趙子慧，王緒華

(天津康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，天津 300300)

國(guó)家癌癥中心發(fā)布的中國(guó)2019年最新癌癥報(bào)告顯示，在中國(guó)每10萬人口中有57人患有肺癌，其中每年約有63萬人死于肺癌，并且患病趨勢(shì)逐年遞增。隨著國(guó)民健康意識(shí)的增強(qiáng)和螺旋CT等早期篩查技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，在新增肺癌患者中，首次確診為中晚期肺癌的比例有所下降。但腫瘤的異質(zhì)性、晚期治療效果不佳、預(yù)后差等因素造成肺癌患者5年相對(duì)生存率僅16.1%，且據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)肺癌人口的死亡數(shù)高于世界平均水平。如何有效進(jìn)行早期診斷和延長(zhǎng)肺癌患者的生存率，一直是中國(guó)乃至世界肺癌臨床治療中的主要關(guān)注點(diǎn)。

肺癌是中國(guó)乃至世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，臨床上分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中絕大多數(shù)是NSCLC，占80%～85%。不同組織亞型、驅(qū)動(dòng)基因?qū)е碌腘SCLC患者對(duì)于同一治療方式會(huì)產(chǎn)生不同的治療效果和預(yù)后。對(duì)于多數(shù)早期NSCLC患者，手術(shù)切除腫瘤仍是首選的治療方式。晚期NSCLC患者，病灶發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)無法達(dá)到預(yù)期的治療效果。因此對(duì)NSCLC進(jìn)行準(zhǔn)確分期、確定亞型、分析分子標(biāo)記物以及驅(qū)動(dòng)基因，選擇合適的治療手段和靶向藥物是晚期NSCLC合理且更有效的治療策略。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，接受了靶向藥物和免疫治療的NSCLC患者預(yù)后得到改善，生存期得以延長(zhǎng)。

為確?；颊甙邢蛴盟幇踩椭委熜Ч?，伴隨診斷(companion diagnostic，CD)應(yīng)運(yùn)而生。伴隨診斷是一種體外診斷技術(shù)，可提供安全有效的信息為患者藥物和治療方案的選擇提供依據(jù)，并且?guī)椭t(yī)護(hù)人員確定治療對(duì)患者的獲益是否超過潛在的副作用或風(fēng)險(xiǎn)。伴隨診斷的優(yōu)勢(shì)概括來講，具有以下兩點(diǎn)：①可以幫助醫(yī)生充分了解患者信息，制定最佳治療方案；②可以幫助患者規(guī)避用藥風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省大量開支，降低醫(yī)療成本。本文主要闡述當(dāng)前NSCLC伴隨診斷中的分子標(biāo)記物和相關(guān)的檢測(cè)手段。

1 分子生物標(biāo)記物

根據(jù)最新版美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network，NCCN)非小細(xì)胞肺癌治療指南，將表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)、肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROSproto-oncogene1，receptortyrosine kinase，ROS1)、鼠類肉瘤病毒基因同源體B(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF)、免疫治療靶點(diǎn)程序性死亡配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶(neurotrophic receptor kinase，NTRK)納入常規(guī)臨床分子檢測(cè)，并建議檢測(cè)新的分子靶標(biāo)間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變(mesenchymal-epithelial transition，MET)、原癌基因(proto-oncogene，RET)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)及腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden，TMB)以評(píng)估不同人群對(duì)不同靶向藥物的藥敏性及預(yù)后。

1.1 臨床檢測(cè)分子標(biāo)記物

EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，在細(xì)胞膜上表達(dá)。正常情況下，EGFR胞外端與配體結(jié)合形成二聚體，胞內(nèi)端與ATP結(jié)合后發(fā)生磷酸化，然后激活多種下游信號(hào)通路，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和發(fā)育等多種生理過程。EGFR突變會(huì)造成EGFR結(jié)構(gòu)域的活化，異常激活下游信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞惡性增殖。EGFR突變常見于腫瘤細(xì)胞中，包括NSCLC，在亞洲NSCLC患者中，EGFR突變約占50%，且EGFR的突變多發(fā)生在18～21號(hào)外顯子上，目前已經(jīng)檢測(cè)到的EGFR突變約70余種。多種小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)通過阻斷EGFR信號(hào)向下游信號(hào)通路的傳遞，用于NSCLC的治療。

