周大祥，龍泉洲，殷幼平，熊 書(shū)

（1.重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/重慶市基因功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400300；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，萬(wàn)州404120；3.重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，萬(wàn)州 404120）

青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種廣泛分布的土傳病原細(xì)菌，能夠侵染50多個(gè)科，200多種植物，在全球范圍內(nèi)能夠?qū)е轮卮蟮慕?jīng)濟(jì)損失[1]。由該菌引起的青枯病最早于1864年在煙草中報(bào)道，它的起源和早期傳播仍未確定。青枯雷爾氏菌能夠在潮濕的土壤或水體中存活數(shù)年[2]，當(dāng)遭遇易感宿主，青枯雷爾氏菌就會(huì)進(jìn)入植物根部，在根部皮層定殖，然后入侵木質(zhì)部導(dǎo)管，最終通過(guò)導(dǎo)管系統(tǒng)迅速擴(kuò)展到植物地上部，在宿主體內(nèi)大量增殖引起導(dǎo)管堵塞與功能紊亂，出現(xiàn)萎焉癥狀。

hrcN基因作為植物病原菌T3SS結(jié)構(gòu)基因之一，表達(dá)產(chǎn)物為ATP酶（ATPase），通過(guò)催化ATP的水解為效應(yīng)蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP產(chǎn)生的能量重塑多種蛋白底物，因此在膜融合、蛋白質(zhì)修飾和降解等許多生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用[3]。Pozidis等[4]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas syringas的HrcN是一種定位于外周膜上的ATP酶，能催化蛋白質(zhì)易位。與其他T3SS相關(guān)的ATP酶一樣，HrcN與F0/F1-ATPase亞基同源，包含介導(dǎo)ATP結(jié)合和水解的Walker框[5]。由于T3SS分子伴侶不能被分泌或轉(zhuǎn)運(yùn)，必須在效應(yīng)蛋白分泌前從分子伴侶-效應(yīng)蛋白復(fù)合體中釋放出來(lái)，這種作用是由T3SS相關(guān)的ATP酶（InvC和HrcN）以ATP依賴(lài)的方式進(jìn)行的。這些ATP酶也作為T(mén)3SS效應(yīng)蛋白的去折疊酶發(fā)揮作用，使效應(yīng)蛋白保持未折疊或部分未折疊的構(gòu)象[6]。最近Gan等[7]研究發(fā)現(xiàn)T3SS效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)位依賴(lài)于分子伴侶HpaB的C端區(qū)域，其C-端區(qū)域的缺失極大的減少了從HpaB與T3SS效應(yīng)蛋白復(fù)合物中釋放出游離效應(yīng)蛋白的數(shù)量，其中，HrcN以ATP依賴(lài)的方式催化該反應(yīng)。蛋白互作研究顯示，HrcN與T3SS底物特異性開(kāi)關(guān)蛋白HpaC以及分子伴侶HpaB相互作用，促進(jìn)多種效應(yīng)蛋白的分泌[8]。研究還發(fā)現(xiàn)HrcN可與HrcU和HrcV內(nèi)膜蛋白互作[9]。

前期在擴(kuò)增出青枯雷爾氏菌hrcN基因序列基礎(chǔ)上，比對(duì)發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因與假單胞菌Pseudomonas syringas1448A、黃單胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和細(xì)菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性較高，其中與細(xì)菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷爾氏菌T3SS基因hrcN為研究對(duì)象，利用融合PCR技術(shù)和電轉(zhuǎn)化獲得青枯雷爾氏菌CBM613菌株的hrcN基因突變株和回補(bǔ)菌株，通過(guò)測(cè)定致病力、生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株與質(zhì)粒：野生型番茄青枯雷爾氏菌CBM613菌株由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院饋贈(zèng)，為強(qiáng)致病力菌株；TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；pMD19-T載體購(gòu)自日本TAKARA公司；pJQ200SK、pCVD442和pRK415質(zhì)粒載體本實(shí)驗(yàn)室保存。

供試植物：番茄為感病品種中蔬5號(hào)，28 ℃～30 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光周期16L﹕8D，相對(duì)濕度90%，種苗培養(yǎng)至5～6片葉時(shí)備用。

