閆海清 張 平 王桂華 王昊亮 郭振方 宋景貴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，衛(wèi)輝 453100)

抑郁癥是一種以顯著而持久的情緒低落、快感缺失和行為遲緩為主要臨床特征的精神性疾病。目前，全球抑郁癥發(fā)病率約為10%，且逐年升高，并可能上升為世界第二大疾病，自殺身亡率約為15%，嚴(yán)重威脅患者身心健康和社會團(tuán)結(jié)穩(wěn)定[1-2]。慢性不可預(yù)見性溫和刺激動物抑郁癥與人類抑郁癥病因相似，是一種廣泛使用和經(jīng)過充分驗證、并得到國際認(rèn)可的抑郁癥動物造模方法[3]。研究表明，氧化應(yīng)激是抑郁癥神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)退行性改變、神經(jīng)元可塑性改變的重要原因，氧化應(yīng)激損害在抑郁癥發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[4]。抑郁癥患者糖代謝異常發(fā)生率高達(dá)36%，已有研究證明抑郁癥與糖代謝異常存在共同的神經(jīng)內(nèi)分泌基礎(chǔ)，兩者互為誘因[5-6]。抑郁癥模型中腺苷酸活化蛋白激酶α1(AMP activated protein kinaseα1，AMPKα1)表達(dá)明顯下調(diào)，但AMPKα1高表達(dá)對抑郁癥的作用及機(jī)制尚不清楚[7]。AMPKα1是細(xì)胞能量代謝的主要感受器，在維持機(jī)體能量代謝平衡中發(fā)揮重要作用，已有研究表明其與炎癥反應(yīng)、糖類代謝、脂肪分解和細(xì)胞凋亡等生命活動相關(guān)[8]。本文研究尾靜脈注射AMPKα1高表達(dá)腺病毒對抑郁癥模型大鼠線粒體損傷和代謝的調(diào)節(jié)作用，以期為抑郁癥的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 60只Wistar封閉群大鼠購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。

1.1.2試劑 AMPKα1高表達(dá)腺病毒購自上海生工；SOD、MDA和LDH試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；BCA試劑盒購自北京天根生化有限公司。

1.2方法

1.2.1分組、造模及處理 Wistar封閉群大鼠隨機(jī)分為4組：健康對照組(Control)、模型組(CUMS)、空載體組(CUMS+Ad-NC)和AMPKα1高表達(dá)組(CUMS+Ad-AMPKα1)，每組15只。除Control組外，其他各組大鼠均采用不可預(yù)見溫和應(yīng)激法建立抑郁癥模型：隨機(jī)禁食或禁水 24 h、4℃冷水游泳、晝夜顛倒24 h、夾尾1 min、50 V電擊3 min、潮濕墊料 24 h、噪音 2 h，每天隨機(jī)安排1～2種刺激，同一刺激不可連續(xù)出現(xiàn)，孤籠飼養(yǎng)28 d。CUMS+Ad-NC組尾靜脈注射腺病毒空載體，CUMS+Ad-AMPKα1組尾靜脈注射AMPKα1高表達(dá)腺病毒[9-10]。

1.2.2RT-PCR檢測mRNA表達(dá) RT-PCR提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，64℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PGC-1α F：5′-TGCCACCATCAAAGAAGC-3′； PGC-1α R：5′-TCACCAAACAGAAGCAGACT-3′； GLUT4 F：5′-CCCACAGAAGGTGATTGAACAG-3′；GLUT4 R：5′-GATGGCCAGTTGGTTGAGTG-3′。

1.2.3Western blot檢測蛋白表達(dá) 取組織加入RIPA裂解提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白含量；取30 μl 蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h ；加入對應(yīng)一抗，4℃孵育過夜；加入二抗孵育4 h，TBST液清洗；ECL顯影，以β-actin為內(nèi)參計算蛋白相對表達(dá)。

1.2.4Morris水迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 造模第22天將大鼠面向池壁放入水中，記錄動物找到水下平臺的時間，即為逃避潛伏期時間。若超過 1 min 則引導(dǎo)大鼠找到平臺。讓大鼠在平臺上停留10 s，早晚各1次，持續(xù)6 d。在應(yīng)激造模第28天撤去平臺，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠60 s 內(nèi)在原平臺所在象限停留時間，即為目標(biāo)象限記憶時間[11]。

1.2.5曠場實驗檢測大鼠自主探究行為 將大鼠放入底部有25個4 cm×4 cm的黑色曠場反應(yīng)箱，讓其自由活動1 min 后，記錄大鼠4 min內(nèi)的水平活動次數(shù)和垂直站立次數(shù)。

1.2.6HE染色檢測大鼠腦損傷情況 將組織用甲醛固定、石蠟包埋后切片；HE染色后脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.7氧化應(yīng)激檢測 將組織加入生理鹽水勻漿離心后，按SOD、MDA和 LDH試劑盒說明書分別測定SOD、MDA、和LDH含量。

