陳名君，汪 婷，卞林猛，林 儼，黃 勃

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 20036）

蟑螂是蜚蠊目Blattaria昆蟲的俗稱，大多數(shù)棲居野外，少數(shù)種棲息室內(nèi)。德國(guó)小蠊Blattaria germanica、美洲大蠊Periplaneta americana、澳洲大蠊P. australasiae、東方蜚蠊Blatta orientalis等一些種類是世界性衛(wèi)生害蟲[1]，其中德國(guó)小蠊具有較強(qiáng)的繁殖、擴(kuò)散和適應(yīng)能力[2]，是全球最普遍、最難治理的蟑螂種群[3]。它能機(jī)械性地?cái)y帶多種病原菌，導(dǎo)致人類腹瀉、痢疾等疾病[4]，同時(shí)也給人們正常的生活和工作造成困擾。目前，化學(xué)防治仍是殺滅德國(guó)小蠊的重要手段，但這種防治方式不僅會(huì)造成環(huán)境污染、殺傷天敵，而且隨著殺蟲劑的長(zhǎng)期廣泛使用，使德國(guó)小蠊產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[4-6]。因此，亟需尋求對(duì)德國(guó)小蠊安全有效且對(duì)環(huán)境友好的防治方法。而微生物防治害蟲具有綠色環(huán)保、對(duì)生態(tài)安全、可大規(guī)模生產(chǎn)以及可持續(xù)控制的優(yōu)勢(shì)，所以利用微生物來(lái)防治德國(guó)小蠊具有良好的前景。

貴州綠僵菌Metarhizium guizhouense屬子囊菌門 Ascomycota、糞菌綱 Sordariomycetes、肉座菌目Hypocreales、麥角菌科 Clavicipitaceae、綠僵菌屬M(fèi)etarhizium，是一種昆蟲病原真菌。郭好禮等[7]從貴州的鱗翅目幼蟲上分離到一株綠僵菌，其孢子長(zhǎng)度在6.7～7.3 μm，被命名為貴州綠僵菌。其與常見金龜子綠僵菌M. anisopliae的區(qū)別在于分生孢子兩端稍尖，分生孢子鏈的連接點(diǎn)明顯不在同一中心軸上。Liu等[8]認(rèn)為貴州綠僵菌和戴氏綠僵菌M. taii兩者形態(tài)和同工酶相近，戴氏綠僵菌應(yīng)為貴州綠僵菌的異名。2006年Huang等[9]測(cè)定分析了平沙綠僵菌M. pingshaense、貴州綠僵菌和戴氏綠僵菌ITS序列，認(rèn)為這3種綠僵菌都應(yīng)視為金龜子綠僵菌小孢變種M. anisopliaevar. anisopliae的異名，同時(shí)也確認(rèn)貴州綠僵菌和戴氏綠僵菌親緣關(guān)系很近。Bischoff等[10]利用多基因分析進(jìn)一步揭示了整個(gè)金龜子綠僵菌支系的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，最終將金龜子綠僵菌類群劃分為九個(gè)種，包括貴州綠僵菌種級(jí)分類地位的確定，并正式將戴氏綠僵菌作為貴州綠僵菌的異名來(lái)處理。隨著該菌分類地位的明確，學(xué)者們對(duì)該菌也進(jìn)行了大量的應(yīng)用研究。申劍飛等[11]研究發(fā)現(xiàn)貴州綠僵菌菌株CQM135對(duì)花生蠐螬具有良好的防治效果。Narit等[12]研究了利用貴州綠僵菌防治泰國(guó)楝樹食皮木蠹蛾Cossus chloratus生物防治效果，研究發(fā)現(xiàn)利用該菌防治食皮木蠹蛾是一種有效且生態(tài)友好的措施。Narit和Aran[13]也研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)貴州綠僵菌處理過(guò)的實(shí)蠅雄蟲可以將該菌傳播給未處理的雄蠅和雌蠅，從而可以有效降低實(shí)蠅種群。