試劑及儀器：NA（Nutrient Agar）培養(yǎng)基（牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蒸餾水加至1000 mL，pH為6.8～7.0）、NB（Nutrient Broth）培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基不加瓊脂）、LB（Lysogeny Broth）培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.0）、TSB（Tryptic Soy Broth）培養(yǎng)基（胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.2）、Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（KH2PO413.6 g，(NH4)2SO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 mg，L-谷氨酸2.9 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.0）、半固體SMM（Supplemental minimal medium）培養(yǎng)基（葡萄糖0.1 g，蛋白胨0.1 g，EDTA-2Na 38 mg，瓊脂3.5 g，磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）10 mL，加入雙蒸水定容到1000 mL）、CPG（Casamino acids Peptone Glucose）培養(yǎng)基（酵母粉1 g，葡萄糖10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，加入雙蒸水定容到1000 mL，pH為7.0）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；PrimeSTAR Max Premix (2×)購(gòu)自日本TAKARA公司；TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer購(gòu)自立陶宛MBI公司；DMSO購(gòu)自德國(guó)Biofroxx公司；其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。5910R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；C1000 PCR儀、核酸電泳儀、Versadoc 1000凝膠成像系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔轉(zhuǎn)化儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 突變株及回補(bǔ)菌株的獲得 參考青枯雷爾氏菌GMI1000hrcN基因設(shè)計(jì)引物hrcN-F（5′-GGCTGAT ATCGGATCCATGACCCATCTCGCGCTG-3′）和hrcN-R（5′-GGTGGTGGTGCTCGATCATGCCAGTGCG ATCTCGTC-3′）。提取CBM613菌株DNA，PCR擴(kuò)增。將回收的DNA片段連接到T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取PCR驗(yàn)證過(guò)的陽(yáng)性克隆菌株測(cè)序。利用Krogh等[10]的方法預(yù)測(cè)分子量、PI、跨膜區(qū)域和親水性；利用深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)SignalP 5.0[11]預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw在線比對(duì)hrcN的基因和蛋白質(zhì)序列； Motif預(yù)測(cè)蛋白功能采用Nicolas等[12]的方法；利用http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/GnegmPLoc.cgi 在線預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。

根據(jù)hrcN基因及上下游序列、慶大霉素（Gm）抗性基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），首先擴(kuò)增出hrcN基因上、下游同源重組臂序列，從pJQ200SK質(zhì)粒上擴(kuò)增Gm抗性基因編碼序列；然后利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段（hrcN基因上游-Gm-hrcN基因下游），經(jīng)SmaI酶切完成打靶載體pCVD442-ΔhrcN::Gm的構(gòu)建；最后通過(guò)同源重組和電轉(zhuǎn)化大腸桿菌，與受菌體（CBM613菌株）結(jié)合，在含Gm的NB培養(yǎng)基上篩選突變株，并用表1中的鑒定引物鑒定突變株。

表1 hrcN基因敲除所需引物Table 1 Primers used in hrcN gene knockout

通過(guò)hrcN-1F/hrcN-1R擴(kuò)增出hrcN片段，經(jīng)XbaI/EcoR I酶切后克隆入pRK415質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞后，鋪四環(huán)素（Tc）平板篩選陽(yáng)性克隆，完成pRK415-hrcN基因回補(bǔ)質(zhì)粒構(gòu)建?；匮a(bǔ)質(zhì)粒pRK415-hrcN電轉(zhuǎn)化大腸桿菌，與受體菌（CBM613/ΔhrcN）結(jié)合，在含Tc的TSB培養(yǎng)基上篩選回補(bǔ)菌株，用pRK415-F/pRK415-R引物進(jìn)行PCR鑒定回補(bǔ)菌株。

1.2.2 表型測(cè)定 番茄感病品種為中蔬5號(hào)，按照He等[13]根部接種法接種菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補(bǔ)菌株各接種15株，3次重復(fù)。按照Meng等[14]的方法計(jì)算青枯病的病情指數(shù)；分別挑取3種菌株于NB培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)獲得菌懸液，10000 r/min離心5 min收集菌體。按照Kanda等[15]方法測(cè)定600 nm的吸光度值，計(jì)算生長(zhǎng)曲線；取濃度為3×108CFU/mL的野生型菌株、突變株和回補(bǔ)菌株菌液各5 μL，3種菌株的泳動(dòng)性檢測(cè)按照Kelman等[16]方法測(cè)量菌落直徑。3種菌株的生物被膜的測(cè)定參考Meng等[17]的方法測(cè)定490 nm的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 hrcN基因的擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，圖1結(jié)果顯示，條帶清晰而且特異，大小1300 bp左右。將該條帶回收，然后連接到T載體并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并測(cè)序，測(cè)序發(fā)現(xiàn)基因長(zhǎng)度為1320 bp，共編碼439個(gè)氨基酸，結(jié)果表明已擴(kuò)增出番茄青枯雷爾氏菌CBM613的hrcN基因，DNA序列已提交到GenBank（Gene ID：No.42594317）。預(yù)測(cè)HrcN蛋白分子量為47.54 kD，PI為4.97，無(wú)信號(hào)肽（預(yù)測(cè)有信號(hào)肽概率為1.734%），無(wú)跨膜區(qū)域，整體呈弱親水性（圖2）。Motif預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白為ATP酶，蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞內(nèi)膜和細(xì)胞質(zhì)。