2 結(jié)果

2.1AMPKα1高表達(dá)腺病毒促進(jìn)抑郁癥模型大鼠AMPKα1表達(dá) 與Control組相比，CUMS組大鼠AMPKα1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，說明抑郁癥抑制大鼠AMPKα1呈低表達(dá)；與CUMS組相比，CUMS+Ad-NC組AMPKα1 mRNA、蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義，說明空載體不影響抑郁癥大鼠AMPKα1表達(dá)；與CUMS+Ad-NC組相比，CUMS+Ad-AMPKα1組大鼠AMPKα1 mRNA、蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒可促進(jìn)抑郁癥大鼠AMPKα1表達(dá)(P<0.01，圖1A)。

2.2AMPKα1高表達(dá)腺病毒改善抑郁癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 與Control組相比，CUMS組大鼠逃避潛伏期時間顯著延長，目標(biāo)象限記憶時間顯著縮短，說明抑郁癥抑制大鼠記憶力嚴(yán)重受損；與CUMS組相比，CUMS+Ad-NC組大鼠逃避潛伏期時間和目標(biāo)象限記憶時間變化無統(tǒng)計學(xué)意義，說明空載體對抑郁癥大鼠記憶力無影響；與CUMS+Ad-NC組相比，CUMS+Ad-AMPKα1組大鼠逃避潛伏期時間顯著縮短，目標(biāo)象限記憶時間顯著增加，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒可改善抑郁癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.01，圖1B)。

2.3AMPKα1高表達(dá)腺病毒促進(jìn)抑郁癥大鼠自主探究行為 與Control組相比，CUMS組大鼠水平活動次數(shù)和垂直站立次數(shù)顯著減少，說明抑郁癥可抑制大鼠自主探究行為；與CUMS組相比，CUMS+Ad-NC組大鼠水平活動次數(shù)和垂直站立次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明空載體對抑郁癥大鼠自主探究行為無影響；與CUMS+Ad-NC組相比，CUMS+Ad-AMPKα1組大鼠水平活動次數(shù)和垂直站立次數(shù)顯著增加，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒能可促進(jìn)抑郁癥大鼠的自主探究行為(P<0.01，圖1C)。

2.4AMPKα1高表達(dá)腺病毒減輕抑郁癥大鼠腦損傷 Control組大鼠大腦海馬和前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間隙正常，排列整齊有序；CUMS組大鼠細(xì)胞排列散亂，神經(jīng)元缺失明顯，胞核染色較深，部分胞體呈空泡狀；CUMS+Ad-NC組與CUMS組組織形態(tài)相似；CUMS+Ad-AMPKα1組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞間隙縮小，損傷情況得到明顯緩解(圖2)。

2.5AMPKα1高表達(dá)腺病毒減輕抑郁癥大鼠細(xì)胞線粒體損傷 與Control組相比，CUMS組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說明抑郁癥大鼠線粒體明顯損傷；與CUMS組相比，CUMS+Ad-NC組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義，說明空載體不影響抑郁癥大鼠線粒體損傷；與CUMS+Ad-NC組相比，CUMS+Ad-AMPKα1組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒減輕抑郁癥大鼠線粒體損傷(P<0.01，圖3)。

圖1 抑郁癥大鼠AMPKα1表達(dá)、記憶力和自主探究行為Fig.1 AMPKα1 expression,memory and self-exploration behavior in rats with depressionNote:Compared with control group,**.P<0.01；compared with CUMS+Ad-NC group,##.P<0.01.

2.6AMPKα1高表達(dá)腺病毒抑制抑郁癥大鼠細(xì)胞氧化應(yīng)激 如圖4所示， 與Control組相比， CUMS組SOD含量顯著下降，LDH和MDA含量顯著上升，說明抑郁癥引起大鼠氧化應(yīng)激；與CUMS組相比，CUMS+Ad-NC組大鼠LDH、SOD和MDA含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義，說明空載體不影響抑郁癥大鼠氧化應(yīng)激；與CUMS+Ad-NC組相比，CUMS+Ad-AMPKα1組大鼠SOD含量顯著增多，LDH和MDA含量顯著減少，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒可減輕抑郁癥大鼠氧化應(yīng)激(P<0.01)。

圖2 大鼠海馬區(qū)HE染色(×200)Fig.2 HE staining of rats hippocampus(×200)

圖3 線粒體損傷程度Fig.3 Degree of mitochondrial damageNote:Compared with control group,**.P<0.01；compared with CUMS+Ad-NC group,##.P<0.01.

圖4 試劑盒檢測LDH、SOD和MDA含量Fig.4 LDH,SOD and MDA contents were detected by kitNote:Compared with control group,**.P<0.01；compared with CUMS+Ad-NC group,##.P<0.01.

圖5 各組大鼠的糖代謝檢測Fig.5 Glucose metabolism in rats of each groupNote:Compared with control group,**.P<0.01；compared with CUMS+Ad-NC group,##.P<0.01.

