李會榮 鐘 秀 王江川 夏峻巍 程德云

(成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸科，成都 610100)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC組織學亞型包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌，約占肺癌患者比例的85%～90%，嚴重威脅人類健康[1-2]。由于缺乏有效的檢測手段，NSCLC大部分患者錯過最佳手術(shù)治療期而進入NSCLC晚期，且5年內(nèi)生存率僅為15%[3]。目前，分子靶向藥物治療是晚期癌癥的主要治療手段之一[4]。近年來，隨著對miRNA 研究的深入，發(fā)現(xiàn)miRNA作為腫瘤抑制因子或癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是癌癥研究領(lǐng)域的熱點[5]。miRNA-140-5p是miRNA中的重要一員，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA-140-5p在多種腫瘤中發(fā)揮抑制作用。WANG等[6]發(fā)現(xiàn)，miRNA-140-5p通過靶向抑制TGFBR1基因表達減輕腎母細胞瘤的侵襲性。人Wnt基因定位于染色體12q13，參與調(diào)控細胞增殖分化、細胞極性、細胞遷移等，并與人類多個系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)[7]。有相關(guān)研究顯示，miRNA-140-5p通過靶向Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt1來抑制胃癌中的細胞增殖和侵襲[8]。因此推測miR-140-5p可通過靶向Wnt1基因抑制NSCLC的遷移與侵襲。本研究旨在通過探究miR-140-5p與Wnt1基因的靶向關(guān)系及其對NSCLC的影響，為臨床對NSCLC的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人NSCLC A549細胞株購自中國科學院上海細胞庫；20組NSCLC 腫瘤組織及癌旁組織來自承德市中心醫(yī)院。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；TRIzol Reagent購自Ambion 公司；TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine?2000試劑購自美國Invitrogen公司；Matrigel膠和Transwell小室均購自Corning公司；RIPA裂解液購自碧云天公司；本研究所用抗體均購自CST公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；數(shù)碼倒置顯微鏡購自海長方光學儀器公司；PCR儀器、垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將人NSCLC A549細胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃條件下進行培養(yǎng)，2 d換液1次，細胞長滿后傳代培養(yǎng)。待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后再取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)試驗。

1.2.2RT-PCR檢測 消化A549細胞，收集各組細胞以1×106個/管置于1.5 ml離心管，PBS清洗細胞，1 000 r/min離心 5 min，收集細胞沉淀，各離心管加入500 μl預冷TRIzol，通過TRIzol法提取各組細胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。引物序列如下：miR-140-5p，F(xiàn)：5′-TGTGTCTCTCTCTGTGTCCTG-3′；R：5′-GGTATCCTGTCCGTGGTTCTA-3′；Wnt1，F(xiàn)：5′-CAACCGAGGCTGTCGAGAAA-3′，R：5′-GGCCGAAGTCAATGTTGTC-G-3′；GAPDH，F(xiàn)：5′-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3′，R：5′-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′。 反應程序為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個循環(huán)，每個樣品設置3個復孔，通過2-ΔΔCt法對PCR結(jié)果進行相對定量分析。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染與分組 將A549細胞分為對照組、miR-140-5p組(miR-140-5p過表達)、Wnt1組(Wnt1過表達)和mimic+Wnt1組(共轉(zhuǎn)染)，并按分組情況分別將miR-140-5p mimic和Lv-Wnt1轉(zhuǎn)染至A549細胞。將A549細胞以1×105個/孔培養(yǎng)于6孔板，待其生長密度達到50%時按試劑盒說明轉(zhuǎn)染，48 h后用于后續(xù)試驗。

1.2.4Transwell檢測細胞侵襲 將對數(shù)生長期的A549細胞以1×105個/ml接種于200 μl鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，下室加入600 μl 含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室未穿膜細胞，甲醇固定15 min，Giemsa染色20 min，鏡下觀察結(jié)果并計數(shù)，重復3次取均值。

1.2.5細胞劃痕試驗 將轉(zhuǎn)染后各組A549細胞培養(yǎng)于12孔板，待生長至融合后換液，以20 μl無菌Tips槍頭畫直線，24 h后在顯微鏡下觀察修復情況。劃痕愈合率=(即刻劃痕面積-24 h后劃痕面積)/即刻劃痕面積×100%。各組重復測量3次，取平均值。

1.2.6Western blot檢測 使用含有PMSF的RIPA裂解液裂解細胞并提取總蛋白，加入5×loading buffer并經(jīng)沸水加熱變性5 min，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗脫后加入一抗并于4℃冰箱孵育過夜，洗脫一抗后加入對應二抗孵育2 h，PBST洗脫后，加入BCL曝光。

