趙子慧，王緒華

(天津康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司，天津 300300)

國家癌癥中心發(fā)布的中國2019年最新癌癥報告顯示，在中國每10萬人口中有57人患有肺癌，其中每年約有63萬人死于肺癌，并且患病趨勢逐年遞增。隨著國民健康意識的增強和螺旋CT等早期篩查技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，在新增肺癌患者中，首次確診為中晚期肺癌的比例有所下降。但腫瘤的異質(zhì)性、晚期治療效果不佳、預(yù)后差等因素造成肺癌患者5年相對生存率僅16.1%，且據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國肺癌人口的死亡數(shù)高于世界平均水平。如何有效進行早期診斷和延長肺癌患者的生存率，一直是中國乃至世界肺癌臨床治療中的主要關(guān)注點。

肺癌是中國乃至世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，臨床上分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中絕大多數(shù)是NSCLC，占80%～85%。不同組織亞型、驅(qū)動基因?qū)е碌腘SCLC患者對于同一治療方式會產(chǎn)生不同的治療效果和預(yù)后。對于多數(shù)早期NSCLC患者，手術(shù)切除腫瘤仍是首選的治療方式。晚期NSCLC患者，病灶發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)無法達(dá)到預(yù)期的治療效果。因此對NSCLC進行準(zhǔn)確分期、確定亞型、分析分子標(biāo)記物以及驅(qū)動基因，選擇合適的治療手段和靶向藥物是晚期NSCLC合理且更有效的治療策略。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，接受了靶向藥物和免疫治療的NSCLC患者預(yù)后得到改善，生存期得以延長。

為確?；颊甙邢蛴盟幇踩椭委熜Ч?，伴隨診斷(companion diagnostic，CD)應(yīng)運而生。伴隨診斷是一種體外診斷技術(shù)，可提供安全有效的信息為患者藥物和治療方案的選擇提供依據(jù)，并且?guī)椭t(yī)護人員確定治療對患者的獲益是否超過潛在的副作用或風(fēng)險。伴隨診斷的優(yōu)勢概括來講，具有以下兩點：①可以幫助醫(yī)生充分了解患者信息，制定最佳治療方案；②可以幫助患者規(guī)避用藥風(fēng)險，節(jié)省大量開支，降低醫(yī)療成本。本文主要闡述當(dāng)前NSCLC伴隨診斷中的分子標(biāo)記物和相關(guān)的檢測手段。

1 分子生物標(biāo)記物

根據(jù)最新版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network，NCCN)非小細(xì)胞肺癌治療指南，將表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)、肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROSproto-oncogene1，receptortyrosine kinase，ROS1)、鼠類肉瘤病毒基因同源體B(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF)、免疫治療靶點程序性死亡配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶(neurotrophic receptor kinase，NTRK)納入常規(guī)臨床分子檢測，并建議檢測新的分子靶標(biāo)間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變(mesenchymal-epithelial transition，MET)、原癌基因(proto-oncogene，RET)、人表皮生長因子受體-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)及腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden，TMB)以評估不同人群對不同靶向藥物的藥敏性及預(yù)后。

1.1 臨床檢測分子標(biāo)記物

EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，在細(xì)胞膜上表達(dá)。正常情況下，EGFR胞外端與配體結(jié)合形成二聚體，胞內(nèi)端與ATP結(jié)合后發(fā)生磷酸化，然后激活多種下游信號通路，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)等信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和發(fā)育等多種生理過程。EGFR突變會造成EGFR結(jié)構(gòu)域的活化，異常激活下游信號通路，促使腫瘤細(xì)胞惡性增殖。EGFR突變常見于腫瘤細(xì)胞中，包括NSCLC，在亞洲NSCLC患者中，EGFR突變約占50%，且EGFR的突變多發(fā)生在18～21號外顯子上，目前已經(jīng)檢測到的EGFR突變約70余種。多種小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)通過阻斷EGFR信號向下游信號通路的傳遞，用于NSCLC的治療。

ALK是NSCLC的驅(qū)動基因之一，有1%～7%的NSCLC患者中會出現(xiàn)ALK重排，目前臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種異常基因重排，ALK-EML4重排是NSCLC中最常見的類型。臨床研究發(fā)現(xiàn)ALK重排的NSCLC患者對EGFR-TKI具有耐藥性。

BRAF蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，有1%～2%的NSCLC患者表現(xiàn)為

BARF

基因突變，

BRAF

V600E是最常見的突變亞型，臨床研究發(fā)現(xiàn)同時出現(xiàn)

BARF

突變、

EGFR

突變、

ALK

重排和

ROS1

重排，在NSCLC患者中比較罕見。

ROS1也是一種受體型酪氨酸激酶。與EGFR類似，ROS1重排后會導(dǎo)致下游信號通路持續(xù)激活，促使細(xì)胞惡性增殖。有1%～2%的NSCLC患者會表現(xiàn)出ROS1重排，且多數(shù)出現(xiàn)在EGFR突變、KRAS突變和ALK重排3者皆是陰性的患者中。

