賴石鳳 陳 悅 彭文慧 羅 丹 羅 芳 汪保國

(廣東藥科大學(xué)，廣州 510000)

結(jié)核病是由細胞內(nèi)病原體結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起并通過呼吸道傳播的慢性傳染病，嚴(yán)重危害人類健康[1]。全球約1/3人口感染MTB，但僅有不足1/10發(fā)展為結(jié)核病[2]。遺傳學(xué)研究表明，結(jié)核發(fā)病是多基因與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。結(jié)核病與遺傳機制的作用研究中，細胞因子的基因多態(tài)性受到重視，其中調(diào)節(jié)機體細胞免疫應(yīng)答的細胞因子在機體抵抗MTB入侵過程中發(fā)揮重要作用。MTB主要引發(fā)以T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫，通過逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用在細胞內(nèi)存活和繁殖，涉及T淋巴細胞、巨噬細胞和單核細胞的相互作用及細胞因子產(chǎn)生。

IL-10具有免疫調(diào)節(jié)功能，主要抑制細胞因子產(chǎn)生和抗原呈遞作用[3-4]。IL-10基因在機體結(jié)核免疫應(yīng)答反應(yīng)中抑制樹突狀細胞和巨噬細胞清除MTB的能力，也可通過抑制抗原遞呈抑制天然免疫，從而影響結(jié)核病發(fā)生和發(fā)展[5-6]。IFN-γ主要通過誘導(dǎo)巨噬細胞殺傷作用及清除體內(nèi)MTB和提高抗原遞呈能力使MTB局限于感染灶，限制MTB的擴散參與結(jié)核病發(fā)病過程[7-8]。

課題組選取廣東地區(qū)肺結(jié)核病患者≥2例的家庭作為病例組、有血緣關(guān)系的家庭密切接觸健康者和與病例組相匹配的健康志愿者進行IFN-γ和IL-10的單核苷酸多態(tài)性與肺結(jié)核遺傳易感性研究，及因與基因交互作用研究，進一步從基因?qū)用嫣剿鹘Y(jié)核病發(fā)病原因，為肺結(jié)核病高危人群的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 病例組樣本來源于廣東省發(fā)生家庭聚集性肺結(jié)核病(≥2例)的肺結(jié)核患者，選取與病例組有血緣關(guān)系并一起生活的家庭成員，匹配與病例組無血緣關(guān)系的健康志愿者，選取與病例組居住于同一街道(村莊)、年齡差距5歲、家庭結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟狀況相似的無結(jié)核病史、無HIV史的健康居民作為對照組。肺結(jié)核患者診斷根據(jù)《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施指南》，根據(jù)X射線和臨床表現(xiàn)、痰檢陽性和MTB培養(yǎng)陽性進行診斷。排除患有HIV、癌癥、免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病和接受免疫抑制治療者。研究經(jīng)廣東藥科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20180222)，參與者知情同意。

1.1.2試劑 全血基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 所有研究對象采集靜脈血2 ml置于2%EDTA抗凝管，提取基因組，步驟參照說明書。

1.2.2PCR 采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)獲取IL-10 rs1800896和IFN-γ rs2430561基因序列，Primer 5.0軟件設(shè)計引物，序列見表1。目的基因上游、下游引物溶解、稀釋，提取基因組DNA，以其為模板進行目的基因片段PCR反應(yīng)。

表1 引物序列

1.2.3PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳 取10 μl PCR擴增產(chǎn)物和2 μl Loading Buffer，混勻，加入至溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠點樣孔中，室溫電泳1 h，UV透射儀觀察片段，記錄抽檢結(jié)果，見圖1。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用Fisherχ2或Pearsonχ2檢驗、Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗；logistic回歸進行關(guān)聯(lián)性分析；基因-基因交互作用采用MDR分析。