圖1 菌株CBM613 hrcN基因的擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification production of strain CBM613 hrcN gene

圖2 菌株CBM613 HrcN蛋白親水性預(yù)測(cè)Fig. 2 Hydrophilicity prediction of HrcN in strain CBM613

通過(guò)與菌株GMI1000的hrcN基因序列進(jìn)行在線比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因一致性為99.6%，在青枯雷爾氏菌中非常保守。青枯雷爾氏菌與參比菌株GMI1000hrcN基因相比共有5個(gè)SNP位點(diǎn)，具體突變信息為 216：A-G GTA-GTG val；609：T-C CGT-CGC arg；879：T-C CGT-CGC arg；907：G-A GCC-ACC ala-thr；999：T-C GGT-GGC gly。只有907位氨基酸發(fā)生改變（由GMI1000的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸），其他5個(gè)SNP都是無(wú)意突變。

2.2 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建

突變體篩選的抗性基因采用Gm抗性基因（長(zhǎng)度832 bp），hrcN基因上游同源重組臂和下游同源重組臂長(zhǎng)度分別為799和742 bp，利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段（上游同源重組臂-Gm抗性基因編碼序列-下游同源重組臂），長(zhǎng)度為2373 bp。圖3電泳圖顯示，泳道1中有4條帶，其中最亮的條帶為打靶序列片段，電泳結(jié)果表明成功構(gòu)建了打靶序列片段。

圖3 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建Fig. 3 Construction of targeting sequence of hrcN gene

2.3 hrcN基因突變株的構(gòu)建

將供菌體和受菌體（CBM613菌株）混合結(jié)合后，抗性平板上培養(yǎng)單克隆，隨機(jī)挑選 10個(gè)單克隆，用hrcN基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR鑒定。如發(fā)生二次重組，則這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，否則有227 bp的特異性擴(kuò)增條帶。圖4結(jié)果顯示：第1～6號(hào)克隆為陰性擴(kuò)增，表明hrcN基因可能已被敲除；7～10號(hào)克隆有227 bp的特異性條帶，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生二次重組，hrcN基因未能成功敲除。

圖4 菌株CBM613 hrcN突變體內(nèi)部引物鑒定Fig. 4 PCR analysis of hrcN-in of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

將上述1號(hào)克隆再次進(jìn)行hrcN基因內(nèi)部引物鑒定，為陰性擴(kuò)增后用hrcN基因外側(cè)引物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。圖5顯示，條帶2為原始菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2739 bp；條帶1為Gm抗性基因替換菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2580 bp，同時(shí)測(cè)序結(jié)果顯示局部序列同設(shè)計(jì)。該克隆子為最終的hrcN基因被Gm抗性基因替換的陽(yáng)性克隆，稱(chēng)為：CBM613/ΔhrcN。

圖5 菌株CBM613 hrcN突變體外側(cè)引物鑒定Fig. 5 PCR analysis of hrcN-out of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

2.4 回補(bǔ)菌株的篩選及鑒定

在Tc平板上的陽(yáng)性克隆用pRK415-F/pRK415-R載體引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。當(dāng)hrcN克隆入設(shè)計(jì)位點(diǎn)后，這對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1634 bp。圖6結(jié)果顯示，1～6號(hào)全部克隆都有預(yù)期長(zhǎng)度的特異片段擴(kuò)增，取第1號(hào)克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)一致。經(jīng)轉(zhuǎn)化CBM613/ΔhrcN受體菌后，涂布篩選出陽(yáng)性克隆，pRK415-F/pRK415-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有預(yù)期長(zhǎng)度的特異片段擴(kuò)增，表明青枯雷爾氏菌突變株hrcN基因回補(bǔ)成功。

