徐 文，周 妍，朱國旗

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽 合肥 230000；2.安徽省兒童醫(yī)院兒?？?，安徽 合肥 230051；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室,安徽 合肥 230038)

多發(fā)性硬化是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，以青少年發(fā)病為主。多發(fā)性硬化的主要特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變的時間和空間多發(fā)性，臨床以復(fù)發(fā)-緩解病程為主。多發(fā)性硬化目前病因并不十分明確，環(huán)境因素、遺傳、T細胞介導(dǎo)的免疫失衡均參與多發(fā)性硬化的發(fā)病。特別是CD4T細胞和CD8T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、輔助性T細胞17/調(diào)節(jié)性T細胞(T helper cell 17/regulatory cell，Th17/Treg)失衡等在多發(fā)性硬化的發(fā)病中有重要作用。

中醫(yī)藥在多發(fā)性硬化的治療中具有一定優(yōu)勢，中藥人參具有升陽舉陷、益氣固表的作用，其單藥提取物人參皂苷Rg1具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。本研究利用實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型，觀察人參皂苷Rg1對EAE小鼠外周血CD4、CD8、輔助性T細胞1(T helper cell 1，Th1)、Th17、Treg等細胞亞群的影響，探討人參皂苷Rg1改善EAE的可能機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雌性小鼠購買自上海斯萊克實驗動物有限公司，共30只，6周齡，體質(zhì)量為16～18 g，飼養(yǎng)于室內(nèi)溫度為23～26 ℃，相對濕度為40%～60%的環(huán)境中，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，明暗節(jié)律為12 h交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于實驗。

1.2 藥物及試劑 人參皂苷Rg1(批號 22427-39-0，純度≥98%)：上海源葉生物科技有限公司；小鼠髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白33-35(myelin oligodendrocyte glycoprotein 33-35,MOG33-35)：上海強耀生物科技有限公司；弗氏完全佐劑：Sigma公司；百日咳毒素：Merk公司；滅活H37RA結(jié)核分枝桿菌(TB)、FITC-抗小鼠CD4抗體(553651，0.5 mg)、APC-Cy7抗小鼠CD25抗體(557658，0.1 mg)、PerCP-Cy5.5抗小鼠CD4抗體(561115，25 μg)、BV510-抗小鼠CD45抗體(563891，50 μg)、PE-抗小鼠干擾素-γ(interferon gamma, IFN-γ)抗體(554412，0.1 mg)：美國BD生物公司。PECy7-抗小鼠IL-17A抗體(25-7177-82，100 μg)、APC-Foxp3抗體(17-5773-82，100 μg)、FITC-抗小鼠CD8抗體(11-0081-82，100 μg)：Ebioscience公司。

2 方法

2.1 EAE模型復(fù)制方法 利用異戊巴比妥麻醉小鼠后，每只小鼠皮下注射含H37Ra TB 400 μg和MOG35-55 300 μg的100 μL弗氏完全佐劑，分2點背部皮下注射。模型復(fù)制當日，每只小鼠同時腹腔注射百日咳毒素300 ng。48 h后每只小鼠腹腔再次注射百日咳毒素 300 ng。模型復(fù)制后觀察小鼠發(fā)病情況，神經(jīng)功能評分如下：

0分：不發(fā)?。?分：小鼠尾部張力降低或麻痹；2分：尾部麻痹，后肢無力；3分：小鼠后肢癱瘓；4分：小鼠四肢癱瘓，人為翻身后不能復(fù)位；5分：瀕死狀態(tài)或發(fā)病后死亡。EAE臨床評分≥1分即為模型復(fù)制成功，模型復(fù)制成功率>95%。

2.2 分組及給藥 將小鼠隨機分為5組(

n

=6)：正常對照組，模型組，Rg1低劑量(20 mg/kg)、中劑量(40 mg/kg)、高劑量(80 mg/kg)組。EAE模型復(fù)制后第10天，開始進行不同劑量Rg1腹腔注射(調(diào)整容積為100 μL)，每日1次，連續(xù)給藥14 d，模型組和正常對照組小鼠給予同容積生理鹽水。

2.3 樣本收集及組織病理評分 模型復(fù)制后第35天處死小鼠，眼球摘除后取眼眶外周血，離心后用于ELISA檢測。頸椎脫臼處死后，4%多聚甲醛心臟灌流，取頸胸段脊髓約5 mm,于4%多聚甲醛中4 ℃固定2 d，蔗糖梯度脫水后進行石蠟包埋，組織連續(xù)切片后，分別進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和神經(jīng)髓鞘固藍(luxol fast blue staining, LFB)染色，光學(xué)顯微鏡下分別觀察脊髓炎癥細胞浸潤情況和脫髓鞘變化并進行評分：