不同種的綠僵菌寄主專一性有所區(qū)別，而且生防菌株存在一定的寄主?；?，在使用綠僵菌生物農(nóng)藥過(guò)程中寄主限制問(wèn)題也尤為突出。因此，正確鑒別綠僵菌菌種，對(duì)綠僵菌殺蟲劑的研制和開發(fā)有著重要的指導(dǎo)意義[18]。不同地理來(lái)源、不同寄主來(lái)源的菌株在生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢能力及致病力等方面都存在很大差異[14]，且只有在適宜的環(huán)境下才更容易寄生昆蟲[15-17]，所以開展生防菌株生物學(xué)特性研究，系統(tǒng)掌握其生物學(xué)特性，從而達(dá)到更好地利用真菌防治害蟲具有重要意義[17]。本試驗(yàn)是利用從安徽省宣城市麻姑山林場(chǎng)采集到的德國(guó)小蠊自然罹病蟲尸分離得到的一株綠僵菌，進(jìn)行分離鑒定及保存，并系統(tǒng)研究了其生物學(xué)特性，以期為重要的衛(wèi)生害蟲德國(guó)小蠊的生物防治提供種質(zhì)資源和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮清洗，取200 g切塊，加水1000 mL在電磁爐上煮15 min后紗布過(guò)濾，濾液中加瓊脂15 g，葡萄糖20 g，加熱熔化后定容至1000 mL。

PPDA培養(yǎng)基：按PDA培養(yǎng)基配制，加蛋白胨10 g，加蒸餾水定容至1000 mL。

SDAY培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，加入蒸餾水定容至1000 mL。

SMAY培養(yǎng)基：麥芽糖40 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，加入蒸餾水定容至1000 mL。

Czapek培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，加水定容至1000 mL[3]。

水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL。

1.3 菌株培養(yǎng)鑒定

將分離得到的一株綠僵菌菌株RCEF6416接到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)6～14 d，觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)大小等。

近年來(lái)高校教師崗前培訓(xùn)項(xiàng)目形式主義嚴(yán)重，遭遇不少批評(píng)，甚至有人以英、美等國(guó)家并無(wú)此類性質(zhì)的培訓(xùn)來(lái)質(zhì)疑教師崗前培訓(xùn)的必要性。新教師崗前培訓(xùn)是教師步入教學(xué)工作中的重要環(huán)節(jié)，培訓(xùn)項(xiàng)目應(yīng)當(dāng)充分考慮到教師個(gè)人的發(fā)展需要，不充分考慮教師的需求就盲目進(jìn)行培訓(xùn)，會(huì)造成人力、物力和財(cái)力的浪費(fèi)。應(yīng)當(dāng)根據(jù)教師的職業(yè)生涯成長(zhǎng)規(guī)律來(lái)展開培訓(xùn)工作，通過(guò)激勵(lì)機(jī)制或者是評(píng)價(jià)機(jī)制來(lái)解決教師工作中的問(wèn)題，這樣教師崗前培訓(xùn)的效果才能得到切實(shí)地提高。

1.4 菌絲制備、DNA提取、EF-1α序列擴(kuò)增、序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌絲制備：將供試菌株接種到鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)5 d左右，待產(chǎn)生大量菌絲后，從玻璃紙上刮取菌絲，保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提?。簠⒄罩旌獾萚19]的方法提取菌體總DNA，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

EF-1a 序列擴(kuò)增：反應(yīng)體系（25 μL：2.5 μL Buffer，0.5 μL dNTP，正反引物各 1 μL，0.2 μLTaq聚合酶和1 μL模板DNA。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后于凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照并送于北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。擴(kuò)增引物EF-1a：983F（5′?GCYCCYGGH CAYCGTGAYTTYAT?3′）、2218R（5′?ATGACACCRACRGCRACRGTYTG?3′）[20]。