ALK是NSCLC的驅(qū)動(dòng)基因之一，有1%～7%的NSCLC患者中會(huì)出現(xiàn)ALK重排，目前臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種異常基因重排，ALK-EML4重排是NSCLC中最常見的類型。臨床研究發(fā)現(xiàn)ALK重排的NSCLC患者對(duì)EGFR-TKI具有耐藥性。

BRAF蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，有1%～2%的NSCLC患者表現(xiàn)為

BARF

基因突變，

BRAF

V600E是最常見的突變亞型，臨床研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)

BARF

突變、

EGFR

突變、

ALK

重排和

ROS1

重排，在NSCLC患者中比較罕見。

ROS1也是一種受體型酪氨酸激酶。與EGFR類似，ROS1重排后會(huì)導(dǎo)致下游信號(hào)通路持續(xù)激活，促使細(xì)胞惡性增殖。有1%～2%的NSCLC患者會(huì)表現(xiàn)出ROS1重排，且多數(shù)出現(xiàn)在EGFR突變、KRAS突變和ALK重排3者皆是陰性的患者中。

KRAS是GTPase活性的G蛋白，是MAP/ERK途徑的一部分。

KRAS

基因突變驅(qū)動(dòng)的NSCLC患者人數(shù)僅次于

EGFR

基因突變患者，是NSCLC的第二大驅(qū)動(dòng)基因，

KRAS

突變狀態(tài)也預(yù)示著EGFR-TKI類藥物缺乏療效。

KRAS

突變通常不會(huì)與

EGFR

、

ROS1

、

BRAF

和

ALK

基因變異重疊。因此，

KRAS

突變檢測(cè)可能會(huì)識(shí)別出無法從進(jìn)一步的分子檢測(cè)中受益的患者。靶向治療目前尚不能用于具有

KRAS

突變的患者。

PD-L1是NSCLC的免疫篩查點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1蛋白與T細(xì)胞上的程序性死亡受體(programmed cell death 1，PD1)結(jié)合，阻止T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別?；谝陨蠙C(jī)制，NSCLC的免疫療法是靶向藥物通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PD-L1/PD-1免疫位點(diǎn)，激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞，恢復(fù)患者的免疫系統(tǒng)，使其可以被正常激活。

1.2 其他相關(guān)分子標(biāo)志物

隨著跨學(xué)科研究的推進(jìn)，新的NSCLC驅(qū)動(dòng)基因被發(fā)現(xiàn)，成為潛在的分子治療靶標(biāo)，如

ERBB2

突變、

RET

基因融合、高水平MET擴(kuò)增腫瘤突變負(fù)擔(dān)(TMB)均是NSCLC新的驅(qū)動(dòng)基因。盡管NCCN指南建議可將上述標(biāo)志物作為NSCLC晚期患者生物標(biāo)志物的篩查范圍，但這些新的生物標(biāo)記物目前廣泛應(yīng)用到實(shí)際臨床檢測(cè)中仍需要大量的臨床試驗(yàn)。

2 生物標(biāo)志物檢測(cè)方法

就目前分子標(biāo)記物的檢測(cè)方法看，盡管同一分子標(biāo)志物可以用不同的方法進(jìn)行檢測(cè)，但不同檢測(cè)技術(shù)的成本、檢測(cè)靈敏度不同(表1)。臨床應(yīng)用可根據(jù)NSCLC患者的具體情況，選擇合適的檢測(cè)技術(shù)。

表1 NCCN推薦的非小細(xì)胞肺癌分子靶標(biāo)的主要檢測(cè)方法

免疫組化(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)方法可檢測(cè)某個(gè)基因的全蛋白表達(dá)，可以檢測(cè)新鮮腫瘤組織、石蠟組織、胸腹水等不同來源的樣本，具有檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)周期短且檢測(cè)成本相對(duì)比較低等優(yōu)勢(shì)。但免疫組化檢測(cè)是一種半定量檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果受抗體質(zhì)量影響很大，對(duì)抗原表達(dá)程度的判斷主要通過人眼識(shí)別，主觀因素影響大。隨著其他技術(shù)的發(fā)展，IHC多用于分子標(biāo)記物PD-L1的檢測(cè)。

最新版的美國(guó)病理學(xué)家聯(lián)合學(xué)會(huì)(CAP)/國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)/分子病理學(xué)協(xié)會(huì)(AMP)肺癌治療指南推薦使用具有高靈敏度和特異性的克隆號(hào)為5A4和D5F3的ALK抗體檢測(cè)。其中NCCN指南建議可采用IHC的方法快速初篩評(píng)估

