崔昭陽(yáng)，李素娜，姜旭倩，王弈丹，侯麗穎，

(1．華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山063210；2．華北理工大學(xué)理學(xué)院，河北 唐山063210)

胃癌是當(dāng)今世界最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在診斷和治療中存在早期不易發(fā)現(xiàn)、術(shù)后預(yù)后不良等難題，而且化療藥物容易產(chǎn)生毒副作用和耐藥性，因此研發(fā)新的藥物以尋求胃癌的有效治療具有重要意義。芹菜素(apigenin，API)別名芹黃素，是一種從植物中提取的黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類及茶葉中，以芹菜中含量最高，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌以及抗病毒等藥理作用。近年來(lái)已有大量研究顯示API在多種腫瘤細(xì)胞系中均具有抗腫瘤作用，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌和白血病等，API作為一種潛在的腫瘤化學(xué)預(yù)防、治療劑已引起廣泛的關(guān)注。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)作為腫瘤壞死因子超家族成員之一，主要通過(guò)外源性信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。TRAIL與細(xì)胞膜上的死亡受體DR4、DR5特異性結(jié)合可將凋亡誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部引起后續(xù)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究用中度分化的人胃癌SGC-7901細(xì)胞作為體外腫瘤模型，明確API對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步探討TRAIL死亡受體是否參與了API誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，旨在闡明API抗腫瘤作用的部分機(jī)制，為胃癌的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

實(shí)驗(yàn)選用的人胃癌SGC-7901細(xì)胞來(lái)源于上海腫瘤研究所，保存在-80℃冰箱中。培養(yǎng)細(xì)胞使用含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

API用二甲基亞砜(DMSO)溶解成50 mmol/L的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，4℃避光保存，使用時(shí)用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度，0.1%DMSO處理組作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑

API購(gòu)自Sigma公司，CCK-8購(gòu)自莊盟生物公司，F(xiàn)ITC-Annexin V凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自EpiZyme Scientific公司，抗兔DR4一抗購(gòu)自Abcam公司，抗兔DR5一抗、β-actin一抗均購(gòu)自Cell Signaling公司，抗兔堿性磷酸酶二抗購(gòu)自PROMEGA公司，DR4 siRNA、DR5 siRNA均購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)并用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，于96孔板中按每孔100 μL進(jìn)行鋪板，待底面覆蓋率達(dá)到70%～80%時(shí)，根據(jù)查閱文獻(xiàn)以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置不同濃度(20、40、60、80 μmol/L)API組、對(duì)照組(不含API的正常細(xì)胞孔)以及空白組(僅有培養(yǎng)液的無(wú)細(xì)胞孔)，分別作用細(xì)胞12、24、48 h，作用結(jié)束后各孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37℃避光孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度

D

(450)值，按下式計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，按照1×10個(gè)/孔的細(xì)胞濃度于6孔板中進(jìn)行鋪板，設(shè)置對(duì)照組及不同濃度(20、40、60、80 μmol/L)API組，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果，選擇作用細(xì)胞24 h；或在API作用細(xì)胞前，采用RNAi技術(shù)，使DR4 siRNA和DR5 siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞18 h，抑制DR4、DR5的表達(dá)，再加入60 μmol/L API作用細(xì)胞24 h，即設(shè)置對(duì)照組、API組、DR4 siRNA+API組、DR5 siRNA+API組，作用結(jié)束后分別收集各組細(xì)胞，緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI染料，混合后室溫下避光孵育15 min，加入400 μL緩沖液靜置5 min，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測(cè)DR4及DR5蛋白的表達(dá)水平