圖6 hrcN基因回補(bǔ)菌株鑒定Fig. 6 PCR analysis of the complemented strain of hrcN gene

2.5 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇虏×Φ挠绊?/h3>

hrcN基因敲除后，在NA培養(yǎng)基上28 ℃生長(zhǎng)5 d，突變株和回補(bǔ)菌株菌落形態(tài)與野生型菌株相比無(wú)明顯變化（圖7）。進(jìn)一步將野生型菌株、hrcN基因突變株和回補(bǔ)菌株采用根部接種法接種番茄測(cè)定致病力結(jié)果表明，野生型菌株接種番茄植株后，在第4 d開(kāi)始發(fā)病，突變株在第5 d才開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫癥狀。圖8為野生型菌株、突變株和回補(bǔ)菌株在接種后第7 d的發(fā)病情況可知，野生型菌株的病情指數(shù)為1.87，突變株僅為0.27，下降了85.56%；相比野生型菌株，回補(bǔ)菌株病情指數(shù)為1.67，突變株的致病力能夠部分恢復(fù)。接種12 d后，野生型菌株的病情指數(shù)高達(dá)3.49，而突變株僅為1.89，回補(bǔ)菌株有所恢復(fù)為3.18。接種試驗(yàn)結(jié)果顯示：突變株較野生型菌株的致病力下降，病程延長(zhǎng)，但并未喪失致病力，表明hrcN基因是青枯雷爾氏菌致病性相關(guān)的重要基因。

圖7 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補(bǔ)菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的菌落形態(tài)Fig. 7 Colony morphology of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and BM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

圖8 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補(bǔ)菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的致病力測(cè)定Fig. 8 Evaluation of the pathogenicity of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

2.6 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇L(zhǎng)曲線的影響

分別將CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補(bǔ)菌株在Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基）和 CPG培養(yǎng)基（富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基）中進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定，野生型菌株、突變株和回補(bǔ)菌株在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率差異不明顯（圖9）。

圖9 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補(bǔ)菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線Fig. 9 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the CPG medium

3種青枯雷爾氏菌在貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，突變株比野生型菌株生長(zhǎng)更快（圖10），生長(zhǎng)速率開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），回補(bǔ)菌株與野生型菌株生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異。

圖10 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補(bǔ)菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線Fig. 10 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the mimimal medium

2.7 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇\(yùn)動(dòng)性的影響

利用半固體SMM培養(yǎng)基，研究CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補(bǔ)菌株的運(yùn)動(dòng)性。通過(guò)測(cè)量菌落直徑，野生型菌株、突變株和回補(bǔ)菌株的運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有顯著差異，結(jié)果表明hrcN基因敲除沒(méi)有影響青枯雷爾氏菌的運(yùn)動(dòng)性（圖11）。

圖11 菌株CBM613、hrcN基因突變株CBM613/ΔhrcN和回補(bǔ)菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的運(yùn)動(dòng)性Fig. 11 The mobility of of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

2.8 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇锉荒ば纬赡芰Φ挠绊?/h3>

通過(guò)對(duì)比菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補(bǔ)菌株的生物被膜形成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種青枯雷爾氏菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增強(qiáng)，突變株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力顯著減弱，而回補(bǔ)菌株與野生型菌株相比差異不明顯（圖12）。

3 討論

作為植物病原菌分泌毒力因子的重要裝置，分泌系統(tǒng)一直以來(lái)都是病原細(xì)菌研究的熱點(diǎn)，其中 T3SS在各型分泌系統(tǒng)中研究較多[18]。革蘭氏陰性動(dòng)植物病原菌利用T3SS將效應(yīng)蛋白注入真核宿主細(xì)胞中，跨膜T3SS裝置和ATP酶有關(guān)，ATP酶可為分泌過(guò)程提供能量。hrcN基因表達(dá)產(chǎn)物為ATP酶，該酶在細(xì)菌內(nèi)膜上形成一個(gè)與分泌器相關(guān)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并在效應(yīng)蛋白的分泌過(guò)程提供能量，對(duì)T3SS和細(xì)菌的致病性是必不可少的。hrcN基因敲除后對(duì)致病力等表型的影響還未見(jiàn)報(bào)道，但與HrcN蛋白具有相同功能的InvC蛋白基因敲除后，突變株較野生型菌株毒力與定殖率皆顯著降低[19]。InvC與大腸桿菌F0/F1-ATPase具有催化功能的β亞基氨基酸序列相似程度很高，invC基因突變后其蛋白水解ATP的能力喪失，突變體分析進(jìn)一步鑒定出InvC參與核苷酸水解和膜結(jié)合的氨基酸序列[20]。本研究以青枯雷爾氏菌T3SS的hrcN基因?yàn)檠芯繉?duì)象，該基因是AAA+ATPase家族成員之一，產(chǎn)物為ATP酶。利用同源重組技術(shù)得到了hrcN基因部分缺失突變株，發(fā)現(xiàn)突變株較野生型菌株的致病力下降，病程延長(zhǎng)，與青枯雷爾氏菌T3SS效應(yīng)蛋白基因Rip56敲除后致病力測(cè)定結(jié)果相似[21]。結(jié)果表明hrcN是青枯雷爾氏菌的致病基因之一，影響T3SS效應(yīng)蛋白的分泌。