序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析：將試驗(yàn)菌株序列與GenBank中下載已登錄的綠僵菌EF-1a序列信息一起，用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件分別對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析并以fas格式保存，用MEGA 7.0軟件將其轉(zhuǎn)換為Nexus文件格式，通過(guò)PAUP軟件用最大簡(jiǎn)約法MP構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)形態(tài)和系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果進(jìn)行物種多樣性分析[20]。

1.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量的影響

將分離得到的綠僵菌配制成 1.0×106孢子/mL懸浮液，用微量取樣器吸取 2 μL分別接種于 PDA、PPDA、SDAY、SMAY和Czapek培養(yǎng)基中心，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱（光周期12L:12D）中倒置培養(yǎng)，每組試驗(yàn)設(shè)置5次重復(fù)。從第3 d開始，每天測(cè)量菌落直徑，測(cè)橫縱直徑求取平均值，共觀察至14 d。觀察結(jié)束后，用打孔器（直徑1.2 cm）在菌落中心及橫縱軸對(duì)稱位置取5個(gè)菌塊，置于20 mL 0.05%的吐溫- 80無(wú)菌水的三角瓶中，磁力攪拌10 min振蕩均勻，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子的數(shù)量[21]。

1.6 不同鹽濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)速度的影響

配置NaCl鹽濃度分別為0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L和0.25 mol/L的PDA培養(yǎng)基，每組處理設(shè)置3次重復(fù)。以無(wú)NaCl的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照組，接種和培養(yǎng)方法同1.5。從第3 d開始每天進(jìn)行菌落直徑測(cè)量至14 d。

1.7 不同pH對(duì)菌株生長(zhǎng)速度的影響

用無(wú)菌的稀NaCl溶液和10%的NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)成6、7、8、9共4個(gè)梯度（中性培養(yǎng)基或堿性培養(yǎng)基先調(diào) pH，滅菌后取出倒平板即可。酸性培養(yǎng)基若滅菌前加入鹽酸，在滅菌高溫下會(huì)與瓊脂反應(yīng)不易凝固，應(yīng)滅菌后在無(wú)菌操作臺(tái)將pH調(diào)至6。每組設(shè)置3次重復(fù)，接種和培養(yǎng)方法同1.5。從第3 d開始每天進(jìn)行菌落直徑測(cè)量至14 d。

1.8 高溫脅迫對(duì)孢子萌發(fā)率的影響

用0.05%的吐溫- 80試劑配置濃度為1×106孢子/mL懸浮液，用微量移液器移取3 mL孢子懸浮液于5 mL容積的離心管中，分別置于35 ℃，40 ℃和45 ℃的恒溫水浴鍋中水浴，各溫度下分別處理15 min，30 min，60 min，120 min和240 min。水浴振蕩均勻移取20 μL孢子懸浮液均勻涂布在水瓊脂培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后觀察。以25 ℃水?。ǔ兀┑逆咦討腋∫鹤鳛閷?duì)照組，每組試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，形成菌絲或芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子50%記為萌發(fā)，計(jì)算孢子萌發(fā)率，每處理重復(fù)3次[16]。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

菌落直徑＝（菌落橫徑＋菌落縱徑）/2；菌落直徑日增長(zhǎng)量（cm/d）×平均菌落直徑/培養(yǎng)天數(shù)；每cm2菌落含孢量＝平均每小格孢子數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)/打孔器面積；每mL孢子總量＝80小格內(nèi)孢子總數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)；孢子萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)的孢子數(shù)/觀察孢子總數(shù)×100。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理和分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離鑒定

從安徽省宣城市麻姑山林場(chǎng)采集到自然感染綠僵菌的德國(guó)小蠊僵蟲，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定，獲得一株綠僵菌菌株。該菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，14 d菌落直徑達(dá)到30～48 mm。菌落絨毛狀或絮狀，最初白色，產(chǎn)孢時(shí)暗綠色，培養(yǎng)至6 d左右開始產(chǎn)孢。邊緣規(guī)則平整，背面黃色。菌絲有隔、透明、光滑，直徑1.5～3.2 μm。分生孢子梗上多2～3個(gè)瓶梗，瓶梗柱形，（8.8～20.1×1.5～3.4）μm。分生孢子單細(xì)胞，柱狀兩端略尖，（4.5～9.5）×（1.9～3.4）μm。單個(gè)孢子近無(wú)色，成堆時(shí)暗綠色，一般在瓶梗上向基性排列成分生孢子鏈。依據(jù)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征和分生孢子的大小，初步鑒定為貴州綠僵菌Metarhizium guizhouense（圖1）。

