張麗 李友云 王永超 邢素娟 趙慧玲

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性常見的內(nèi)分泌疾病，以雄激素增多、胰島素抵抗、排卵障礙為特征，是目前臨床上無排卵性不孕的主要原因。人工授精（intra?uterine insemination，IUI）是治療不孕癥的有效手段，操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低廉且治療過程接近自然受孕過程，對(duì)于反復(fù)誘導(dǎo)排卵仍未能妊娠的PCOS患者可選擇IUI［1?2］。但是，目前IUI 治療PCOS 不孕的臨床妊娠率較低，影響PCOS 不孕患者IUI 妊娠結(jié)局的因素復(fù)雜、機(jī)制也不十分明確［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是近些年生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到越來越多關(guān)注的一類非編碼小分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢功能、子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控［4］。國(guó)內(nèi)李紅娟關(guān)于PCOS 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR?21?5p 在PCOS 大鼠中表達(dá)減少且過表達(dá)miR?21?5p 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用、凋亡具有抑制作用［5］，但miR?21?5p 在PCOS 不孕中的作用及其與妊娠結(jié)局的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究將分析外周血miR?21?5p 表達(dá)的變化及其對(duì)IUI 結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2017年1月至2019年12月期間在本院接受IUI 的178 例PCOS 不孕患者作為PCOS 組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合PCOS 診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；②未避孕性生活1年以上的不孕者；③女方輸卵管造影及B 超證實(shí)至少1 側(cè)輸卵管通暢；④男方精液常規(guī)符合IUI 標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生殖系統(tǒng)畸形或其他疾病導(dǎo)致的不孕；②因多卵泡發(fā)育或無優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育而取消周期的患者；③IUI 過程中精液液化異常、處理后精子密度＜2×106/mL、A+B 級(jí)精子回收率＜20%；④合并惡性腫瘤、糖尿病等。另取同期體檢的102 例月經(jīng)周期正常且已婚已育女性作為對(duì)照組。PCOS 組年齡26～36 歲、平均（32.74±7.82）歲，BMI（24.37±7.82）kg/m2；對(duì)照組年齡25～37 歲、平均年齡（33.12±8.51）歲，BMI（23.51±9.29）kg/m2。兩組間一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。所有患者均知情，本實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 外周血miR?21?5p 表達(dá)的檢測(cè)

取兩組受試者的空腹外周靜脈血3 mL，采用北京天根公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。首先，采用miRNA 提取試劑盒分離提取外周血中的總miRNA，而后用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的cDNA，最后miRNA 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR 檢測(cè)，分別使用目的基因miR?21?5p 及內(nèi)參基因U6 的特異性引物，按照下列程序進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性3 min 后95℃15 s、60℃34 s 循環(huán)40 次，得到反應(yīng)的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），以U6 為內(nèi)參、按照公式2?ΔΔCt計(jì)算miR?21?5p 的表達(dá)水平。

1.2.2 IUI 方法

首先在月經(jīng)第3～5 d 時(shí)進(jìn)行促排卵治療，方案包括克羅米芬、（HMG）、克羅米芬聯(lián)合HMG；監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)卵泡，當(dāng)直徑達(dá)14 mm 后每日監(jiān)測(cè)尿LH，出現(xiàn)LH 峰當(dāng)日或優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)18 mm 后，使用重組人絨毛膜促性腺激素（hCG）250 μg，24～36 h 后進(jìn)行IUI。IUI 后進(jìn)行黃體支持，給予黃體酮膠囊100 mg 口服2 次/日，連續(xù)服用14 d。

1.2.3 臨床資料的收集

查閱PCOS 組患者的病歷并收集以下臨床資料：年齡、BMI、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、抗苗勒氏管激素（AMH）、高雄激素血癥、促排卵方案、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目。

1.2.4 IUI 結(jié)局的判斷

IUI 后14 d 查血及尿hCG 以確定是否生化妊娠；35 d 后行陰道B 超檢查，見到宮內(nèi)孕囊、胚芽、心管搏動(dòng)確定為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（）表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，miR?21?5p 對(duì)IUI 結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值采用ROC 曲線分析，IUI 結(jié)局的影響因素采用logistic 回歸分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR?21?5p 表達(dá)的比較

與對(duì)照組（0.93±0.22）比較，PCOS 組(0.59±0.18)患者外周血miR?21?5p 的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.470，P＜0.05）。

2.2 PCOS 組中臨床妊娠患者與未臨床妊娠患者外周血miR?21?5p 表達(dá)的比較

與PCOS 組中臨床妊娠患者（0.41±0.13）比較，未臨床妊娠患者（0.63±0.17）外周血miR?21?5p 的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.497，P＜0.05）。

2.3 miR?21?5p 預(yù)測(cè)PCOS 組患者臨床妊娠的ROC 曲線分析

繪制miR?21?5p 預(yù)測(cè)PCOS 組患者IUI 后臨床妊娠的ROC 曲線，曲線下面積為0.852（95%CI：0.785 4～0.919 1，P＜0.001），根據(jù)約登指數(shù)最大值確定最佳截?cái)嘀禐?.522，該截?cái)嘀殿A(yù)測(cè)臨床妊娠的靈敏度為85.71%、特異性為76.00%。見圖1。

圖1 miR?21?5p 預(yù)測(cè)PCOS 組患者臨床妊娠的ROC 曲線Figure 1 ROC curve of miR?21?5p in predicting clinical pregnancy in PCOS group

2.4 PCOS 組中臨床妊娠患者與未臨床妊娠患者臨床資料的比較

PCOS 組中臨床妊娠患者與未臨床妊娠患者比較，年齡、BMI、FSH、LH、促排卵方案的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高雄激素血癥、AMH、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PCOS 組中臨床妊娠患者與未臨床妊娠患者臨床資料的比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between patients with clinical pregnancy and patients without clinical pregnancy in PCOS group［n（%），（±s）］