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，待培養(yǎng)皿底面覆蓋率達(dá)到70%～80%時(shí)，設(shè)置對(duì)照組及不同濃度(20、40、60、80 μmol/L)API組作用細(xì)胞24 h，收集各組細(xì)胞，PBS沖洗離心取下層沉淀重懸于細(xì)胞裂解液中，超聲破碎細(xì)胞，冰上裂解后離心取上清進(jìn)行蛋白提取，BCA法測(cè)定蛋白含量，調(diào)整各組蛋白含量并與蛋白上樣緩沖液混合，-20℃貯存?zhèn)溆?。Western blot實(shí)驗(yàn)時(shí)取等量蛋白上樣，用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，低溫轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%的牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1.5 h，置于DR4、DR5一抗中4℃搖晃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次后再置于堿性磷酸酶二抗中37℃搖晃孵育1.5 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，數(shù)字成像儀對(duì)圖像進(jìn)行拍照及分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用

CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，作用12 h，20、40、60、80 μmol/L API組細(xì)胞的增殖率依次為(82.87±0.46)%、(76.50±1.63)%、(60.69±0.98)%、(55.20±1.33)%(

r

=-0.99，

F

=860.52，

P

＜0.01)。作用24 h，各組細(xì)胞增殖率分別為(63.79±6.08)%、(39.70±4.98)%、(33.29±4.65)%、(37.61±3.62)%(

r

=-0.88，

F

=120.81，

P

＜0.01)。作用48 h，各組細(xì)胞增殖率分別為(55.08±3.24)%、(16.66±0.37)%、(8.63±0.90)%、(13.07±1.10)%(

r

=-0.89，

F

=1801.15，

P

＜0.01)?？梢?jiàn)隨著 API作用濃度的增加，細(xì)胞增殖率下降，作用12 h時(shí)在80 μmol/L處達(dá)到最大抑制率，作用24、48 h時(shí)均在60 μmol/L處達(dá)到最大抑制率，各組細(xì)胞增殖率與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為

P

＜0.01)，同時(shí)可以看出在相同的作用濃度下，細(xì)胞增殖率也隨作用時(shí)間的增加而降低。

圖1 不同濃度API作用SGC-7901細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞增殖情況

2.2 芹菜素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況的結(jié)果見(jiàn)圖2，對(duì)照組和20、40、60、80 μmol/L API組細(xì)胞凋亡率依次為(0.87±0.64)%、(2.17±0.51)%、(23.30±5.63)%、(54.97±2.93)%、(60.57±1.64)%。各濃度組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

r

=0.96，

F

=275.99，

P

＜0.05)，提示API可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著作用濃度的增加，細(xì)胞凋亡率升高。

圖2 API作用SGC-7901細(xì)胞24 h后的凋亡檢測(cè)

2.3 芹菜素對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞TRAIL通路中死亡受體DR4、DR5蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)TRAIL通路中死亡受體DR4、DR5蛋白表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著API作用濃度的增加，DR4和DR5的蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，DR4蛋白表達(dá)水平在80 μmol/L處達(dá)到峰值，DR5蛋白表達(dá)水平在60 μmol/L處達(dá)到峰值。

2.4 芹菜素上調(diào)DR4、DR5表達(dá)對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

DR4 siRNA和DR5 siRNA分別沉默DR4和DR5的表達(dá)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況的結(jié)果見(jiàn)圖4，對(duì)照組、API組、DR4 siRNA+API組、DR5 siRNA+API組細(xì)胞凋亡率依次為(0.87±0.64)%、(54.97±2.93)%、(32.23±3.75)%、(29.53±0.93)%。結(jié)果表明阻斷DR4、DR5的表達(dá)后，凋亡率與API組相比明顯下降，各濃度組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=246.763，