圖1 貴州綠僵菌形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of Metarhizium guizhouense

綠僵菌的EF-1α基因可有效區(qū)別金龜子綠僵菌類群中的隱含種，所以我們測(cè)定該菌株EF-1α序列。從基于EF-1α基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，從自然感病德國(guó)小蠊分離得到的菌株RCEF6416與模式貴州綠僵菌M. guizhouense菌株（CBS258.90）為同一分支，支持率較高（圖2）。且在GenBank的序列比對(duì)結(jié)果，也是和貴州綠僵菌ARSEF6238及其模式M. guizhouense相似度最高，分別達(dá)到100%和99.5%。結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，可以確認(rèn)德國(guó)小蠊感染菌株為貴州綠僵菌。

圖2 基于EF-1α基因序列構(gòu)建的貴州綠僵菌及相近種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on EF-1α gene sequences of Metarhizium guizhouense and related fungi

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株RCEF6416生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量的影響

菌株RCEF6416在不同的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)速度區(qū)別明顯，在PPDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較快，明顯快于其他培養(yǎng)基。在PDA、SDAY和SMAY的平均日增量相似，分別為4.40 mm/d、4.43 mm/d和4.34 mm/d；菌株在Czapek培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度最慢，平均日增量?jī)H為3.56 mm/d。在SDAY和SMAY培養(yǎng)基上，初期的生長(zhǎng)速度快于后期，菌落生長(zhǎng)速度存在一個(gè)明顯的減速期，其他培養(yǎng)基上的速度相對(duì)均勻。菌株RCEF6416在5種培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量差異較大，PDA上的平均產(chǎn)孢量最大為5.1×107孢子/cm2，PPDA次之為1.7×107孢子/cm2，Czapek培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小為1.6×105孢子/cm2（表1）。

表1 貴州綠僵菌RCEF6416在不同培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng)情況Table 1 Growth of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 under the different culture media

5種不同的培養(yǎng)基上菌落顏色、形狀有較大區(qū)別，PDA與PPDA菌落顏色呈墨綠色，由內(nèi)向外菌落顏色逐漸變淡，最外圍為白色菌絲；SDAY與SMAY的菌落形態(tài)比較類似，兩者顏色均為墨綠、黃色與白色交替出現(xiàn)，外圍白色菌絲圈較??；SDAY上的產(chǎn)孢量略大于SMAY培養(yǎng)基，所以顏色較深；Czapek培養(yǎng)基上菌落中心為白色，向外依次為墨綠、黃色、白色菌絲，形成一個(gè)同心圓（圖3）。

圖3 貴州綠僵菌RCEF6416在不同培養(yǎng)基條件下的菌落特征Fig. 3 Colony morphology of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different culture media

2.3 不同鹽濃度脅迫對(duì)菌株RCEF6416生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量的影響

本組試驗(yàn)設(shè)NaCl濃度為0的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照組，對(duì)照組菌落直徑日增量3.46 mm/d。當(dāng)鹽濃度在一定范圍內(nèi)慢慢升高，菌落直徑日增長(zhǎng)速度也不斷增加，在NaCl濃度達(dá)到0.20 mol/L時(shí)直徑日增長(zhǎng)速度達(dá)到最大，為5.24 mm/d，相對(duì)增速（與鹽濃度為0的PDA相比）為51.4%；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.25 mol/L時(shí)，菌落直徑日增量呈下降趨勢(shì)，為5.18 mm/d。