2 結(jié)果

2.1一般人口學(xué)特征分布情況 本研究共納入150戶家庭242例研究對象，其中肺結(jié)核多發(fā)家庭75戶，健康對照家庭75戶；肺結(jié)核患者(病例組)82例，平均年齡(41.46±16.13)歲，男性占比65.85%，女性占比34.15%；家庭密切接觸者67例(45.97%)，平均年齡(29.03±19.80)歲，男性占比41.79%，女性占比58.21%；健康志愿者93例，平均年齡(41.98±14.01)歲，男性占比46.24%，女性占比53.76%。病例組與健康對照組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與家庭密切接觸健康組年齡、性別分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2IL-10和IFN-γ基因型和等位基因頻率分布 Fisherχ2檢驗顯示，病例組分別與健康對照組、家庭密切接觸健康組相比，IL-10基因rs1800896位點基因型頻率和等位基因分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，說明IL-10基因rs1800896位點與健康對照組、家庭密切接觸健康對照組的肺結(jié)核患病風(fēng)險相關(guān)，見表2。Pearsonχ2檢驗顯示，病例組與健康對照組IFN-γ基因rs2430561位點基因型頻率和等位基因頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，但病例組與家庭密切接觸健康組IFN-γ基因rs2430561位點基因型頻率、等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.180，P=0.072)，說明IFN-γ基因rs2430561位點與健康人群患肺結(jié)核病風(fēng)險相關(guān)，見表3。

圖1 IL-10 rs1800896和IFN-γ rs2430561基因分型Fig.1 Genotyping of IL-10 rs1800896 and IFN-γ rs2430561Note:Lane M is a DNA ladder;from top to bottom is 5 000,3 000,2 000,1 000,750,500,250 and 100 bp,and brightest band is 750 bp.A.Agarose gel image showing amplified PCR product of IL-10 rs1800896.Lanes (33～36,38～39,41～48) showed an AA genotype,and Lanes (37,40) showed an AG genotype.B.Agarose gel image showing amplified PCR product of IFN-γ rs2430561.Lanes (1,4,10,16) showed AA genotype,lanes (6,12,14) expressed TT genotype,and lanes (2～3,5,7～9,11,13,15) indicates AT genotype.

2.3IL-10 rs1800896基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)及等位基因分布 IL-10 rs1800896基因型頻率在病例組、健康對照組、家庭密切接觸健康組人群中分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=2.10，P=0.159；χ2=2.61，P=0.118；χ2=0.04，P=0.855)。IL-10 rs1800896位點基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)性分析見表4。IL-10基因rs1800896位點，病例組與健康對照組相比，顯性模型(AA vs AG+GG)中AG+GG基因型可增加健康對照人群患肺結(jié)核風(fēng)險(P<0.001，OR=4.37，95%CI：1.65-11.58)；超顯性模型(AA+GG vs AG)中，AG基因型也可增加健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險(P=0.002，OR=4.27，95%CI：1.49～12.24)；共顯性模型(AA vs AG，AA vs GG)中，AG基因型可增加健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險(P=0.010，OR=4.42，95%CI：1.54～12.69)。隱性模型(AA+AG vs GG)中，未發(fā)現(xiàn)其與健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險相關(guān)。與A等位基因相比，IL-10等位基因中G等位基因可增加健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=3.96，95%CI：1.65～9.53)，而A等位基因可降低健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=0.25，95%CI：0.11～0.61)。病例組與家庭密切接觸健康組相比，顯性模型(AA vs AG+GG)中AG+GG基因型可增加家庭密切接觸者患肺結(jié)核病風(fēng)險(P=0.002，OR=6.43，95%CI：1.81～22.83)，超顯性模型(AA+AG vs AG)中，AG基因型可增加家庭密切接觸者患肺結(jié)核病風(fēng)險(P<0.001，OR=5.17，95%CI：1.44～18.60)，共顯性模型(AA vs GG，AA vs GG)中，AG基因型可增加家庭密切接觸者患肺結(jié)核病風(fēng)險(P<0.001，OR=5.42，95%CI：1.50～19.51)。家庭密切接觸健康組IL-10基因rs1800896位點上攜帶的G等位基因可增加家庭密切接觸者患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=6.77，95%CI：1.98～23.13)，而A等位基因可降低家庭密切接觸者患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=0.15，95%CI：0.04～0.51)。