KRAS是GTPase活性的G蛋白，是MAP/ERK途徑的一部分。

KRAS

基因突變驅(qū)動的NSCLC患者人數(shù)僅次于

EGFR

基因突變患者，是NSCLC的第二大驅(qū)動基因，

KRAS

突變狀態(tài)也預(yù)示著EGFR-TKI類藥物缺乏療效。

KRAS

突變通常不會與

EGFR

、

ROS1

、

BRAF

和

ALK

基因變異重疊。因此，

KRAS

突變檢測可能會識別出無法從進一步的分子檢測中受益的患者。靶向治療目前尚不能用于具有

KRAS

突變的患者。

PD-L1是NSCLC的免疫篩查點，腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1蛋白與T細(xì)胞上的程序性死亡受體(programmed cell death 1，PD1)結(jié)合，阻止T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別?；谝陨蠙C制，NSCLC的免疫療法是靶向藥物通過競爭結(jié)合PD-L1/PD-1免疫位點，激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞，恢復(fù)患者的免疫系統(tǒng)，使其可以被正常激活。

1.2 其他相關(guān)分子標(biāo)志物

隨著跨學(xué)科研究的推進，新的NSCLC驅(qū)動基因被發(fā)現(xiàn)，成為潛在的分子治療靶標(biāo)，如

ERBB2

突變、

RET

基因融合、高水平MET擴增腫瘤突變負(fù)擔(dān)(TMB)均是NSCLC新的驅(qū)動基因。盡管NCCN指南建議可將上述標(biāo)志物作為NSCLC晚期患者生物標(biāo)志物的篩查范圍，但這些新的生物標(biāo)記物目前廣泛應(yīng)用到實際臨床檢測中仍需要大量的臨床試驗。

2 生物標(biāo)志物檢測方法

就目前分子標(biāo)記物的檢測方法看，盡管同一分子標(biāo)志物可以用不同的方法進行檢測，但不同檢測技術(shù)的成本、檢測靈敏度不同(表1)。臨床應(yīng)用可根據(jù)NSCLC患者的具體情況，選擇合適的檢測技術(shù)。

表1 NCCN推薦的非小細(xì)胞肺癌分子靶標(biāo)的主要檢測方法

免疫組化(immunohistochemistry，IHC)檢測方法可檢測某個基因的全蛋白表達(dá)，可以檢測新鮮腫瘤組織、石蠟組織、胸腹水等不同來源的樣本，具有檢測靈敏度高，檢測周期短且檢測成本相對比較低等優(yōu)勢。但免疫組化檢測是一種半定量檢測技術(shù)，檢測結(jié)果受抗體質(zhì)量影響很大，對抗原表達(dá)程度的判斷主要通過人眼識別，主觀因素影響大。隨著其他技術(shù)的發(fā)展，IHC多用于分子標(biāo)記物PD-L1的檢測。

最新版的美國病理學(xué)家聯(lián)合學(xué)會(CAP)/國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)/分子病理學(xué)協(xié)會(AMP)肺癌治療指南推薦使用具有高靈敏度和特異性的克隆號為5A4和D5F3的ALK抗體檢測。其中NCCN指南建議可采用IHC的方法快速初篩評估

ALK

重排情況，后續(xù)用熒光原位雜交(fluorescence

in situ

hybridization，F(xiàn)ISH)確認(rèn)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的利用IHC方法檢測ALK重排的[D5F3]CDx Assay試劑盒無需后續(xù)FISH判斷。PD-L1的檢測尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但NCCN推薦使用FDA批準(zhǔn)的4個檢測試劑Ventana PD-L1 SP263測定法、Dako 28-8 PharmDx、22C3 PharmDx和Ventana PD-L1 SP142測定。FISH可用于檢測

ALK

重排、

ROS1

基因融合和

NTRT

基因融合。FISH可以檢測肺癌新鮮組織、石蠟組織、細(xì)胞懸液等多種來源的樣本，具有檢測周期短、特異性高、結(jié)果易于觀察的優(yōu)勢。但缺點是FISH探針的設(shè)計需要明確待測基因的檢測位點，因此FISH只能定性檢測到目的基因重排。并且較多的測試步驟容易使信號丟失，造成假陰性結(jié)果。FISH作為檢測

ALK

重排的金標(biāo)準(zhǔn)，是NCCN治療指南和CAP/IASLC/AMP肺癌治療指南推薦的檢測

ALK

重排方法之一。NCCN推薦使用FDA批準(zhǔn)的雅培公司的Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit評估