NaCl濃度為0時(shí)的產(chǎn)孢量最大，為4.5×107孢子/cm2，這與不同培養(yǎng)基上菌株產(chǎn)孢量試驗(yàn)中PDA上的結(jié)果基本一致。在NaCl濃度為0.15的培養(yǎng)基上有一定的上升趨勢(shì)，但隨著鹽濃度的增加，產(chǎn)孢量下降趨勢(shì)明顯（表2）。

表2 貴州綠僵菌RCEF6416在不同NaCl濃度下的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different NaCl concentration

隨著NaCl濃度的上升，菌落的直徑逐漸增大，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.20 mol/L時(shí)最大，NaCl濃度為0.25 mol/L時(shí)略有下降。在不同鹽濃度下，菌落的顏色存在變化：NaCl濃度為0時(shí)，菌落中心有黃色氣生菌絲產(chǎn)生，菌落墨綠色，由內(nèi)向外逐漸變淡，最外圍是白色菌絲體；NaCl濃度為0.10 mol/L時(shí)，菌落的顏色較第一組淺；NaCl濃度為0.15 mol/L時(shí)，菌落顏色變化特殊，在外圍過(guò)渡到白色菌絲時(shí)有一條顏色加深的環(huán)形區(qū)，這一區(qū)域的產(chǎn)孢量較大；NaCl濃度為0.20 mol/L時(shí)，菌落特征與第2組相似，但產(chǎn)孢區(qū)更小，白色菌絲區(qū)更大；NaCl濃度為0.25 mol/L時(shí)，菌落顏色最淺，產(chǎn)孢量最小，可以看到明顯的菌絲延伸（圖4）。

圖4 貴州綠僵菌RCEF6416菌株在不同鹽濃度下的菌落特征Fig. 4 Colony morphology of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different salt concentration

2.4 不同pH對(duì)菌株RCEF6416生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量的影響

在微酸或微堿環(huán)境培養(yǎng)基上，菌株的生長(zhǎng)速度都會(huì)有所加快，在pH為7的培養(yǎng)基上，菌落直徑日增量最小，為3.37 mm/d；在pH為8的培養(yǎng)基上，菌落直徑日增量最大，為4.99 mm/d；當(dāng)pH為9時(shí)，菌落直徑日增量再次下降，為4.32 mm/d。從表3的數(shù)據(jù)可知，pH為8時(shí)產(chǎn)孢量最大，為4.3×107孢子/cm2，幾乎是pH為7時(shí)（2.1×107孢子/cm2）的兩倍。pH為6和pH為9的產(chǎn)孢量數(shù)值接近，因此可知將培養(yǎng)基調(diào)成微堿，可提升菌落的產(chǎn)孢量（表3）。

表3 貴州綠僵菌RCEF6416在不同pH下的生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different pH value

pH中性或偏酸時(shí)培養(yǎng)基孢子分布不均勻，培養(yǎng)基呈現(xiàn)的顏色比較雜亂；而在培養(yǎng)基成堿性時(shí)，中心處氣生菌絲增多，變成黃色，培養(yǎng)基上孢子分布較為均勻，由內(nèi)向外產(chǎn)孢量降低的速率很明顯，菌落呈多個(gè)同心圓式分布（圖5）。

圖5 貴州綠僵菌RCEF6416菌株在不同pH培養(yǎng)基條件下的菌落特征Fig. 5 Colony morphology of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416 on the different pH medium

2.5 高溫脅迫對(duì)孢子萌發(fā)率的影響

本組試驗(yàn)每處理3次重復(fù)，每重復(fù)顯微鏡下觀察300個(gè)孢子，以菌絲長(zhǎng)度超過(guò)孢子長(zhǎng)度1/2為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算孢子萌發(fā)率。以 25 ℃水?。ǔ兀┨幚硐骆咦訛閷?duì)照組，對(duì)照組的孢子萌發(fā)率在不同時(shí)間段均約為95.2%。處理溫度越高，孢子萌發(fā)率越低，同一溫度水浴時(shí)間越長(zhǎng)孢子萌發(fā)率越低。35 ℃處理4 h后孢子萌芽率為65.6%；40 ℃時(shí)15 min水浴處理孢子萌發(fā)率為64.3%，而處理4 h后孢子萌發(fā)率只有11.2%；45 ℃水浴處理孢子萌發(fā)率下降最快，處理15 min和處理4 h孢子萌發(fā)率分別為23.5%和2.6%（圖6）。