①HE染色下炎癥細胞浸潤評分標準：0分，無炎癥細胞；1分，少量炎癥細胞；2分，血管周圍組織炎癥細胞浸潤；3分，大量炎癥細胞浸潤。②LFB染色下脫髓鞘評分標準：0分，無脫髓鞘；1分：罕見脫髓鞘；2分：少數(shù)脫髓鞘；3分：大面積脫髓鞘。

2.4 流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中CD4、CD8T細胞占CD45T細胞百分比及Th17(CD4IL-17A)、Th1(CD4IFN-γ)、Treg(CD4CD25Foxp3)的百分比 將小鼠處死后，分離脾臟，在超凈工作臺下用150目細胞篩將脾細胞磨碎，反復(fù)沖洗、離心、分離脾細胞后加入1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為2×10/mL，將樣品分為2份，每管500 μL，其中一管直接在細胞表面標記FITC-CD4、APC-Cy7-CD25，4 ℃孵育30 min，固定破膜后再標記APC-Foxp3，室溫孵育40 min，洗滌細胞后用300 μL PBS重懸細胞。另一管加入50 ng/mL PMA、1 μg/mL離子霉素和3 μg/mL莫能霉素，37 ℃溫箱孵育5 h，洗滌后分別加入FITC-CD8、PerCP-Cy5.5-CD4、APC-Cy7-Dye、BV510-CD45，進行細胞表面染色，4 ℃孵育30 min，固定破膜后再標記PE-IFN-γ、PECy7-IL-17A，室溫孵育40 min，洗滌細胞后用200 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測各細胞亞群百分比。

2.5 ELISA法檢測外周血清中細胞因子水平 取小鼠眼眶外周血后，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，液氮快速淬取，-80 ℃保存，稀釋1倍后檢測血清IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-10水平。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg1對EAE小鼠神經(jīng)癥狀的影響 第12～14天小鼠開始出現(xiàn)EAE癥狀，小鼠飲食活動減少，精神萎靡，并逐漸出現(xiàn)尾尖拖地或單側(cè)后肢或雙后肢癱瘓，部分出現(xiàn)全肢癱瘓。含有一個重復(fù)測量變量的兩因素方差分析結(jié)果(見表1)顯示，組別因素、時間因素的主效應(yīng)及兩者的交互作用均具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，從第15天至實驗結(jié)束，40、80 mg/kg人參皂苷Rg1干預(yù)的EAE小鼠神經(jīng)功能評分均較模型組顯著下降(

P

<0.05)。見圖1。

圖1 不同時點5組小鼠臨床神經(jīng)功能評分比較

表1 含有一個重復(fù)測量數(shù)據(jù)的兩因素方差分析結(jié)果

3.2 人參皂苷Rg1對EAE小鼠脊髓病理變化的影響 HE染色及LFB染色后顯微鏡下觀察，可見EAE小鼠出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤及大面積的髓鞘脫失，而給予不同劑量人參皂苷Rg1干預(yù)后，小鼠炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失減輕，見圖2。與模型組比較，Rg1低、中、高劑量組小鼠炎癥細胞浸潤評分和脫髓鞘評分顯著降低(

P

<0.05)，Rg1高劑量組炎癥細胞浸潤評分和脫髓鞘評分顯著低于Rg1低劑量組(

P

<0.05)。見表2。

圖2 5組小鼠脊髓的組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色下顯示炎癥細胞浸潤情況，LFB染色下顯示脫髓鞘情況)

表2 5組小鼠炎癥細胞浸潤和脫髓鞘評分比較

3.3 人參皂苷Rg1對EAE小鼠脾淋巴細胞亞群的影響 與模型組比較，人參皂苷Rg1低、中、高劑量組小鼠脾淋巴細胞CD4、CD8占CD45T細胞百分比，以及Th1、Th17細胞亞群占CD4T細胞比例顯著減低(

P

<0.05)，而Treg(CD4CD25FoxP3)比例明顯增加(

P

<0.05)，且人參皂苷Rg1的作用呈劑量依賴性。見表3。3.4 人參皂苷Rg1對EAE小鼠外周血IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-10水平的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠外周血IFN-γ、IL-17A、IL-6水平顯著升高(