ALK

重排情況。一代測序Sanger測序法可以檢測

EGFR

突變和

BRAF

突變，是目前臨床上檢測

EGFR

突變的常用方法之一。Sanger測序法可以檢測新鮮組織和石蠟組織切片。盡管Sanger測序可以檢測已知突變位點和未知突變，但是檢測靈敏度相對較低，通常只有超過20%的突變才可以被檢測到，但檢測成本低、周期短是其最大的優(yōu)勢，被認(rèn)為是NSCLC中檢測

EGFR

突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是目前臨床上用于檢測

EGFR

突變最通用的方法之一。

二代測序(next-generation sequencing，NGS)具有高通量的測序特點，可以同時檢測除PD-L1外的所有分子標(biāo)志物的已知和未知點突變、重排或基因融合，可檢測標(biāo)本遺傳變化，篩選新的驅(qū)動基因或生物標(biāo)志物。NGS的靈敏度比Sanger測序高得多，并且根據(jù)測序深度，原則上可以檢測到低至0.1%的等位基因頻率。但是NGS周期長，通常需要10～20個工作日，且成本較高。目前NGS多用于檢測多個指標(biāo)的腫瘤方案，為患者選擇個性化治療方案提供信息。

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)可用來檢測基因突變，檢測樣本可以是新鮮組織、血清和石蠟組織等多種來源的核酸，操作簡單、檢測成本低、周期短、結(jié)果可視。與Sanger測試法類似，qPCR只能檢測已知突變，但檢測時間遠(yuǎn)低于Sanger測序。利用qPCR方法檢測NSCLC的

EGFR

突變、ALK重排、

ROS1

基因融合、

NTRT

基因融合在臨床上被廣泛應(yīng)用。突變擴增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，PCR-ARMS)可檢測新鮮組織、血清、胸腹水和保存少于2年的石蠟組織，優(yōu)勢是特異性高、檢測時間短、靈敏度遠(yuǎn)高于Sanger測序法。與qPCR相比，PCR-AMRS檢測基因突變只能對已知突變進行檢測，無法檢測未知突變。PCR-ARMS也是NCCN指南和最新版CAP/IASLC/AMP指南推薦的檢測

EGFR

已知突變的方法之一，在臨床上檢測上得到廣泛應(yīng)用。

3 伴隨診斷市場現(xiàn)狀

最早出現(xiàn)的伴隨診斷產(chǎn)品是1998年FDA批準(zhǔn)的一種名為赫賽汀的靶向藥物產(chǎn)品。盡管目前該領(lǐng)域中已經(jīng)有相當(dāng)多的生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的知名企業(yè)包括Dako(安捷倫科技)、Qiagen公司、羅氏、雅培、Ventana醫(yī)療、生物梅里埃(bioMerieux)、Myriad Genetics、Resonance Health、及Leica Microsystems等正與制藥公司合作開發(fā)伴隨診斷試劑盒，但事實上伴隨診斷市場仍然處于發(fā)展階段，大量產(chǎn)品處于研發(fā)時期。美國是目前伴隨診斷產(chǎn)品和技術(shù)最先進的國家，占伴隨診斷市場的30%。

腫瘤學(xué)是伴隨診斷市場中創(chuàng)收最高的疾病領(lǐng)域，多種用于各類癌癥生物標(biāo)志物檢測的伴隨診斷產(chǎn)品被開發(fā)，截止到2020年1月，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了38個伴隨診斷產(chǎn)品，與腫瘤相關(guān)的高達(dá)36個，涉及包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤如乳腺癌、NSCLC、卵巢癌、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病等多種靶向藥物的診斷。其中用于NSCLC的伴隨診斷試劑共9種，涉及15種靶向藥物的伴隨診斷(表2)。

中國尚無明確的關(guān)于伴隨診斷的定義或法規(guī)條文，國內(nèi)審批通過的NSCLC伴隨診斷產(chǎn)品共3個，

ALK

基因斷裂熒光原位雜交法檢測試劑盒(Vysis ALK break apart FISH probe kit)、PD-L1免疫組織化學(xué)法檢測試劑盒(PD-L1 IHC 22C3 pharmDx)和新一代cobasEGFR突變檢測試劑盒(cobasEGFR mutation test v2)，以體外診斷試劑的名目歸類在3類醫(yī)療器械中。目前國內(nèi)獲批上市腫瘤相關(guān)的3類醫(yī)療器械診斷試劑盒約800種，其中與NSCLC相關(guān)的檢測試劑盒最多，這意味著NSCLC的伴隨診斷在中國有潛在的巨大市場。

4 伴隨診斷面臨的挑戰(zhàn)

目前FDA批準(zhǔn)的NSCLC伴隨診斷多數(shù)只針對單一分子指標(biāo)，并不能滿足患者的實際臨床治療需求。隨著臨床上NSCLC聯(lián)合治療的運用，越來越多的潛在生物靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)，促進了多指標(biāo)的NSCLC伴隨診斷產(chǎn)品的發(fā)展，例如Foundation One CDx，利用NGS可以同時檢測

