杜記濤 曹建 趙穩(wěn) 萬相斌 李智

胃癌（gastric carcinoma，GC）是臨床常見的一種消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其最先發(fā)生于機體胃黏膜上皮細(xì)胞，好發(fā)于中老年群體中，且男性發(fā)病率明顯高于女性［1］。據(jù)相關(guān)調(diào)查研究顯示，目前全球范圍內(nèi)GC 的發(fā)病率和死亡率已分別躍居惡性腫瘤的第5 位和第3 位，而我國GC 發(fā)病率、死亡率分別位于全部惡性腫瘤第2 位，第3 位，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界的平均水平［2］。大部分GC 患者在早期無明顯臨床癥狀，僅有少數(shù)患者表現(xiàn)為消化不良、飽脹不適等非特異性癥狀，因此很容易被忽略，進而使患者錯過最佳治療時機。目前臨床多通過組織活檢和胃鏡對GC 患者進行診斷，但其侵入性較強，因此還需尋找其他高效安全的診斷方法。研究表明，miR?135、miR?601在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［3?4］；由于腫瘤標(biāo)志物具有檢測快速、簡單、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢被臨床廣泛應(yīng)用腫瘤的診斷中，而糖類抗原72?4（cancen anti?gen 72?4，CA72?4）、糖類抗原19?9（cancen antigen 19?9，CA19?9）是臨床常見的消化系統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。但目前關(guān)于其診斷GC 的研究還相對較少。因此，本研究主要是探究血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 的表達水平與GC 診斷的相關(guān)性，旨在為GC的臨床診治提供更多參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2020年10月就診于本院的106例GC患者作為觀察組，其中男83例，女23例；平均年齡（65.76±3.67）歲；GC類型：腺癌91例，粘液腺癌6例，印戒細(xì)胞癌4例，其他類型5例；TNM腫瘤分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期16例，Ⅲ期30例，Ⅳ期14例；另選取同期于本院進行健康體檢的健康人群45例作為對照組，平均年齡（66.02±3.54）歲；兩組在性別、年齡的比較中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《胃癌規(guī)范化診療指南（試行）》［5］中GC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均確診為GC；②未接受過相關(guān)治療的患者；③臨床依從性較高的受試者；④患者或其家屬簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤疾病的受試者；②合并胃腸道及肝膽疾病的患者；③中途退出的受試者；④臨床資料不完整的受試者。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

在受試者被納入研究后的第2 天清晨抽取其空腹肘靜脈血6 mL，置于EP 管內(nèi)，在常溫下靜置1 h后，采用離心法分離出血清，將等分為兩份置于干燥試管內(nèi)，于-25℃保存待測。

1.2.2 血清miR?135、miR?601 水平的檢測

取其中一份待測樣品，采用總RNA 抽提試劑（TRIzol 試劑，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）對將其總RNA 分離，采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real?time polymerase chain reaction，qRT?PCR）對miR?135、miR?601 的表達進行檢測。其中miR?135 的上游引物是：5′?ATGTACGCTACT?GTGAGCTG?3′，下游引物是5′?GTCAGCGAGT?GAGCATAG?3′；miR?601 的上游引物是5′?GAT?GACTGTATGACTCTCAG?3′，下游引物是5′?AGT?GTACTACATAGTACG?3′。反應(yīng)的體系共20 μL，分為10 μL TaqMan 2×Universal PCR Master Mix、1 μL TaqMan MicroRNA Assay、1.33 μL cDNA、7.67 μL ddH2O，充分混合。擴增的條件是10 min 95℃預(yù)變性、15 s 95℃變性、60 s 60℃復(fù)性，內(nèi)參照為U6，共循環(huán)45 次，實驗開展3 次。所用儀器由美國ABI 公司提供，試劑盒由新?；驒z測有限公司提供。計算方法為：用2?△△Ct法（△Ct=Ct目的基因?CtU6）。

1.2.3 血清CA72?4、CA19?9 水平的檢測

取另一份待測樣品，采用電化學(xué)發(fā)光法對血清CA72?4、CA19?9 水平進行檢測，所用試劑盒由上海羅氏制藥有限公司提供。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組血清miR?135、miR?601、CA72?4及CA19?9 的表達水平；②采用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 水平與GC 發(fā)生的相關(guān)性；③采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線評價血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 對GC 的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布，計量資料采用（）進行表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用例n（%）進行表示，采用χ2檢驗；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR?135、miR?601、CA72?4及CA19?9表達水平的比較

觀察組血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 表達水平均顯著高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t1=7.018，t2=7.523，P＜0.05）。見圖1。

圖1 兩組血清miR?135、miR?601 表達水平的比較Figure 1 Comparison of serum miR?135 and miR?601 expression levels between 2 groups

2.2 血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 水平與GC 發(fā)生的相關(guān)性分析

根據(jù)Pearson 相關(guān)分析結(jié)果可知，血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 與GC 的發(fā)生呈正相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 水平與GC 發(fā)生的相關(guān)性分析Table 1 Analysis of the correlation between serum miR?135，miR?601，CA72?4 and CA19?9 levels and the occurrence of GC