2.7AMPKα1高表達(dá)腺病毒增強抑郁癥大鼠細(xì)胞糖代謝 與Control組相比，CUMS組大鼠PGC-1α和GLUT4 mRNA、蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，說明抑郁癥抑制大鼠糖代謝；與CUMS組相比，CUMS+Ad-NC組大鼠PGC-1α和GLUT4 mRNA、表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義，說明空載體不影響抑郁癥大鼠糖代謝；與CUMS+Ad-NC組相比，CUMS+Ad-AMPKα1組大鼠PGC-1α和GLUT4 mRNA、蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒可增強抑郁癥大鼠糖代謝(P<0.01，圖5)。

3 討論

抑郁癥具有高患病率、高致殘率和高自殺率等特點，是由社會環(huán)境、自身遺傳、個體性格、生物化學(xué)等多種因素共同作用而產(chǎn)生的情緒低落、快感缺失、行為遲緩、學(xué)習(xí)記憶下降的精神疾病。因此，記憶能力和行為是抑郁癥評價的重要指標(biāo)之一。本研究通過Morris水迷宮實驗和曠場實驗發(fā)現(xiàn)，AMPKα1高表達(dá)腺病毒可顯著減少抑郁癥大鼠逃避潛伏期時間，顯著增加抑郁癥大鼠目標(biāo)象限記憶時間、水平活動次數(shù)和垂直站立次數(shù)，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒可改善抑郁癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并促進(jìn)抑郁癥大鼠自主探究行為。

海馬和前額葉是大腦執(zhí)行情緒和認(rèn)知的關(guān)鍵區(qū)域，海馬主要負(fù)責(zé)生物體的學(xué)習(xí)和記憶，前額葉皮質(zhì)主要負(fù)責(zé)感覺認(rèn)知、情緒調(diào)節(jié)和功能執(zhí)行[12]。SHIRAYAMA等[13]研究發(fā)現(xiàn)海馬和前額葉與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，且重度抑郁癥患者的海馬和前額葉皮質(zhì)區(qū)較健康志愿者體積明顯減小。本文通過海馬和前額葉皮質(zhì)HE染色發(fā)現(xiàn)，AMPKα1高表達(dá)腺病毒可緩解抑郁癥細(xì)胞排列散亂，神經(jīng)元缺失和胞體空泡狀等現(xiàn)象，從而緩解腦損傷。

線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的主要場所，其產(chǎn)生的能量在維持細(xì)胞正常功能中發(fā)揮重要作用，一旦線粒體受損，則會干擾細(xì)胞的正常功能[14]。CZARNY等[15]研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和低效DNA損傷修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙；GONG等[16]研究發(fā)現(xiàn)慢性輕度壓力抑制小鼠海馬、皮質(zhì)和下丘腦中線粒體呼吸，并導(dǎo)致腦中線粒體超微結(jié)構(gòu)受損，提示抑郁癥可誘導(dǎo)線粒體受損。XU等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中AMPKα1缺陷可促進(jìn)細(xì)胞增殖和線粒體損傷。因此，AMPKα1過表達(dá)有望減緩抑郁癥引起的線粒體損傷。本研究發(fā)現(xiàn)AMPKα1高表達(dá)腺病毒可顯著上調(diào)抑郁癥大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)，并顯著下調(diào)抑郁癥大鼠Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)，說明AMPKα1過表達(dá)腺病毒可減緩抑郁癥引起的線粒體損傷。

氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)失衡而產(chǎn)生的一種負(fù)面作用。VAVAKOVA等[18]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激通過自由基、非自由基分子和活性氧等在重度抑郁癥的病理生理學(xué)中起重要作用；MAURYA等[19]發(fā)現(xiàn)包括重度抑郁癥在內(nèi)的神經(jīng)變性/神經(jīng)精神病癥的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，因此，氧化應(yīng)激在抑郁癥發(fā)生中起關(guān)鍵作用。COLOMBO等[20]研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中AMPKα1可調(diào)節(jié)其氧化應(yīng)激能力。AMPKα1高表達(dá)有望調(diào)節(jié)抑郁癥患者的氧化應(yīng)激能力。本研究發(fā)現(xiàn)AMPKα1高表達(dá)上調(diào)抑郁癥大鼠SOD含量，并下調(diào)抑郁癥大鼠LDH和MDA含量，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒減輕抑郁癥大鼠氧化應(yīng)激。

生物體的精神狀態(tài)和糖代謝水平密切相關(guān)[21]。夏青春等[22]研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的空腹血糖和餐后2 h內(nèi)血糖水平均顯著高于健康對照組，且葡萄糖耐量異常發(fā)生率高于對照組。因此，抑郁癥患者存在糖代謝異常。BODE等[2]研究發(fā)現(xiàn)AMPKα1過表達(dá)可顯著降低糖尿病患者血糖濃度，AMPKα1過表達(dá)有望改善抑郁癥大鼠細(xì)胞糖代謝異常。本研究發(fā)現(xiàn)AMPKα1高表達(dá)可上調(diào)PGC-1α和GLUT4表達(dá)，說明AMPKα1高表達(dá)腺病毒可改善抑郁癥大鼠糖代謝。

綜上所述，尾靜脈注射AMPKα1高表達(dá)腺病毒可改善抑郁癥模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)自主探究行為，緩解腦損傷及線粒體損傷，減輕氧化應(yīng)激，并改善糖代謝，從而緩解抑郁癥，為抑郁癥治療提供新的治療方案。