薛 匯，高雪珂，常國鳳，崔金杰*，陳利珍

（1. 華中農業(yè)大學植物科學技術學院，武漢 430070；2. 中國農業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，安陽 455000）

棉蚜Aphis gossypiiGlover是一種廣泛分布于世界各國的常見害蟲[1]。棉蚜是刺吸式口器，大量棉蚜若蟲和成蟲集中在棉葉背面和幼莖上吸食寄主植物汁液，造成葉片卷縮畸形，植株矮小，甚至幼苗枯死[2]。此外，棉蚜分泌的蜜露會造成棉花葉片的煤污病，影響光合作用，棉蚜還能傳播多種植物病毒，降低作物的產量和品質[3]，嚴重危害棉花的生產[4]。蚜繭蜂是蚜蟲的寄生性天敵昆蟲的主要類群，可有效控制棉蚜的發(fā)生[5]，其中，廣雙瘤蚜繭蜂是棉花蚜繭蜂的優(yōu)勢種群[6]。

寄生蜂和寄主之間有著復雜的制約關系，寄生蜂能夠通過化學物質或者氣味準確定位寄主位置[7]。寄生形式分為內寄生和外寄生兩種，寄生蜂幼蟲取食寄主體表或取食寄主體內組織，通常情況下，寄生蜂幼蟲前期主要取食寄主血淋巴，后期直接取食寄主脂肪體[8,9]。幼蟲隨著寄主的生長發(fā)育，并最終導致寄主死亡[10]。動物以脂肪的形式儲存能量的能力是生存和繁殖所必需的[11-13]，絕大多數(shù)的寄生蜂缺乏脂質合成的能力[14]。

寄生蜂為滿足自身對脂質的需求，對寄主的生理生化進行調節(jié)，如生殖、代謝、生物合成等，會造成寄主體內脂質大量積累，包括全身脂質含量的增加[15]，脂肪體三?；视痛x的增強[8,16]以及血淋巴中游離脂肪酸水平的升高等[8,9]。1974年發(fā)現(xiàn)寄生蜂調節(jié)寄主脂肪酸組成[17]，2004年報道寄生蜂體內的脂肪酸構成高度相似于蚜蟲體內的脂肪酸[18]，Visser和 Ellers[19]推斷，寄生蜂缺乏與脂肪酸合成相關的酶系，通過調節(jié)寄主脂肪酸合成來完成自身的生物合成代謝。寄生蜂還可以通過調節(jié)寄主體內激素滴度來調節(jié)寄主的攝食習慣和生長[7,20]，目前已發(fā)現(xiàn)寄生物能夠引起宿主內、外寄生蜂體內氨基酸、蛋白質、丙酮酸和碳水化合物數(shù)量的變化[21-25]。同時通過破壞蚜蟲的免疫系統(tǒng)和改變蚜蟲的營養(yǎng)流向來達到改造的目的，使幼蟲更好地發(fā)育[7,26]。

目前廣雙瘤蚜繭蜂對棉蚜脂質合成調控的報道較少，本試驗采用熒光定量PCR技術，檢測了被寄生3 d棉蚜和未被寄生棉蚜脂肪酸合成通路、甘油酯合成通路、糖酵解以及氨基酸代謝通路中的關鍵基因，明確被寄生棉蚜脂質合成相關基因的表達變化，對更好地了解廣雙瘤蚜繭蜂影響棉蚜脂質合成機制及棉蚜的生物防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試植株

試驗所用的棉花品種為中棉所49，由中國農業(yè)科學院棉花研究所棉花種質資源中期庫提供，棉花種植于人工氣候室（26±1）℃，光周期14L:10D，RH（75±5）%。

1.2 供試昆蟲

所用棉蚜為實驗室繼代飼養(yǎng)的孤雌繁殖的單個種群棉蚜，飼養(yǎng)條件為（26±1）℃，RH（65±5）%，光周期14L:10D。廣雙瘤蚜繭蜂采自中國農業(yè)科學院棉花研究所試驗農場（安陽縣），并于（26±1）℃，RH（65±5）%，光周期14L:10D人工智能光照培養(yǎng)箱內飼養(yǎng)。

1.3 寄生棉蚜的獲取

將2齡若蚜接入含有棉花葉片的培養(yǎng)皿中，然后接入寄生蜂，觀察寄生蜂的寄生行為，寄生蜂寄生棉蚜后立即將被寄生棉蚜轉入新鮮棉花葉片上飼養(yǎng)3 d，光照培養(yǎng)箱飼養(yǎng)條件為 （26±1）℃，RH（65±5）%，光周期14L:10D。被寄生3 d的棉蚜進行解剖，取出寄生蜂幼蟲，收集被寄生的棉蚜樣品，同時未被寄生的棉蚜也進行相同的解剖操作。試驗組和對照組各設置3個生物學重復，每個生物學重復20頭棉蚜。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