2.3 血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 對GC 診斷效能的評價

血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 均可有效診斷GC，聯(lián)合診斷的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）均顯著高于單一指標(biāo)診斷的值，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 血清miR?135、miR?601、CA72?4、CA19?9 及其聯(lián)合檢測對GC 診斷的ROC 曲線Figure 2 ROC curve of serum miR?135，miR?601，CA72?4，CA19?9 and their combined detection for GC diagnosis

3 討論

GC 作為世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)確診病例達到了95 萬例，死亡病例達到了72 萬例，對人類的身體健康及生命安全造成了嚴(yán)重的威脅［6］。由于GC 患者早期臨床癥狀并不顯著，導(dǎo)致大多數(shù)患者在確診時一般已至腫瘤的中晚期了，而早發(fā)現(xiàn)、診斷、治療是提高GC 患者生存質(zhì)量的主要方法之一，因此一種高效的早期診斷方法被臨床迫切需要。目前臨床主要通過形態(tài)學(xué)對GC患者進行診斷，活檢病理診斷是其金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其屬于侵入性檢查，患者耐受程度較低且不適于反復(fù)檢查。miRNA 是由腫瘤細(xì)胞主動分泌的一種小分子，其表達水平能夠隨著腫瘤的生成與凋零發(fā)生顯著性的變化，對臨床多種惡性腫瘤的早期診斷、治療以及預(yù)后都有著重要的指導(dǎo)意義。

表2 血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 對GC 診斷效能的評價Table 2 Evaluation of serum miR?135，miR?601，CA72?4 and CA19?9 for diagnosis of gastric cancer

Yin 等［7］研究結(jié)果顯示，GC 患者血清miR?135、CA19?9 水平明顯高于健康人群；Min 等［8］研究顯示，與癌旁正常組織相比，GC 組織miR?601 明顯上調(diào)；韓瑩波等［9］學(xué)者發(fā)現(xiàn)，GC 患者血清CA72?4、CA19?9 的表達水平高于正常人群；在本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果完全相符，表明GC 患者血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 的表達水平顯著上調(diào)。miRNA 在真核生物中廣泛存在，是基因調(diào)控機體網(wǎng)絡(luò)的重要組成成分之一，通常是通過調(diào)節(jié)機體細(xì)胞基因的表達影響機體各項病理生理過程［10］，目前已有研究結(jié)果顯示，miR?135、miR?601 在多種癌癥高表達［11?12］；CA72?4 是高分子量的一種粘蛋白，由單克隆抗體B72.3 和CC 49 確定，在健康機體內(nèi)，其含量一般較低，但在多種腫瘤組織中呈高表達［13］；CA19?9 作為E?選擇素（E?selectin）配體，是一種糖類抗原，是上皮的源性腫瘤廣譜的標(biāo)志物，在血管的內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的黏附中發(fā)揮著重要的作用，被臨床廣泛用于胃癌的診斷、病情評估以及預(yù)后推測中［14］。綜合上述提示，miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 可作為GC 診斷的重要臨床指標(biāo)，進而為臨床治療提供指導(dǎo)。

于偉等［15］研究結(jié)果顯示，GC 患者血清CA72?4、CA19?9 水平高于胃良性疾病患者和健康人群，而胃良性疾病患者有明顯高于健康人群。與上述研究結(jié)果基本相符，同時還發(fā)現(xiàn)，血清miR?135、miR?601 水平與GC 的發(fā)生也呈正相關(guān)，上述研究結(jié)果表明，可根據(jù)機體血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9水平的變化情況對GC 進行早期診斷。

腫瘤標(biāo)志物是非侵入性的、簡單的一種臨床診斷方法，被廣泛用于腫瘤的早期診斷、療效判斷以及預(yù)后評估中，并取得了較為顯著的效果，但臨床多項研究表明，單一腫瘤標(biāo)志物特異性、敏感性以及準(zhǔn)確性較低，限制了其臨床應(yīng)用［16?17］；本研究結(jié)果顯示，血清miR?135、miR?601診斷GC的效能較高，但仍存在一定的不足之處，為進一步提高GC 的早期診斷效能，于是本研究將血清miR?135、miR?601與腫瘤標(biāo)志物CA72?4、CA19?9 進行聯(lián)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其診斷GC的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度以及AUC 等均明顯升高，結(jié)果表明，單一指標(biāo)檢測的值難免會具有一定的局限性，而聯(lián)合檢測則在一定程度上彌補了單一指標(biāo)所檢測的不足，因此，提示可聯(lián)合血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 共同診斷GC。

綜上所述，血清miR?135、miR?601、CA72?4 及CA19?9 的表達水平在GC 患者中顯著上調(diào)，與GC的發(fā)生呈正相關(guān)，且四個指標(biāo)聯(lián)合診斷GC 的靈敏度、特異性以及準(zhǔn)確度更高，對臨床早期診斷GC有著較高的參考價值。