張 雙 高 鷹 李黎仙 杜俊蓉*

(1.四川大學華西藥學院藥理學系,四川 成都 610041;2.云南白藥集團股份有限公司,云南 昆明 650217)

引言

牙周炎是細菌引起的慢性炎癥，往往引發(fā)牙周支持組織的炎性破壞。人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)免疫應答是牙周組織結構完整或者破壞的重要決定因素[1]。牙周炎主要是由革蘭氏陰性菌引起的[2,3]，而脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。Toll 樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一類天然免疫受體，TLR4是其主要成員之一，研究表明hPDLCs被LPS刺激后，經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導，激活細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)從而調(diào)節(jié)各種炎癥因子的表達[4]，參與牙周組織破壞。因此如何調(diào)控hPDLCs炎癥反應的發(fā)生，對牙周炎的防治具有重要意義。

蘆薈為百合科蘆薈屬多年生肉質(zhì)草本植物，種類繁多，集食用、藥用、美容、觀賞于一身。文獻報道，該植物具有抗炎、促進傷口愈合、增強免疫功能、降血糖等多種藥理活性[5,6]。目前，蘆薈提取物對牙周炎的防治作用鮮有報道，本研究從細胞水平探討蘆薈提取物對LPS誘導下的hPDLCs炎癥的抑制作用并探討其作用機制，為蘆薈提取物應用于牙周炎的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與藥物來源

牙周膜細胞來源于四川大學華西口腔醫(yī)院；蘆薈提取物為庫拉索蘆薈凍干粉，批號20150501，云南白藥集團股份有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

LPS(E. coli O55:B5，Sigma，美國)；IL-6 Elisa試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)；α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(民海生物)；DMSO，MTT(Amresco，美國)；兔抗TLR4單克隆抗體、羊抗兔FITC、抗熒光衰減封片劑、4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚 (DAPI)染色劑、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)；羊抗兔NF-κBp65單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；倒置式生物顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)；酶標儀(Bio-RAD Model 550)；顯微鏡及照片獲取系統(tǒng)(Olympus，日本)。

1.3 細胞培養(yǎng)

將凍存的hPDLCs復蘇，用含10%胎牛血清和1%青霉素、1%鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2孵箱中進行培養(yǎng)，1∶3比例進行傳代，選取4～6代細胞用于實驗。

1.4 實驗分組

實驗分為5組，包括對照組，模型組(1μg/mlLPS)，蘆薈提取物低劑量組0.05 mg/ml)，中劑量組(0.1 mg/ml)，高劑量組(0.2mg/ml)。

1.5 MTT法檢測細胞活性

將對數(shù)生長期的hPDLCs(1×105/ml) 接種于96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按各組濃度進行造?；蚪o藥，每組3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入10 μl 5mg/ml MTT ，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150μl DMSO，常溫下?lián)u床搖10min，在酶標儀490 nm 波長測吸光度值，取3 孔平均值，計算細胞存活率(實驗組A490/空白組A490×100%)。重復3次。

1.6 ELISA法檢測IL-6的含量

將對數(shù)生長期的hPDLCs(1×105/ml) 接種于96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照各組濃度預防給藥1h，1 μg/mlLPS造模作用24h，每組9個復孔，收集培養(yǎng)上清，根據(jù)Elisa試劑盒說明書測定細胞上清液中IL-6含量。

1.7 免疫染色法測定TLR4的表達

將對數(shù)生長期的hPDLCs(3×104/ml) 接種24孔板爬片，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取對照組、模型組、高劑量組，預防給藥1 h，每組3個復孔，1μg/mlLPS造模作用24h后，SABC免疫細胞染色法進行DAB染色，蘇木素染核，脫水透明后，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察TLR4表達情況。

1.8 免疫熒光染色法檢測NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)狀況

將對數(shù)生長期的hPDLCs(3×104/ml) 接種24孔板爬片，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取高劑量組預防給藥1 h。1μg/ml LPS造模1h后， PBS清洗，4%多聚甲醛固定30min， PBS洗3次，1min/次，0.3%Triton X-100打孔30min，PBS漂洗3次，1min/次，3%H2O230min氧化內(nèi)源性過氧化物酶， PBS洗3次，1min/次，5%牛血清 37℃封閉1h，一抗(1∶50)4℃過夜，PBS洗3次，熒光二抗37℃避光孵育1h，DAPI染核1min，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察NF-κB-p65的表達情況。每組3個復孔。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 蘆薈提取物對hPDLCs細胞活性的影響