使用 TRIZOL試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）從被寄生的棉蚜和未被寄生的蚜蟲中提取總RNA，操作方法參照廠商說明。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并使用Nano-Drop 2000（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）檢測RNA的濃度及純度。cDNA的合成利用500 ng上述RNA通過PrimeScriptfi RT Reagent Kit（Takara，Dalian，China）參照試劑盒的步驟進行合成。

1.5 實時熒光定量技術的基因表達量驗證

實時熒光定量檢測使用Mastercycler ep realplex（Eppendorf，Hamburg，Germany）進行，基因特異性引物利用BEACON DESIGNER 7.6（PREMIER Biosoft International，CA，USA）設計并通過上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1，內參基因選用二甲基腺苷轉移酶dimethyladenosine transferase（GenBank：KM507111）和肽酰-脯氨酰-順反式異構酶peptidyl-prolyl cis-trans isomerase（GenBank：KF018924）[27]，取兩種內參基因表達量的平均值進行數(shù)據(jù)分析。檢測基因表達量的反應程序為：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s和60 ℃，30 s，共40個循環(huán)。

表1 棉蚜脂質合成相關基因及引物序列Table 1 Gene and primer sequence related to lipid synthesis of Aphis gossypii

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法[28]進行分析，利用GraphPad Prism 7制作圖表，并利用IBM SPSS Statistics 20采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05被認為是差異顯著的?！?”：P＜0.05；“**”：P＜0.01；n.s.：無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 被寄生和未被寄生棉蚜糖酵解基因轉錄水平差異比較

在糖酵解途徑中，被寄生棉蚜的1,6-二磷酸果糖醛縮酶基因表達量上調了1.7倍，磷酸甘油酸激酶基因表達量上調了1.6倍。但蔗糖轉化為丙酮酸的關鍵限速酶丙酮酸激酶表達量降低了0.3倍（圖1）。

圖1 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后糖酵解通路基因的表達變化Fig. 1 Changes of glycolysis pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

2.2 被寄生和未被寄生棉蚜脂肪酸合成基因轉錄水平差異比較

圖2揭示了被寄生棉蚜和未被寄生棉蚜脂肪酸合成相關基因的表達情況。棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后，除了脂肪酸合成酶1和硬脂酰輔酶A去飽和酶1表達量沒有顯著差異外，其他基因都顯著上調。其中乙酰輔酶A羧化酶基因表達量上調了6.5倍，三磷酸腺苷（ATP） 檸檬酸裂解酶基因表達量上調了2.3倍，脂肪酸合成基因2、3表達量分別上調了6.1和3.3倍，硬脂酰輔酶A去飽和酶2表達量上調了7.8倍。

圖2 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后脂肪酸合成通路基因的表達變化Fig. 2 Changes of fatty acid synthesis pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

2.3 被寄生和未被寄生棉蚜甘油酯合成基因轉錄水平差異比較

在三酰甘油合成途徑中，棉蚜被寄生3 d后，被寄生棉蚜體內1-酰基-sn-甘油-3-磷酸?；D移酶基因表達量上調2.8倍、二酰甘油O-?；D移酶基因表達量上調3.4倍、甘油三磷酸?；D移酶基因表達量上調1.7倍、脂滴表面蛋白基因表達量上調2.6倍、三酰基甘油脂酶1和2基因表達量分別上調1.6和2.5倍（圖3）。

圖3 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后甘油酯合成通路基因的表達變化Fig. 3 Changes of glyceride synthesis pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

2.4 被寄生和未被寄生棉蚜氨基酸代謝基因轉錄水平差異比較

氨基酸是棉蚜生長發(fā)育所需的氮源[29]，我們對氨基酸轉化為檸檬酸，然后到乙酰輔酶A通路中的關鍵基因的表達量進行檢測。結果顯示被寄生棉蚜中氨基酸轉化為乙酰輔酶A通路中檸檬酸合酶基因表達量上調7.1倍，異檸檬酸脫氫酶基因表達量上調9.5倍，線粒體異檸檬酸脫氫酶β亞基基因表達量上調5.7倍，線粒體異檸檬酸脫氫酶γ亞基基因表達量上調4.1倍，線粒體蘋果酸脫氫酶基因表達量上調2.8倍。雖然胞質異檸檬酸脫氫酶基因、異檸檬酸脫氫酶α亞基基因、細胞質蘋果酸脫氫酶基因表達量在統(tǒng)計意義上變化不具顯著性，但其表達量分別上調了5.5倍、1.6倍和2.2倍（圖4）。

圖4 棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生后氨基酸代謝通路基因的表達變化Fig. 4 Changes of amino acid metabolism pathway gene expression of cotton aphid after parasitized by Binodoxys communis