圖6 高溫脅迫對(duì)貴州綠僵菌RCEF6416孢子萌發(fā)率的影響Fig. 6 High temperature stress on spore germination rate of Metarhizium guizhouense strain RCEF6416

3 討論

綠僵菌屬真菌寄主廣泛，已被用于防治多種農(nóng)林害蟲[21-23]。該屬的分類地位經(jīng)過(guò)多年的研究已趨于完善，但僅從形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定綠僵菌菌種還存在一定困難，結(jié)合分子生物方法可對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。Bischoff等[24,25]分析了EF-1α、RPB1、RPB2和β-tubulin共4個(gè)核基因序列，并結(jié)合部分菌株產(chǎn)孢形態(tài)學(xué)特征，獲得了更合理的綠僵菌分類系統(tǒng)，且得到了同行研究者的普遍認(rèn)可。本研究從德國(guó)小蠊僵蟲體壁分離出的綠僵菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征和EF-1α基因序列的比較及與相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹建立，確定德國(guó)小蠊的分離菌株為貴州綠僵菌。

研究表明，同一種綠僵菌不同來(lái)源的菌株，其生物學(xué)特性和致病力都存在明顯差異[26,27]。因此，一種生防菌株在生產(chǎn)應(yīng)用前，系統(tǒng)掌握其生物學(xué)特性具有重要意義[20]。本試驗(yàn)研究了分離自德國(guó)小蠊的貴州綠僵菌RCEF6416在培養(yǎng)基PDA、PPDA、SDAY、SMAY和Czapek上的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)孢能力。研究發(fā)現(xiàn)在PPDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較快，但在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大?？梢?，營(yíng)養(yǎng)成分在菌株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，只有豐富而且合適的營(yíng)養(yǎng)條件才有利于菌絲生長(zhǎng)以及大量產(chǎn)孢[17]。另外，不同鹽濃度、不同 pH以及不同高溫處理也是影響綠僵菌生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著鹽濃度增加菌落直徑日增量不斷增加，但是產(chǎn)孢量逐漸下降，且菌落逐漸產(chǎn)生較大的白色菌絲圈。當(dāng)pH為8時(shí)，菌株生長(zhǎng)速度最快，產(chǎn)孢量最大，這一結(jié)果與于永浩等[29]、劉思雨等[17]研究金龜子綠僵菌的最適pH為7差異較大。這可能是不同綠僵菌菌株、不同菌株對(duì)酸堿環(huán)境適應(yīng)性不同。而在研究不同高溫水浴對(duì)該菌株孢子萌發(fā)率影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水浴溫度為45 ℃處理4 h后，其孢子萌發(fā)率僅為2.6%。可見，高溫對(duì)貴州綠僵菌孢子活力影響很大，因此在儲(chǔ)運(yùn)貴州綠僵菌孢子時(shí)一定要避免高溫。

利用貴州綠僵菌防治農(nóng)林業(yè)害蟲的研究還不多見，更未見利用該菌防治衛(wèi)生害蟲的相關(guān)報(bào)道。本研究中分離得到的貴州綠僵菌RCEF6416分離自德國(guó)小蠊，在人工培養(yǎng)條件下，可快速生長(zhǎng)并能大量產(chǎn)孢，因此對(duì)衛(wèi)生害蟲德國(guó)小蠊的生防制劑的開發(fā)具有良好潛力。本試驗(yàn)尚未開展該菌株對(duì)德國(guó)小蠊的侵染致病能力的研究，下一步將深入研究其致病性，為該菌株的開發(fā)利用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。