1.2.7熒光素酶報告基因檢測 應用生物信息學軟件Targetscan數(shù)據(jù)庫預測miR-140-5p與Wnt1的靶向關(guān)系。構(gòu)建Wnt1野生型(WT)和突變型(MUT)pGL3-熒光素酶報告載體。將細胞分為WT-Wnt1+miR-140-5p mimic組、WT-Wnt1+miR-140-5p NC組、MUT-Wnt1+miR-140-5p mimic組和MUT-Wnt1+miR-140-5p NC組，將WT-Wnt1 WT、MUT-Wnt1載體分別與miR-140-5p mimic、miR-140-5p NC共轉(zhuǎn)染至A549細胞，48 h后通過熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1NSCLC組織中miR-140-5p與Wnt1基因表達量呈負相關(guān) RT-PCR結(jié)果表明，與癌旁組織相比，NSCLC組織中miR-140-5p表達顯著降低(P<0.01，圖1A)，而Wnt1基因表達顯著升高(P<0.01，圖1B)。此外，miR-140-5p表達水平與Wnt1基因表達水平呈負相關(guān)(r=-0.901,P<0.001，圖1C)。

2.2驗證miR-140-5p過表達 與對照組相比，mimic-NC組中miR-140-5p 表達無顯著變化，而miR-140-5p mimic組中miR-140-5p 表達顯著升高(P<0.01，圖2A)。與對照組相比，mimic-NC組中Wnt1基因表達無顯著變化，而miR-140-5p mimic組中Wnt1基因表達顯著降低(P<0.01，圖2B)。提示miR-140-5p過表達成功。

圖1 miR-140-5p和Wnt1基因的表達情況及相關(guān)性Fig.1 Expression and correlation of miR-140-5p and Wnt1 genesNote:**.P<0.01 compared with adjacent tissues group.

2.3miR-140-5p過表達抑制Wnt1基因的表達 與對照組相比，miR-140-5p mimic組中Wnt1基因在RNA和蛋白質(zhì)水平表達均顯著下降(P<0.01)；在Wnt1組中，Wnt1基因在RNA和蛋白質(zhì)水平表達均顯著升高(P<0.01)。與Wnt1組相比，mimic+Wnt1組中Wnt1基因在RNA和蛋白質(zhì)水平表達均顯著降低(P<0.01)。提示miR-140-5p過表達可抑制Wnt1基因表達。見圖3。

2.4miR-140-5p過表達逆轉(zhuǎn)Wnt1誘導的A549細胞遷移能力增強 如圖4所示，劃痕24 h后，與對照組相比，miR-140-5p組中細胞劃痕閉合度顯著降低(P<0.01)，而Wnt1組中細胞劃痕閉合度顯著升高(P<0.01)。與Wnt1組相比，mimic+Wnt1組中細胞劃痕閉合度顯著降低(P<0.01)。提示miR-140-5p可抑制A549細胞遷移，Wnt1過表可促進A549細胞遷移，miR-140-5p過表達可逆轉(zhuǎn)Wnt1過表達對A549細胞遷移能力的促進作用。

2.5miR-140-5p過表達逆轉(zhuǎn)Wnt1誘導的A549細胞侵襲能力增強 如圖5所示，與對照組相比，miR-140-5p組中細胞侵襲數(shù)量顯著減少，Wnt1組中細胞侵襲數(shù)量顯著增多(P<0.01)。而與Wnt1組相比，mimic+Wnt1組中細胞侵襲數(shù)量顯著減少(P<0.01)。

圖2 RT-PCR檢測miR-140-5p過表達Fig.2 RT-PCR detection of miR-140-5p overexpression.Note:**.P<0.01 compared with control group.

圖3 RT-PCR和Western blot檢測各組細胞中Wnt1基因的表達Fig.3 RT-PCR and Western blot detection of Wnt1 gene expression in each group of cellsNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01 compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

圖4 劃痕試驗檢測各組細胞遷移能力Fig.4 Scratch test to detect cell migration ability of each groupNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01 compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

圖5 Transwell法檢測各組細胞的侵襲能力Fig.5 Transwell method to detect invasive ability of each group of cellsNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01，compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

提示miR-140-5p可抑制A549細胞侵襲，Wnt1過表可促進A549細胞侵襲，miR-140-5p過表達可逆轉(zhuǎn)Wnt1過表達對A549細胞侵襲能力的促進作用。

2.6miR-140-5p過表達逆轉(zhuǎn)Wnt1誘導的侵襲相關(guān)蛋白表達增加 與對照組相比，miR-140-5p組中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表達顯著降低(P<0.01)，Wnt1組中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表達顯著升高(P<0.01)。與Wnt1組相比，mimic+Wnt1組中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表達顯著降低(P<0.01)。提示miR-140-5p過表達可逆轉(zhuǎn)Wnt1過表達誘導的A549細胞中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表達增加。見圖6。

圖6 Western blot檢測MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表達水平Fig.6 Western blot detection of MMP2,MMP9 and β-catenin protein expression levelsNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01 compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

圖7 熒光素酶報告檢測miR-140-5p與Wnt1基因的靶向關(guān)系Fig.7 Luciferase report to detect targeting relationship between miR-140-5p and Wnt1 geneNote:**.P<0.01 compared with Wnt1 WT+miR-140-5p NC group.