P

<0.05)，IL-10水平顯著降低(

P

<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低、中、高劑量組IFN-γ、IL-17A、IL-16水平顯著下降(

P

<0.05)，而IL-10水平顯著升高(

P

<0.05)。人參皂苷Rg1的作用呈劑量依賴性。見表4。

4 討論

多發(fā)性硬化可導(dǎo)致肢體無力、肢體癱瘓，本病屬中醫(yī)學(xué)“痿證”“痹證”范疇?！端貑枴ゐ粽摗分赋觯骸捌鉄?，則胃干而渴，肌肉不仁，發(fā)為肉痿；腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯髓減，發(fā)為骨痿?！薄毒霸廊珪氛J為“補中益氣、健脾升清”是治療痿證的重要方法。人參作為傳統(tǒng)中藥，是刺五加科多年生草本植物的干燥根，具有補氣固脫、健脾益肺、寧心益智、養(yǎng)血生津之功效。而人參皂苷Rg1作為人參的主要活性藥理成分，具有明顯的抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用。前期研究顯示，人參皂苷Rg1可以通過調(diào)控PI3K/AKT通路改善小鼠認知及記憶功能。有研究顯示，人參皂苷Rd可緩解EAE。韓國學(xué)者Lee等發(fā)現(xiàn)，韓國紅參和人參中有效成分Rb1和Rg1聯(lián)用可有效抑制Th1、Th17，從而改善EAE，但尚未明確發(fā)揮作用的藥物有效成分。人參皂苷Rg1對EAE的作用尚未見報道。

表3 5組小鼠脾淋巴細胞亞群比較

表4 5組小鼠外周血IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-10水平比較

本研究顯示，人參皂苷Rg1可顯著減輕EAE小鼠的癥狀，有效改善EAE小鼠脊髓的炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失，尤其是人參皂苷Rg1中、高劑量組小鼠的髓鞘脫失和炎癥細胞浸潤程度明顯減輕。結(jié)果提示人參皂苷Rg1可有效改善EAE的臨床癥狀，抑制EAE的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

CD4T細胞在多發(fā)性硬化的發(fā)病機制中具有重要作用，特別是Th1、Th17細胞可能是多發(fā)性硬化治療的重要靶點。Th17細胞最早發(fā)現(xiàn)于2005年，Th17細胞可以穿過血腦屏障，浸潤中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Th17細胞介導(dǎo)發(fā)病主要依賴細胞因子IL-17A。研究表明，IL-17A可增強各種炎癥遞質(zhì)的分泌，包括IL-6、TNF-1、MIP-2、CXCL-1等，IL-17A是中性粒細胞浸潤和炎癥細胞因子的有效誘導(dǎo)劑，在多發(fā)性硬化患者的斑塊和腦脊液中均可以檢測到IL-17A高表達。Treg細胞被認為是維持外周對自身抗原耐受的關(guān)鍵因素，可通過各種可溶性遞質(zhì)如IL-10、TGF-β發(fā)揮其免疫抑制作用，F(xiàn)op3為其關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。多發(fā)性硬化可能與Treg細胞失衡，Th1、Th17反應(yīng)增強相關(guān)，這種失衡可能由于Treg細胞的抑制功能缺失導(dǎo)致髓鞘破壞，引起神經(jīng)損傷和神經(jīng)炎癥。本研究顯示，人參皂苷Rg1可明顯抑制CD4T細胞及CD8T細胞亞群的表達，特別是人參皂苷Rg1高劑量可顯著抑制CD4T細胞表達。同時人參皂苷Rg1也可以抑制Th1、Th17細胞表達，而與之對應(yīng)，人參皂苷Rg1的應(yīng)用可引起Treg細胞水平上調(diào)。在細胞因子水平，人參皂苷Rg1可抑制IFN-γ、IL-17A、IL-6等炎癥細胞因子表達，而作為抑制性因子的IL-10表達則上調(diào)。這提示人參皂苷Rg1可通過抑制Th17、Th1細胞及其分泌的炎癥細胞因子而調(diào)控Treg細胞失衡，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過度激活，從而改善EAE的臨床癥狀。

綜上所述，人參皂苷Rg1可有效緩解EAE小鼠模型的臨床癥狀，減輕其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失，其作用機制可能與調(diào)控Th17/Treg細胞亞群平衡，抑制炎癥因子水平有關(guān)。