EGFR

突變、

ALK

和

ROS1

重排及

BRAF

突變。NSCLC的臨床診斷技術(shù)在不斷革新，新的伴隨診斷產(chǎn)品的發(fā)展必將結(jié)合不同的技術(shù)方法(如多重IHC分析、NGS測序、代謝組學(xué)等)，整合多種檢測結(jié)果的信息，為患者更精準(zhǔn)的個性化治療方案提供幫助。然而如何整合這些技術(shù)，提供可靠的整合信息，是包括NSCLC在內(nèi)的所有伴隨診斷面臨的一大難題。伴隨診斷試劑因為使用不同的診斷技術(shù)、試劑和平臺，與使用單一技術(shù)的檢測試劑價格會有所不同。大多數(shù)情況下，伴隨診斷價格昂貴，且未納入醫(yī)保。因此，高昂的價格促使人們選擇那些有相等或可接受的靈敏度和特異性的替代檢測方法和診斷試劑盒。如2013年FDA批準(zhǔn)上市的檢測

EGFR

突變的伴隨診斷試劑therascreen EGFR RGQ PCR，其利用PCR方法檢測

EGFR

突變陽性的NSCLC患者適宜接受吉非替尼、阿法替尼、達(dá)克替尼這3種藥物治療。然而實際臨床中，NCCN推薦的檢測

EGFR

突變的方法包括但不限于PCR，用于體外診斷檢測

EGFR

突變的試劑盒多達(dá)數(shù)十種。高昂價格使得NSCLC伴隨診斷試劑的臨床應(yīng)用效果并不理想。生物標(biāo)記物發(fā)展與靶向藥物的發(fā)展不平衡也是伴隨診斷難以廣泛應(yīng)用于臨床的一個問題。FDA批準(zhǔn)的PD-L1伴隨診斷體系Ventana PD-L1 SP142利用IHC方法檢測PD-L1的表達(dá)，PD-L1陽性的患者適宜接受阿替利珠單抗用于免疫治療。但是，實際情況是一些IHC顯示PDL1強陽性的患者并不一定對免疫療法有反應(yīng)，伴隨診斷試劑的完善需要靶向藥物的研發(fā)作支撐。

基于中國的人口基數(shù)、NSCLC的發(fā)病率以及國內(nèi)市場上明確的伴隨診斷產(chǎn)品的空白等原因，中國伴隨診斷的市場發(fā)展?jié)摿薮螅袊胍l(fā)展自己的伴隨診斷產(chǎn)品仍然有實際困難。首先，國內(nèi)沒有明確的伴隨診斷的定義和相關(guān)法規(guī)條文，缺乏有效的市場監(jiān)管體系。其次，伴隨診斷產(chǎn)品對靈敏度和特異性的要求很高，而影響伴隨診斷檢測的結(jié)果較多，包括樣本來源、處理時間、保存方式、操作人員的熟練程度等均可能影響結(jié)果的判定。所以明確定義，制定嚴(yán)格的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，行業(yè)準(zhǔn)則，規(guī)范市場監(jiān)管體系是國內(nèi)伴隨診斷產(chǎn)品發(fā)展首先要解決的問題。

表2 FDA批準(zhǔn)可用于非小細(xì)胞肺癌的伴隨診斷產(chǎn)品[41]

5 總結(jié)與展望

NSCLC作為全球致死率較高的腫瘤，改善預(yù)后、提高患者的生存率一直是臨床關(guān)注的主要問題，而腫瘤異質(zhì)性是NSCLC患者預(yù)后較差的主要原因。隨著人們醫(yī)療意識的提升，檢測手段和靶向藥物的發(fā)展，NSCLC患者的生存率得到了一定程度的改善。伴隨診斷以靶向藥物用藥安全為出發(fā)點，通過多種檢測技術(shù)整合檢測信息，為患者提供較為精確的用藥建議，從而達(dá)到個性化、精準(zhǔn)化醫(yī)療的目的。伴隨診斷可以幫助醫(yī)生充分了解患者信息，疾病進展，為患者制定最佳治療方案，規(guī)避用藥風(fēng)險，達(dá)到節(jié)省開支，降低醫(yī)療成本的作用。對于相關(guān)企業(yè)來講，開發(fā)伴隨診斷產(chǎn)品、明確靶向藥物的應(yīng)用特性，有助于新藥研發(fā)和產(chǎn)品定位，可推動企業(yè)擴大市場，帶來更多利潤。盡管中國伴隨診斷市場的開發(fā)仍有多種實際困難，但伴隨診斷的研發(fā)應(yīng)用可以使多方獲益，是診斷市場發(fā)展的一大趨勢。