表2 各組IL-10基因型和等位基因頻率分布[個(%)]

表3 各組IFN-γ基因型和等位基因頻率分布[個(%)]

表4 IL-10基因rs1800896位點基因型及等位基因分布[個(%)]

2.4IFN-γ基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)分析 IFN-γ rs2430561位點基因型頻率在病例組、健康對照組中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=2.29，P=0.134；χ2=2.99，P=0.082)。但IFN-γ rs2430561位點基因型頻率在家庭密切接觸健康組不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=7.89，P<0.001)。IFN-γ rs2430561位點的基因多態(tài)性中，病例組與健康對照組相比，顯性模型(TT vs AT+AA)中AT+AA基因型可增加健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=5.07，95%CI：2.58～9.94)；隱性模型(TT+AT vs AA)中，AA基因型可增加健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=5.31，95%CI：2.41～11.73)，共顯性模型(TT vs AT，TT vs AA)中，AT和AA基因型均可增加健康對照人群的家庭聚集性肺結(jié)核患病風(fēng)險(OR=3.43，95%CI：1.64～7.17；OR=9.98，95%CI：4.07～24.44)。與健康對照組比，IFN-γ的等位基因A和T分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而A等位基因增加健康對照人群患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=3.94,95%CI：2.51～6.17)；T等位基因可降低健康對照患肺結(jié)核病風(fēng)險(OR=0.25,95%CI：0.16～0.40)，見表5。由于肺結(jié)核組與家庭密切接觸健康組分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果未在表格中展示，可認為IFN-γ基因rs2430561位點與家庭密切接觸者人群感染患家庭聚集性肺結(jié)核風(fēng)險無相關(guān)性。

2.5結(jié)核病組與健康對照組中單倍體與結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)性分析 如表6所示，IL-10 rs1800896和IFN-γrs2430561 2個位點間的連鎖不平衡(LD)程度分析結(jié)果顯示，兩組在rs1800896和rs2430561 2個位點間存在較弱的連鎖不平衡，D′值為0.39。單倍體分析結(jié)果顯示，rs1800896和rs2430561 2個位點組成的AA、AT、GA、GT共4種單倍體，為避免增加偏差，兩組中分布頻率小于1%的單倍體不納入分析，AA、GA、GT的頻率分布在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與AT單倍體相比，AA單倍體肺結(jié)核病患病風(fēng)險為3.22倍，GA單倍體肺結(jié)核病患病風(fēng)險為3.65倍。

表5 IFN-γ s2430561位點基因型及等位基因分布[個(%)]

表6 單倍體頻率與肺結(jié)核發(fā)病風(fēng)險[個(%)]

圖2 IFN-γ和IL-10高風(fēng)險和低風(fēng)險基因型在結(jié)核病者和健康對照者中的分布Fig.2 Distribution of high-risk and low-risk genotypes of IFN-γ and IL-10 in tuberculosis and healthy controlsNote:SNP1 is rs1800896,0-AA,1-AG,2-GG of IL-10;SNP3 is rs2430561,0-AA,1-AT,2-TT of IFN-γ.Black squares represent a high-risk combination of genotypes;light shaded boxes indicate low-risk combinations;white boxes indicate unclassified data.Bar chart represents patient (left) and healthy control (right).

