié)腸腫瘤生長(zhǎng)情況比較 肉眼觀察可見(jiàn)：空白組小鼠結(jié)腸光滑平整，模型組結(jié)腸組織上腫瘤生長(zhǎng)密集，數(shù)量較多，腫瘤間距??；與模型組比較，各治療組用藥后結(jié)腸中腫瘤數(shù)量、間距、大小均有一定改善，尤其是丹皮酚中劑量組結(jié)腸腫瘤間距明顯增大，數(shù)量明顯減少。

3.2 各組小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤質(zhì)量及脾臟指數(shù)比較 與空白組比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)明顯升高(

P

<0.05)；與模型組比較，各治療組小鼠的脾臟指數(shù)均顯著降低(

P

<0.05)，腫瘤數(shù)量及腫瘤質(zhì)量均顯著下降(

P

<0.05)；丹皮酚降低腫瘤數(shù)量、腫瘤質(zhì)量及脾臟指數(shù)的作用呈劑量依賴性(

P

<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量、腫瘤質(zhì)量及脾臟指數(shù)比較

3.3 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化比較 與空白組比較，模型組結(jié)腸炎癥浸潤(rùn)明顯，有隱窩產(chǎn)生，杯狀細(xì)胞減少，上皮組織不典型增生明顯，有腺瘤樣改變；美沙拉嗪組及丹皮酚高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜病變均有不同程度的改善，丹皮酚組相較于美沙拉嗪組有較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和隱窩。見(jiàn)圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.美沙拉嗪組；D.丹皮酚高劑量組；E.丹皮酚中劑量組；F.丹皮酚低劑量組

3.4 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比較 與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高(

P

<0.05)，IL-10水平顯著降低(

P

<0.05)。與模型組比較，各治療組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著降低(

P

<0.05)，IL-10水平顯著升高(

P

<0.05)。丹皮酚中劑量組降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平和升高IL-10水平的作用最優(yōu)。見(jiàn)表2。

3.5 各組小鼠結(jié)腸組織中STAT-3、NF-κB p65、ICAM-1表達(dá)水平比較 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組結(jié)腸組織僅少量細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒，模型組胞質(zhì)、胞核均可見(jiàn)棕黃色和褐色顆粒。各治療組與模型組相比，細(xì)胞核內(nèi)棕黃色和褐色顆粒明顯減少。見(jiàn)圖2。

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65、STAT-3、ICAM-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(

P

<0.05)；與模型組比較，各治療組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65、STAT-3、ICAM-1表達(dá)水平顯著降低(

P

<0.05)或呈降低趨勢(shì)；丹皮酚中劑量組降低結(jié)腸組織中NF-κB p65、STAT-3、ICAM-1蛋白表達(dá)水平的作用最優(yōu)(

P

<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比較

注：A.空白組；B.模型組；C.美沙拉嗪組；D.丹皮酚高劑量組；E.丹皮酚中劑量組；F.丹皮酚低劑量組

注：A.空白組；B.模型組；C.美沙拉嗪組；D.丹皮酚高劑量組；E.丹皮酚中劑量組；F.丹皮酚低劑量組

4 討論

中國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率日益增多，近10年的發(fā)病率增加了近3倍。本研究按照Li等方法采用AOM/DSS誘導(dǎo)結(jié)腸癌模型：肉眼可見(jiàn)模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短，結(jié)直腸表皮有腫瘤生成；顯微鏡下可見(jiàn)結(jié)腸組織有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)排布錯(cuò)亂，腸黏膜破損等現(xiàn)象。

丹皮酚是牡丹干燥根皮中一種有效成分，既往研究表明，其能夠有效改善腸黏膜病變，緩解炎癥反應(yīng)，降低體內(nèi)IL-1、TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平。本研究中，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平高于空白組，表明腸道局部和全身系統(tǒng)的炎癥發(fā)生。給予丹皮酚治療后，與模型組相比，血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低，表明丹皮酚對(duì)結(jié)腸炎有抑制作用。丹皮酚通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)控其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。在本研究中，經(jīng)丹皮酚治療后，結(jié)腸黏膜的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體紊亂等現(xiàn)象減輕，且腸表皮腫瘤數(shù)量減少，腫瘤質(zhì)量減輕，說(shuō)明丹皮酚對(duì)AOM/DSS方法誘導(dǎo)的小鼠“炎—癌轉(zhuǎn)化”有較好的治療作用。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織STAT-3、NF-κBp65、ICAM-1蛋白表達(dá)水平比較

在腫瘤組織中，往往存在免疫功能被抑制的情況，而炎癥卻異?；钴S，產(chǎn)生大量炎癥因子，促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)，并增加腫瘤的發(fā)生率。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，IL-6誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其轉(zhuǎn)錄，活化STAT3，阻斷IL-6與STAT3的關(guān)系，降低STAT3下游分子Bcl-xl的表達(dá)水平，進(jìn)一步降低Bcl-xl調(diào)控細(xì)胞凋亡的能力，降低“炎—癌轉(zhuǎn)化”的風(fēng)險(xiǎn)。炎癥腸病促進(jìn)異型增生的腸上皮細(xì)胞增殖并凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中促炎癥因子IL-6含量顯著增加，從蛋白水平驗(yàn)證了丹皮酚對(duì)致病小鼠的保護(hù)作用與STAT3表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)有關(guān)。同時(shí),美沙拉嗪作為陽(yáng)性對(duì)照藥也可能通過(guò)干預(yù)此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)小鼠結(jié)腸起到保護(hù)作用，丹皮酚與美沙拉嗪對(duì)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)保持一致，與上述文獻(xiàn)報(bào)道呼應(yīng)。IL-10是一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的抗炎細(xì)胞因子，對(duì)TNF-α、IL-6和IL-1等其他炎癥因子有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清IL-10水平下降，TNF-α水平升高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。NF-κB是一種炎癥因子啟動(dòng)子，也即“免疫應(yīng)答的中心調(diào)節(jié)劑”。NF-κB的活化可以誘導(dǎo)腸道中分泌一系列細(xì)胞因子以誘導(dǎo)STAT3活化，加速癌癥發(fā)生，兩者存在協(xié)同效應(yīng)。NF-κB信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)一些炎癥因子的激活，TNF-α表達(dá)水平升高，白細(xì)胞被激活，發(fā)生局部炎癥反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)刺激ICAM-1的合成，造成中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹皮酚通過(guò)STAT-3/NF-κB/ICAM-1信號(hào)通路干預(yù)小鼠結(jié)腸的“炎—癌轉(zhuǎn)化”。下一步將從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的基因表達(dá)水平探究丹皮酚干預(yù)結(jié)腸“炎—癌轉(zhuǎn)化”的機(jī)制。