接種試驗(yàn)表明，hrcN基因突變株導(dǎo)致青枯雷爾氏菌對(duì)番茄的致病力下降，為了充分研究基因功能，進(jìn)一步對(duì)其生長(zhǎng)速率、生物被膜和運(yùn)動(dòng)性等基礎(chǔ)生物學(xué)特性進(jìn)行探究。Kanda等[15]測(cè)定了煙草青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，不管在貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或者富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，野生型菌株與hrpB基因突變株生長(zhǎng)速率基本一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型菌株、hrcN基因突變株和回補(bǔ)菌株在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率基本一致，在貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，hrcN基因突變株比野生型菌株生長(zhǎng)更快，這與Kanda等[15]的研究結(jié)論不一致。在貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上突變株比野生型菌株生長(zhǎng)更快的文獻(xiàn)還未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)番茄青枯雷爾氏菌hrcN基因突變后的代謝是否產(chǎn)生變化尚未可知，需進(jìn)一步通過(guò)組學(xué)等技術(shù)探究其原因。

病原菌通過(guò)自身的運(yùn)動(dòng)獲得了更大的生存空間，鞭毛等器官可為其提供運(yùn)動(dòng)能力。通過(guò)運(yùn)動(dòng)性病原菌對(duì)有利或不利的環(huán)境快速做出響應(yīng)，避開(kāi)有害的環(huán)境，接近有利的宿主附近，擴(kuò)大生存范圍。運(yùn)動(dòng)性能夠促使植物病原菌在侵染初期識(shí)別、吸附和入侵宿主植物并進(jìn)行定殖和擴(kuò)展，提高病原菌的致病能力，而運(yùn)動(dòng)性對(duì)病原菌入侵植物后的階段不起作用[22]。此次研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因敲除后對(duì)番茄青枯雷爾氏菌的運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有影響，而敲除spoT和relA基因后對(duì)青枯雷爾氏菌的運(yùn)動(dòng)能力影響很大[23]。

生物被膜作為保護(hù)細(xì)菌的生物活性膜，能夠形成在非有機(jī)體和有機(jī)體的表面。其主要成分為蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)和胞外DNA等，是一種復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變，細(xì)菌形成生物被膜可以保持水分，通過(guò)調(diào)節(jié)代謝降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，從而有助于細(xì)菌存活。細(xì)菌形成的生物被膜將自身包圍，處于其中的細(xì)菌相互彼此接觸，影響許多微生物的生存與定殖，比如植物病原細(xì)菌通過(guò)昆蟲(chóng)傳播、直接侵入或從受傷部位入侵植物組織，利用生物被膜增強(qiáng)在植物根、莖、葉和種子等部位的定殖與生存，通過(guò)阻塞植物木質(zhì)部導(dǎo)管和維管束組織，引起組織損傷，破壞被感染的組織，造成植物萎蔫。玉米細(xì)菌性萎蔫病病原菌Pantoeastewartii、馬鈴薯軟腐病病原菌Pectobacterium carotovorumbrasiliense和油菜黑腐病病原菌Xanthomonas campestris等的生物被膜能夠阻塞植物木質(zhì)部導(dǎo)管和維管束組織，引起組織損傷，破壞被感染的組織，造成植物萎蔫[24-26]。研究還發(fā)現(xiàn)，柑橘潰瘍病病原菌Xanthomonas citri的T3SShrpB缺失突變株不能在柑橘葉片表面聚集，喪失生物被膜的形成能力[27]，革蘭氏陰性菌Acidovorax citrulli的4個(gè)Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因突變株在甜瓜種子上形成生物被膜和定殖的能力降低[28]，某些分泌系統(tǒng)與生物被膜形成和細(xì)胞聚集有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因突變株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力顯著減弱，結(jié)合hrcN基因突變株致病力降低，說(shuō)明hrcN基因敲除后，番茄青枯雷爾氏菌生物被膜形成能力降低，番茄木質(zhì)部導(dǎo)管阻塞程度減弱，萎蔫減輕，病情指數(shù)降低。本研究為后續(xù)探究青枯菌 T3SS的功能及其致病機(jī)制提供基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因敲除后菌株毒性減弱，未來(lái)可以作為青枯病的生防菌株，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。