2.6在結(jié)核病組與健康對照組人群IFN-γ和IL-10基因的MDR分析 IL-10和IFN-γ基因在結(jié)核病組與健康對照組交互作用采用MDR分析，結(jié)果表明，單基因作用的IFN-γ基因rs2430561位點、兩基因作用IFN-γ基因rs2430561位點和IL-10基因rs1800896位點均獲得最佳模型，其中交叉驗證一致性均為10/10(P<0.001)。IFN-γ的AA和AT基因型是高風(fēng)險基因型；TT基因型為低風(fēng)險，IFN-γ rs2430561位點和IL-10基因rs1800896位點的2個基因相互作用顯示IFN-γ的AA基因型與IL-10的AA基因型、IFN-γ的TT基因型與IL-10的AG基因型處于高風(fēng)險。IL-10的AA基因型與IFN-γ的TT、AT基因型組合，IL-10的AG基因型與IFN-γ的AA、AT基因型組合均處于低風(fēng)險(圖2)。

3 討論

病原體與宿主的相互作用決定了感染的發(fā)生發(fā)展。宿主遺傳信息在疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起重要作用，個體遺傳差異可導(dǎo)致對疾病的易感性不同。宿主遺傳因素和免疫應(yīng)答在機體抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。

本研究在IL-10基因rs1800896位點對比家庭聚集肺結(jié)核病例組與健康對照組比較發(fā)現(xiàn)，IL-10基因攜帶的AG+GG基因型可增加健康人群患肺結(jié)核病風(fēng)險，與哥倫比亞、國內(nèi)等研究結(jié)果類似[9-10]；健康對照人群中攜帶G等位基因呈高風(fēng)險，攜帶A等位基因與患病風(fēng)險呈負相關(guān)，說明攜帶G等位基因患病風(fēng)險更高，與既往研究結(jié)論一致[11-12]。IL-10基因rs1800896位點上，家庭聚集肺結(jié)核病例組與家庭接觸健康者人群相比，AG+GG基因型增加家庭密切接觸者患肺結(jié)核病風(fēng)險，結(jié)果與印度的一項結(jié)核家庭密切接觸者研究結(jié)論一致[13]；研究發(fā)現(xiàn)AG基因型患肺結(jié)核病風(fēng)險是AA基因型的5.42倍，與一項結(jié)核患者及家庭密切接觸者的研究結(jié)果相似[12]。提示可能由于IL-10基因rs1800896位點基因突變，IL-10異常表達導(dǎo)致家庭聚集性肺結(jié)核。

在機體抗結(jié)核的保護性免疫應(yīng)答中，CD4+Th細胞分泌的IFN-γ是重要的抗結(jié)核免疫因子。在IFN-γ rs2430561位點中，家庭聚集性肺結(jié)核病例組與健康對照人群相比，AT、AA基因型、等位基因A、基因型AT+AA均可增加一般健康人群肺結(jié)核感染風(fēng)險,與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)論相似[14-15]。由于家庭聚集性肺結(jié)核病例組與家庭密切接觸健康對照組分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明IFN-γ rs2430561位點基因變異與健康人群患肺結(jié)核有關(guān)，但與家庭密切接觸者人群患肺結(jié)核風(fēng)險無關(guān)。

單倍體分析發(fā)現(xiàn)，rs1800896和rs2430561 2個位點間存在較弱的連鎖不平衡，其中單倍型AA、GA是結(jié)核發(fā)生的危險因素，單倍型TA可降低結(jié)核發(fā)生風(fēng)險。

宿主對抗結(jié)核病的機制是多基因的，研究已證明幾種細胞因子SNPs對疾病嚴(yán)重程度的綜合作用[13,16]。IFN-γ的AA基因型與IL-10的AA基因型、IFN-γ的TT基因型與IL-10的AG基因型處于高風(fēng)險，表明此基因型組合對結(jié)核病起協(xié)同作用。由于樣本采集病例組、家庭密切接觸健康者選自肺結(jié)核病多發(fā)家庭，并排除糖尿病、高血壓、HIV和其他疾病，符合條件人數(shù)較少，需擴大一樣進一步研究，今后關(guān)于結(jié)核病聚集性家系與基因多態(tài)性的研究仍需擴大候選基因。