3 討論

寄生蜂通常能夠引起宿主體內脂質含量的變化[16,30]，增加血淋巴中游離的脂肪酸含量，增強脂肪體中三酰甘油的代謝能力[16]。如黑頭柔繭蜂通過對宿主脂肪體內的營養(yǎng)物質精細調控來滿足自身的營養(yǎng)適應性[31]，棉蚜被棉蚜繭蜂寄生后，棉蚜體內游離的脂肪酸顯著性增加[32]，粘蟲被粘蟲姬小蜂寄生后，體內脂肪含量明顯高于未被寄生的粘蟲[16]。寄生蜂引起寄主體內脂肪代謝通路的變化多有報道，但在廣雙瘤蚜繭蜂對棉蚜脂質通路上的調控作用研究較少，本試驗采用熒光定量PCR技術，明確了被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d的棉蚜脂質合成通路相關基因的表達變化，揭示了廣雙瘤蚜繭蜂對棉蚜脂質合成通路的調控。

研究表明，棉蚜繭蜂寄生棉蚜后，被寄生的棉蚜幾乎所有的與甘油酯合成相關基因的表達量都明顯升高，其中限速酶二脂酰甘油酰基轉移酶基因表達量上調了3.2倍，脂滴表面結合蛋白基因表達量上調了5.0倍[27]，同時被棉蚜繭蜂寄生的棉蚜體內的甘油酯和甘油磷酯的含量也會增加[33]。與此研究結果一致，本研究中，棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后，與甘油三酸酯合成相關的關鍵基因的表達量多數(shù)上調，限速酶二脂酰甘油?；D移酶上調了3.4倍，脂滴表面結合蛋白基因表達量上調了2.6倍。其中，脂滴能夠儲存膽固醇和脂酰甘油，是膜形成和維持的重要物質，而且能主動參與脂肪和能量代謝[7]。脂滴表面蛋白基因可以調節(jié)脂解，促進或者抑制脂解[34]。結果表明廣雙瘤蚜繭蜂能夠激活棉蚜甘油酯合成通路，促進被寄生棉蚜中甘油酯的合成。

蔗糖是棉蚜生長發(fā)育所需的碳源，蔗糖在昆蟲體內的代謝途徑已比較明確，主要是通過糖酵解過程將蔗糖分解成葡萄糖和果糖參與到脂質合成中來。蔗糖被分解成葡萄糖和果糖，然后轉換成果糖-1,6-二磷酸，果糖-1,6-二磷酸被分解成磷酸二羥丙酮（DHAP）和甘油醛-3-磷酸（GAP），DHAP和GAP有兩種代謝途徑，一種途徑中DHAP和GAP被轉化成三酰甘油，另一種途徑就是DHAP和GAP被代謝為丙酮酸，丙酮酸能夠轉化成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A是合成脂肪酸的前提[35]。Gao等[36]在2020年的研究中指出，被棉蚜繭蜂寄生后的棉蚜糖酵解通路中關鍵基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶表達量顯著上調。本研究中，被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后的棉蚜體內1,6-二磷酸果糖醛縮酶基因表達量上調了1.7倍，磷酸甘油酸激酶基因表達量上調了1.6倍。但丙酮酸激酶表達量降低了，雖然沒達到顯著水平，丙酮酸激酶是蔗糖轉化為丙酮酸的關鍵限速酶，丙酮酸能夠轉化為合成脂肪酸的原料——乙酰輔酶A。我們推測雖然糖酵解途徑產生丙酮酸的能力減弱了，合成脂肪酸的C骨架可能來自游離的氨基酸。同時我們對氨基酸轉化為檸檬酸然后到乙酰輔酶A途徑中的相關基因的表達量進行了檢測，結果顯示被寄生棉蚜中氨基酸轉化為乙酰輔酶A通路中的基因表達量顯著上調，也暗示在被寄生棉蚜中氨基酸可能被用于作為合成脂肪酸的原料。

脂肪酸是能量的主要來源，也是細胞膜的重要組成部分[37]。Gao等[32]通過檢測被棉蚜繭蜂寄生后棉蚜的脂肪酸合成通路基因表達情況，發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶基因表達量上調了5.0倍，脂肪酸合成基因1和3分別上調6.9倍和4.1倍。本研究中，棉蚜被廣雙瘤蚜繭蜂寄生3 d后，幾乎所有與脂肪酸合成相關基因的表達量都顯著上調。寄生蜂由于缺乏與脂肪酸合成相關的酶系統(tǒng)，調控寄主脂肪酸合成通路來完成自身生長發(fā)育的需要[38]。

長期以來，寄生蜂和寄主的互作關系一直是研究的熱點。棉蚜是重要的農業(yè)害蟲，不僅為害棉花，對一些園藝作物的為害也日益加重，而蚜繭蜂作為棉蚜主要寄生蜂種類，具有較好的生防價值。本研究就廣雙瘤蚜繭蜂寄生棉蚜后，對棉蚜脂質合成通路中的脂肪酸合成途徑、氨基酸代謝途徑、甘油酸三酯合成途徑以及糖酵解途徑的影響做了初步研究，明確了被寄生棉蚜脂質合成通路相關基因的表達變化，對于揭示廣雙瘤蚜繭蜂與棉蚜之間的互作以及寄生蜂與寄主昆蟲的協(xié)同進化有重要意義，同時對開發(fā)新型棉蚜防控技術具有重要的理論實踐價值。