姜玉玉,尹天玥,李小雨,于 汝,程向陽

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

冠心病常伴心臟缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)損傷,是引起心力衰竭的主要原因之一[1-3]。既往對(duì)心肌I/R損傷發(fā)病機(jī)制的研究多集中在氧自由基、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、內(nèi)皮細(xì)胞損傷等方面[4]。近年來,為了防止I/R損傷,一些藥理學(xué)策略被廣泛研究[5,6]。

凋亡已被發(fā)現(xiàn)是心肌I/R損傷的基礎(chǔ)[7],心肌缺血后不久即開始凋亡過程,再灌注時(shí)凋亡明顯增強(qiáng)[8]。由于心肌細(xì)胞是沒有或幾乎沒有再生潛能的終末分化細(xì)胞,因此防止心肌細(xì)胞在I/R損傷后的凋亡是一項(xiàng)重要的臨床治療策略。

右美托咪定是一種選擇性α2腎上腺素受體激劑,具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用,被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉[9,10]。右美托咪定在神經(jīng)保護(hù)方面具有潛在的應(yīng)用前景,此外,它還對(duì)于很多器官,包括肝、肺、腎和心肌都有保護(hù)作用[11]。右美托咪定預(yù)處理保護(hù)了心肌細(xì)胞免受I/R損傷[12],然而其保護(hù)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22 bp的非編碼小RNA,可以通過結(jié)合mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)抑制基因表達(dá)[13]。越來越多的數(shù)據(jù)表明,miRNA表達(dá)異常與多種心血管疾病有關(guān),包括心肌I/R損傷[14]。MiR-579-3p在多種腫瘤中均低表達(dá)。miR-579-3p低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[15]。一項(xiàng)動(dòng)物腦I/R損傷模型報(bào)道,miR-579-3p可通過抑制炎癥和細(xì)胞凋亡,部分減輕腦I/R損傷[16]。

因此我們推測(cè),調(diào)控miR-579-3p可能是右美托咪定減輕心肌I/R損傷的機(jī)制。本研究通過建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型,研究右美托咪定對(duì)心肌I/R損傷的影響,以及右美托咪定減少心肌I/R損傷與miR-579-3p之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料

miR-579-3p inhibitor、miR-579-3p inhibitor NC(miR-579-3p inhibitor空白對(duì)照)、miR-579-3p引物購自上海吉瑪公司;Lipofectamine購自美國Invitrogen公司;DMEM/F12培養(yǎng)基,胎牛血清購自Gibco公司;Ⅱ型膠原酶購自北京Solarbio公司;CCK-8檢測(cè)試劑盒,Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物公司;PVDF膜購自美國Millipore公司;兔源抗Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3抗體購自美國Affinity公司;兔源抗GAPDH抗體,HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自Biosharp公司。

1.2 動(dòng)物

1-3 d SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠購自蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):20180004002485。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

取1-3 d的乳鼠頸椎脫臼處死,75%酒精消毒60 s,取出乳鼠的心臟,以預(yù)冷D-Hanks液清洗3次,剪碎,用含有0.07%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型膠原酶的混合酶37 ℃消化5 min,沉淀1 min后,取消化后的細(xì)胞上清液置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中終止消化,消化過程約5次。含細(xì)胞上清液的DMEM/F12培養(yǎng)基1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基混勻,收集細(xì)胞懸液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min,吸取細(xì)胞懸液,接種于另一培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)24 h后換液。待細(xì)胞密度約60%時(shí),建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。棄去培養(yǎng)基,更換為不含胎牛血清的無糖DMEM培養(yǎng)基,在1%O2和5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中缺氧6 h后,置換含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,并于5%CO2,95%空氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h進(jìn)行復(fù)氧處理。

1.4 細(xì)胞處理與分組

為了確定不同濃度右美托咪定對(duì)缺氧復(fù)氧刺激后心肌細(xì)胞活性的影響,我們?cè)谌毖鯊?fù)氧時(shí)分別給予0.01,0.1,1 μmol/L右美托咪定處理。

為檢測(cè)右美托咪定對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的影響,將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:①control組在完全培養(yǎng)基中,37 ℃,5%CO2,常氧條件下培養(yǎng)12 h。②H/R組用無糖培養(yǎng)基替代完全培養(yǎng)基,在37 ℃,5%CO2、94%N2,1%O2條件培養(yǎng)6 h,隨后替換完全培養(yǎng)基,37 ℃,5%CO2,常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h。③H/R+Dex組進(jìn)行1 μmol/L右美托咪定給藥后缺氧復(fù)氧處理。④H/R+Dex+NC組在轉(zhuǎn)染miR-579-3p inhibitor NC 24 h后,進(jìn)行右美托咪定給藥和缺氧復(fù)氧處理。⑤H/R+Dex+inhibitor組在轉(zhuǎn)染miR-579-3p inhibitor 24 h后,進(jìn)行右美托咪定給藥和缺氧復(fù)氧處理。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-579-3p表達(dá)

使用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,定量后吸取1 μg總RNA產(chǎn)物,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,使用StepOne Plus熒光定量PCR系統(tǒng)和SYBR Green試劑盒進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定miR-579-3p表達(dá)。以U6作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 miRNA引物序列