與對照組比較，模型組、蘆薈提取物低、中、高劑量組中細胞活力無顯著差異(P >0.05)，見表1。

表1 蘆薈提取物對牙周膜細胞活性的影響

2.2 蘆薈提取物對細胞上清液中IL-6 含量的影響

與正常組比較，模型組中IL-6含量顯著提高(P<0.05)。與模型組比較，蘆薈提取物低、中、高劑量組hPDLCs細胞上清中IL-6 含量均顯著下降(P<0.05)，并且呈劑量依賴性，見表2。

表2 蘆薈提取物對牙周膜細胞分泌IL-6的影響

2.3 蘆薈提取物對LPS 誘導的hPDLCs中TLR4蛋白的影響

與對照組相比，模型組的TLR4陽性表達明顯上調(diào)。與模型組相比，蘆薈提取物高劑量組TLR4陽性表達顏色明顯變淺，表達下調(diào)，見圖1。

A:對照組；B:模型組；C:高劑量組(×200)

2.4 蘆薈提取物對NF-κB-p65的作用

對照組NF-κB-p65基本分布在胞漿中，模型組NF-κB-p65核轉(zhuǎn)明顯增多，蘆薈提取物高劑量組NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)明顯減少，見圖2。

圖2 蘆薈提取物對LPS誘導牙周膜細胞NF-κB-p65核內(nèi)轉(zhuǎn)的作用(×400)

3 討論

牙周炎是常見的口腔感染性疾病，已成為突出的口腔保健問題。據(jù)報道，蘆薈具有抗炎作用[5]，本研究就蘆薈提取物對LPS誘導hPDLCs炎癥的抑制效果進行了探討。研究結果表明，蘆薈提取物能夠抑制LPS誘導hPDLCs分泌IL-6，其抗炎機制可能與抑制TLR-4介導的NF-κB信號通路有關，提示蘆薈提取物可能是牙周疾病預防與治療的有效藥物。

hPDLCs是牙周組織重要的組成細胞之一，在牙周炎的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]。牙周炎的主要致炎因子LPS能促進如IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達，參與牙周組織的破壞。因此，抑制炎癥因子的產(chǎn)生有益于減緩牙周疾病的發(fā)展進程[7]。IL-6具有多種生物學效應，在牙周疾病中參與局部炎癥反應及牙周組織的破壞。研究表明，IL-6不僅在牙周組織中能夠誘導破骨細胞的生成[8]，還與牙周袋的深度密切相關[9]。牙周炎患者齦溝液中IL-6的含量顯著高于健康人齦溝液中IL-6的含量，表明IL-6在某一程度上是牙周炎的嚴重程度的重要標志[10]。本研究中，蘆薈提取物對LPS誘導hPDLCs分泌IL-6有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性。這些結果提示，蘆薈提取物對LPS誘導的hPDLCs的炎癥反應有較好的抗炎效果。

TLR4是LPS的主要受體，二者結合后，通過相關信號轉(zhuǎn)導激活NF-κB，從而誘發(fā)一系列炎癥因子如IL-1β、IL-6等的產(chǎn)生[3]。正常狀態(tài)下，NF-κB-p65在胞漿中與NF-κB 抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，IκB)相結合[11]，處于非活化狀態(tài)。在LPS刺激下，TLR4與髓樣分化因子88結合，活化后的髓樣分化因子88使得IL-1受體相關激酶發(fā)生一系列磷酸化反應[12]，IκB 磷酸化后，與NF-κB-p65形成的蛋白復合體解離，游離的 NF-κB-p65 進入細胞核，與相關位點的DNA鏈結合，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能[13,14]，調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)和細胞因子的表達，引起一系列炎癥因子產(chǎn)生，促進牙周病的發(fā)生和發(fā)展。本實驗探究了蘆薈提取物對LPS誘導下hPDLCs中TLR4及NF-κB-p65的影響，結果顯示蘆薈提取物能夠抑制LPS誘導的TLR4蛋白的表達以及NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)，進而抑制下游靶基因IL-6的生成。

綜上所述，本研究選用的蘆薈提取物對LPS誘導的hPDLCs炎癥反應有一定的抑制效應，，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關。上述結果為蘆薈提取物用于牙周炎的防治提供了實驗依據(jù)，對口腔保健具有參考價值。