表1 PCOS 組中臨床妊娠患者與未臨床妊娠患者臨床資料的比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between patients with clinical pregnancy and patients without clinical pregnancy in PCOS group［n（%），（±s）］

臨床資料年齡（歲）BMI（kg/m2）FSH（U/L）LH（U/L）AMH（ng/mL）高雄激素血癥優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)≥2 個(gè)臨床妊娠患者（n=28）32.04±7.56 23.94±5.67 6.51±1.24 8.74±1.21 10.92±2.81 2（7.14%）22未臨床妊娠患者（n=150）32.98±7.92 24.55±7.93 6.84±1.05 8.48±1.46 8.37±2.14 38（25.33%）74 t/χ2值0.580 0.389 1.482 0.886 5.492 4.481 8.119 P 值0.562 0.698 0.140 0.377 0.000 0.034 0.004

2.5 PCOS 組患者妊娠結(jié)局影響因素的logistic 回歸分析

以PCOS 組患者妊娠結(jié)局作為應(yīng)變量，以妊娠患者與未臨床妊娠患者比較的單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素作為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析可知：miR?21?5p、AMH、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目是PCOS組患者妊娠結(jié)局的影響因素。見表2。

表2 PCOS 組患者妊娠結(jié)局影響因素的logistic 回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of influencing factors of pregnancy outcome in PCOS group

3 討論

IUI 是治療不孕癥常用的輔助手段，通過導(dǎo)管將優(yōu)化后的精液注入宮腔，操作簡(jiǎn)單、損傷小且治療過程接近自然受孕過程，易于被患者接受。PCOS 是不孕的常見病因之一，對(duì)于反復(fù)誘導(dǎo)排卵仍未能妊娠的PCOS 患者，IUI 是一線治療方案。但是，IUI 治療PCOS 不孕的妊娠率較低，影響妊娠結(jié)局的因素十分復(fù)雜，相關(guān)的分子機(jī)制也未完全闡明。

卵巢儲(chǔ)備功能反映了女性生育潛能，具體是指卵巢內(nèi)存留卵泡的數(shù)量及其發(fā)育為優(yōu)質(zhì)卵泡的能力。AMH 由竇卵泡合成并分泌，是反映卵巢儲(chǔ)備功能的理想指標(biāo)，在PCOS 發(fā)病過程中竇卵泡數(shù)量增加、AMH 分泌也異常增多［7］。根據(jù)國(guó)內(nèi)謝言信［8］的研究，AMH 對(duì)PCOS 不孕患者IUI 治療的周期取消、妊娠結(jié)局均具有預(yù)測(cè)價(jià)值，預(yù)測(cè)周期取消的ROC 曲線下面積達(dá)0.731、而預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的ROC 曲線下面積僅0.585，提示雖然卵巢儲(chǔ)備功能評(píng)價(jià)指標(biāo)AMH 對(duì)PCOS 不孕患者IUI 結(jié)局具有預(yù)測(cè)價(jià)值，但預(yù)測(cè)效能較弱、ROC 曲線下面積較小。因此，需要尋找對(duì)PCOS 不孕患者IUI 結(jié)局具有更強(qiáng)預(yù)測(cè)效能的指標(biāo)。

顆粒細(xì)胞是卵巢中重要的功能細(xì)胞，PCOS 發(fā)病過程中顆粒細(xì)胞的過度凋亡會(huì)使卵泡發(fā)育停滯在次級(jí)卵泡階段，進(jìn)而出現(xiàn)卵巢多囊改變［9?10］。miRNA 是顆粒細(xì)胞增殖及凋亡重要的上游調(diào)控分子［11?12］，李紅娟［5］的研究中顯示在PCOS 大鼠卵巢中miR?21?5p 的表達(dá)減少，過表達(dá)miR?21?5p 能夠抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明miR?21?5p 表達(dá)減少與PCOS 不孕的發(fā)生有關(guān)，可能機(jī)制是miR?21?5p 低表達(dá)促進(jìn)了顆粒細(xì)胞凋亡、影響卵泡發(fā)育及卵巢儲(chǔ)備功能。

PCOS 不孕患者IUI 治療后妊娠結(jié)局的影響因素復(fù)雜，國(guó)內(nèi)多項(xiàng)相關(guān)的研究表明AMH、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目及多項(xiàng)精子指標(biāo)均是PCOS 不孕患者IUI結(jié)局的影響因素［13?16］。本研究在入組時(shí)排除了可能影響IUI 結(jié)局的男性精子因素，對(duì)miR?21?5p 及其他臨床因素對(duì)IUI 結(jié)局的影響進(jìn)行了logistic 回歸分析，結(jié)果顯示：miR?21?5p、AMH、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目是PCOS 不孕患者妊娠結(jié)局的影響因素。其中miR?21?5p 與PCOS 不孕患者妊娠結(jié)局相關(guān)的結(jié)果與miR?21?5p 抑制顆粒細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用吻合，也與本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PCOS 不孕患者IUI 治療后未臨床妊娠患者miR?21?5p 表達(dá)減少的結(jié)果一致；AMH、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目與PCOS 不孕患者妊娠結(jié)局相關(guān)的結(jié)果與國(guó)內(nèi)已有的相關(guān)研究結(jié)果一致。

綜上所述，PCOS 不孕患者外周血miR?21?5p表達(dá)減少且對(duì)IUI 結(jié)局具有預(yù)測(cè)價(jià)值，未來miR?21?5p 有可能成為研究PCOS 不孕分子機(jī)制的靶點(diǎn)。