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌細(xì)胞活力

將心肌細(xì)胞消化并重懸,接種于96孔板(1×104個(gè)細(xì)胞/孔),每組3個(gè)復(fù)孔。經(jīng)上述處理后,每孔分別加入CCK-8試劑10 μl,37 ℃孵育1 h。測(cè)定450 nm處吸光度值。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后,收集細(xì)胞,用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液調(diào)整為1×106/ml。加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl碘化丙啶(PI),輕輕混勻,室溫(20-25 ℃)避光孵育15 min。使用FACSCaliburTM分析各組細(xì)胞凋亡所占百分比。

1.8 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)

各組細(xì)胞經(jīng)過不同處理后,收集細(xì)胞,在含苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的RIPA裂解液中冰上裂解30 min,12 000 r/min離心15 min,收集上清作為細(xì)胞總蛋白。分別將等質(zhì)量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉,孵育一抗,包括Bcl-2(1∶1 000),Bax(1∶1 000),cleaved Caspase-3(1∶1 000),GAPDH(1∶3 000),4 ℃孵育過夜。然后,用TBST洗膜,室溫孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶10 000)1 h,使用ECL進(jìn)行顯影,放入成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。用ImageJ軟件分析免疫反應(yīng)條帶密度,GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性的影響

與control組相比,H/R組心肌細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 μmol/L Dex組細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,H/R+1 μmol/L Dex組細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05),與H/R+0.1 μmol/L Dex組相比,H/R+1 μmol/L Dex組細(xì)胞活力增加(見圖1),因此以1 μmol/L濃度的右美托咪定進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與control組相比,*P<0.05;與H/R組相比,#P<0.05

2.2 右美托咪定對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,與control組相比,H/R組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),而與H/R組相比,H/R+Dex組凋亡率明顯下降(P<0.05,見圖2)。Western blot結(jié)果顯示,與control組相比,H/R組Bcl-2降低,Bax,cleaved Caspase-3升高(P<0.05),而與H/R組相比,H/R+Dex組Bcl-2升高,Bax,cleaved Caspase-3降低(P<0.05,見圖2)。

與control組相比,**P<0.01;與H/R組相比,#P<0.05,##P<0.01

2.3 右美托咪定對(duì)H/R處理后心肌細(xì)胞中miR-579-3p表達(dá)的影響

與control組相比,H/R組miR-579-3p表達(dá)顯著降低(P<0.01);與H/R組相比,H/R+Dex組miR-579-3p表達(dá)升高(P<0.05,見圖3)。此外,轉(zhuǎn)染miR-579-3p inhibitor結(jié)果提示,與NC組相比,inhibitor組miR-579-3p表達(dá)顯著降低(P<0.01,見圖3)。

與control組相比,*P<0.05;與H/R組相比,#P<0.05與NC組相比,**P<0.01

2.4 右美托咪定通過提高miR-579-3p表達(dá)緩解心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,與H/R組相比,H/R+Dex組凋亡率明顯降低(P<0.01);與H/R+Dex組相比,H/R+Dex+inhibitor組凋亡率顯著升高(P<0.05,見圖4)。Western blot結(jié)果表明,與H/R組相比,H/R+Dex組Bcl-2升高,Bax,cleaved Caspase-3降低(P<0.05);與H/R+Dex組相比,H/R+Dex+inhibitor組Bcl-2降低,Bax,cleaved Caspase-3表達(dá)升高(P<0.05,見圖4)。

與H/R組相比,**P<0.01;與H/R+Dex組相比,#P<0.05,##P<0.01

3 討論

右美托咪定用于重癥監(jiān)護(hù)病房和手術(shù)室手術(shù)前或手術(shù)期間的麻醉和鎮(zhèn)靜。越來越多的證據(jù)表明右美托咪定在許多病理過程中,特別是在缺血/再灌注損傷中,對(duì)器官發(fā)揮保護(hù)作用。在心血管系統(tǒng),體內(nèi)和體外大鼠心臟I/R模型中,右美托咪定預(yù)處理可顯著改善缺血后心肌功能,降低心肌梗死面積[11-17]。凋亡是I/R損傷過程中的關(guān)鍵事件,在其發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用[18]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控約60%基因表達(dá),并在缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[19]。miRNA在缺血刺激反應(yīng)中的作用逐漸成為缺血后心肌保護(hù)和恢復(fù)的靶點(diǎn)。miR-579-3p在腦I/R損傷中具有抗凋亡作用,因此,我們猜測(cè)其在心肌I/R損傷中也可能具有類似作用。為因此,我們建立了心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型研究miR-579-3p在心肌I/R損傷中的作用。在這個(gè)模型中,細(xì)胞被放置在一個(gè)低氧環(huán)境中數(shù)小時(shí)后返回到常氧環(huán)境,這可以模擬心肌I/R損傷,對(duì)于研究心肌損傷是一個(gè)有用的工具[20]。

本研究結(jié)果顯示,與H/R組相比,H/R+Dex組Dex預(yù)處理不僅提高了miR-579-3p表達(dá),而且也增加了心肌細(xì)胞活性,說明右美托咪定可以改善缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞活力,降低心肌細(xì)胞凋亡,這與之前的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明,與H/R+Dex組相比,H/R+Dex+inhibitor組通過降低miR-579-3p表達(dá),從而降低了心肌細(xì)胞活性。提示右美托咪定的心肌細(xì)胞保護(hù)作用可能是通過提高miR-579-3p表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果可能對(duì)于減少包括I/R損傷在內(nèi)的心臟綜合征具有重要的臨床意義。

綜上所述,右美托咪定可以減輕原代心肌細(xì)胞H/R損傷,而其保護(hù)作用可能是通過升高miR-579-3p表達(dá),抑制凋亡實(shí)現(xiàn)的。其在臨床中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。