P

＜0.01)。

圖3 Western blot檢測(cè)API作用SGC-7901細(xì)胞后的DR4、DR5蛋白表達(dá)水平

圖4 沉默死亡受體DR4和DR5后對(duì)API誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

3 討論

胃癌是一種源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年胃癌在全球的發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第2位和第5位，嚴(yán)重威脅了人民的生命健康。惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征是細(xì)胞的失控性增殖，而抑制腫瘤細(xì)胞增殖是API抗腫瘤作用的重要體現(xiàn)之一。本研究結(jié)果表明，隨著API作用濃度的增加，細(xì)胞增殖率不斷降低，作用12 h時(shí)在80 μmol/L處達(dá)到最大抑制率，作用24、48 h時(shí)均在60 μmol/L處達(dá)到最大抑制率，可見(jiàn)API能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，同時(shí)具有濃度依賴性。孫悅等使用MTT法觀察了不同濃度API作用SGC-7901細(xì)胞24 h下的細(xì)胞增殖抑制情況，與本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果一致。劉歡等研究了 API低濃度(0～20 μmol/L)長(zhǎng)時(shí)間(24～72 h)作用下對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)觀察了高濃度(80 μmol/L)API在長(zhǎng)時(shí)間的作用下對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用，補(bǔ)充了API對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制的實(shí)驗(yàn)，更加明確了API對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是API抗腫瘤作用機(jī)制研究中的重要一環(huán)。細(xì)胞凋亡是一個(gè)由基因決定的細(xì)胞主動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程，可以清除威脅機(jī)體穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞等)。在本研究中，我們用不同濃度API作用細(xì)胞24 h測(cè)定胃癌細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)：隨著API作用濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，證明API可濃度依賴性的誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。在一項(xiàng)對(duì)索拉非尼耐藥的肝細(xì)胞癌的研究中，?irin等首次發(fā)現(xiàn)在體外聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼和API可明顯增加肝癌細(xì)胞的凋亡，表明API在某些耐藥細(xì)胞株中也有一定凋亡誘導(dǎo)作用。

在目前已知的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中，TRAIL通路屬于死亡受體途徑。TRAIL通路最顯著的特征就是能夠選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性。TRAIL通路之所以具有這種特征主要是因?yàn)門RAIL的一類特異性受體：死亡受體(death receptor，DR)，包括DR4和DR5，這類受體屬于跨膜受體，在細(xì)胞內(nèi)的部分含有死亡結(jié)構(gòu)域(domain death，DD)功能區(qū)，與TRAIL特異性結(jié)合后就可傳導(dǎo)凋亡信號(hào)引起細(xì)胞凋亡。同時(shí)在受體分布上，DR4和DR5在腫瘤細(xì)胞系中較為常見(jiàn)，因此在TRAIL通路中的DR4、DR5受體可以特異性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)了TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著API作用濃度的升高，DR4和DR5的蛋白表達(dá)量也逐漸增加，分別在API作用濃度為80和60 μmol/L處達(dá)到峰值，表明API可以上調(diào)TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5的蛋白表達(dá)。已有研究表明在白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)API可通過(guò)上調(diào)TRAIL通路中死亡受體DR5的表達(dá)增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的作用，且這種作用在正常人外周血單核細(xì)胞中未觀察到。Chen等發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞癌中，API的存在也可同時(shí)上調(diào)死亡受體DR4和DR5的水平，并以p53依賴的方式使癌細(xì)胞對(duì)凋亡敏感。為了進(jìn)一步明確DR4、DR5在API誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，本研究用siRNA特異性沉默DR4、DR5受體，用60 μmol/L API作用細(xì)胞24 h測(cè)定凋亡率發(fā)現(xiàn)在沉默DR4和DR5受體后，與API組相比，DR4 siRNA+API組和DR5 siRNA+API組的細(xì)胞凋亡率均降低，因此本研究推測(cè)TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5參與了API誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901凋亡的過(guò)程。在一項(xiàng)關(guān)于培美曲塞誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了使用siRNA抑制DR5表達(dá)可以減弱培美曲塞對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了API可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與激活TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5的表達(dá)有關(guān)。本研究進(jìn)一步完善了API抗腫瘤作用的機(jī)制，為新的抗腫瘤靶點(diǎn)提供了更多的證據(jù)支持。