2.7miR-140-5p靶向抑制Wnt1基因 如圖7所示，Wnt1基因序列上存在miR-140-5p的靶向結(jié)合位點。此外，與WT-Wnt1+miR-140-5p NC組相比，WT-Wnt1+miR-140-5p mimic組中熒光強度顯著降低(P<0.01)，MUT-Wnt1+miR-140-5p mimic組、MUT-Wnt1+miR-140-5p NC組中熒光強度無顯著變化。提示miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因表達。

3 討論

在初診時多數(shù)患者已錯失手術(shù)時機，因此放化療、靶向治療及免疫治療等成為了晚期肺癌的主要治療手段，但生存率并不理想[9]。相對于化療藥物，靶向藥物治療不良反應輕、給藥便利，已經(jīng)成為臨床上晚期NSCLC治療的重要手段[10]。miRNA-140-5p是miRNA中的重要一員，其在腫瘤中發(fā)揮抑制作用，可減輕癌細胞的侵襲能力[11]。研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中miRNA-140-5p表達量較低[12]。人Wnt基因定位于染色體12q13，參與調(diào)控細胞增殖分化、細胞極性、細胞遷移等，并與人類腫瘤密切相關(guān)[7]。有研究表明，Wnt1基因在NSCLC組織中過表達，促進NSCLC的腫瘤進展[13]。同樣地，當miRNA-140-5p過表達時，TGFBR1和IGF-1基因表達降低[14]。與既往研究結(jié)果相似，本實驗結(jié)果顯示，在NSCLC組織中，miR-140-5p與Wnt1基因表達呈負相關(guān)，且miR-140-5p過表達會使Wnt1基因表達水平降低，表明在NSCLC上，miR-140-5p可通過調(diào)節(jié)Wnt1水平而發(fā)揮作用。

miR-140-5p過表達降低了惡性NSCLC細胞的遷移和侵襲特性[15]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p通過靶向VEGFA調(diào)節(jié)NSCLC細胞的遷移和侵襲[11]。Wnt信號通路的激活可增強NSCLC治療中對順鉑、多西紫杉醇和放射療法的抗性，且Wnt抑制劑可抑制NSCLC 細胞系增殖[16]。Wnt1基因可促進癌細胞的遷移和侵襲[17]。相關(guān)研究顯示，miRNA-140-5p通過靶向Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt1抑制胃癌中的細胞增殖和侵襲[8]。與既往研究結(jié)果一致，本實驗結(jié)果顯示，miR-140-5p過表達抑制Wnt1基因表達，同時逆轉(zhuǎn)Wnt1基因過表達誘導的A549細胞遷移和侵襲力增強。提示miR-140-5p可通過抑制Wnt1基因表達抑制Wnt1通路下游因子活性調(diào)控A549細胞的遷移、侵襲。

為了驗證假設，研究組進一步探究了miR-140-5p過表達對Wnt1通路下游基因表達的影響及miR-140-5p與Wnt1的靶向關(guān)系。Wnt/β-catenin 信號通路是啟動細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要通路，參與細胞遷移、侵襲和凋亡的調(diào)節(jié)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt1基因可使侵襲相關(guān)蛋白MMP2和 MMP9表達增加[19]。當Wnt/β-catenin 通路活性被抑制，MMP2、MMP7、MMP14表達水平降低[20]。ZHAO等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p過表達下調(diào)MMP2、MMP7、β-catenin蛋白表達水平。與既往結(jié)果類似，本研究結(jié)果顯示，miR-140-5p過表達可降低Wnt1誘導的MMP2、MMP9、β-catenin表達；此外miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因表達。提示miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因，進而下調(diào)MMP2、MMP9、β-catenin表達。

綜上所述，miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因表達，抑制Wnt/β-catenin通路活性，進而下調(diào)MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表達，抑制NSCLC A549細胞的遷移與侵襲。本研究初步探究了miR-140-5p靶向作用于Wnt1基因?qū)SCLC A549細胞遷移與侵襲的影響，下一步研究組將建立人NSCLC裸鼠原位種植轉(zhuǎn)移模型，進一步探究在動物模型上miR-140-5p對NSCLC的影響。