ALK

重排情況，后續(xù)用熒光原位雜交(fluorescence

in situ

hybridization，F(xiàn)ISH)確認(rèn)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的利用IHC方法檢測(cè)ALK重排的[D5F3]CDx Assay試劑盒無需后續(xù)FISH判斷。PD-L1的檢測(cè)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但NCCN推薦使用FDA批準(zhǔn)的4個(gè)檢測(cè)試劑Ventana PD-L1 SP263測(cè)定法、Dako 28-8 PharmDx、22C3 PharmDx和Ventana PD-L1 SP142測(cè)定。FISH可用于檢測(cè)

ALK

重排、

ROS1

基因融合和

NTRT

基因融合。FISH可以檢測(cè)肺癌新鮮組織、石蠟組織、細(xì)胞懸液等多種來源的樣本，具有檢測(cè)周期短、特異性高、結(jié)果易于觀察的優(yōu)勢(shì)。但缺點(diǎn)是FISH探針的設(shè)計(jì)需要明確待測(cè)基因的檢測(cè)位點(diǎn)，因此FISH只能定性檢測(cè)到目的基因重排。并且較多的測(cè)試步驟容易使信號(hào)丟失，造成假陰性結(jié)果。FISH作為檢測(cè)

ALK

重排的金標(biāo)準(zhǔn)，是NCCN治療指南和CAP/IASLC/AMP肺癌治療指南推薦的檢測(cè)

ALK

重排方法之一。NCCN推薦使用FDA批準(zhǔn)的雅培公司的Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit評(píng)估

ALK

重排情況。一代測(cè)序Sanger測(cè)序法可以檢測(cè)

EGFR

突變和

BRAF

突變，是目前臨床上檢測(cè)

EGFR

突變的常用方法之一。Sanger測(cè)序法可以檢測(cè)新鮮組織和石蠟組織切片。盡管Sanger測(cè)序可以檢測(cè)已知突變位點(diǎn)和未知突變，但是檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，通常只有超過20%的突變才可以被檢測(cè)到，但檢測(cè)成本低、周期短是其最大的優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是NSCLC中檢測(cè)

EGFR

突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是目前臨床上用于檢測(cè)

EGFR

突變最通用的方法之一。

二代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)具有高通量的測(cè)序特點(diǎn)，可以同時(shí)檢測(cè)除PD-L1外的所有分子標(biāo)志物的已知和未知點(diǎn)突變、重排或基因融合，可檢測(cè)標(biāo)本遺傳變化，篩選新的驅(qū)動(dòng)基因或生物標(biāo)志物。NGS的靈敏度比Sanger測(cè)序高得多，并且根據(jù)測(cè)序深度，原則上可以檢測(cè)到低至0.1%的等位基因頻率。但是NGS周期長(zhǎng)，通常需要10～20個(gè)工作日，且成本較高。目前NGS多用于檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)的腫瘤方案，為患者選擇個(gè)性化治療方案提供信息。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)可用來檢測(cè)基因突變，檢測(cè)樣本可以是新鮮組織、血清和石蠟組織等多種來源的核酸，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、周期短、結(jié)果可視。與Sanger測(cè)試法類似，qPCR只能檢測(cè)已知突變，但檢測(cè)時(shí)間遠(yuǎn)低于Sanger測(cè)序。利用qPCR方法檢測(cè)NSCLC的

EGFR

突變、ALK重排、

ROS1

基因融合、

NTRT

基因融合在臨床上被廣泛應(yīng)用。突變擴(kuò)增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，PCR-ARMS)可檢測(cè)新鮮組織、血清、胸腹水和保存少于2年的石蠟組織，優(yōu)勢(shì)是特異性高、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度遠(yuǎn)高于Sanger測(cè)序法。與qPCR相比，PCR-AMRS檢測(cè)基因突變只能對(duì)已知突變進(jìn)行檢測(cè)，無法檢測(cè)未知突變。PCR-ARMS也是NCCN指南和最新版CAP/IASLC/AMP指南推薦的檢測(cè)

EGFR

已知突變的方法之一，在臨床上檢測(cè)上得到廣泛應(yīng)用。

3 伴隨診斷市場(chǎng)現(xiàn)狀

最早出現(xiàn)的伴隨診斷產(chǎn)品是1998年FDA批準(zhǔn)的一種名為赫賽汀的靶向藥物產(chǎn)品。盡管目前該領(lǐng)域中已經(jīng)有相當(dāng)多的生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的知名企業(yè)包括Dako(安捷倫科技)、Qiagen公司、羅氏、雅培、Ventana醫(yī)療、生物梅里埃(bioMerieux)、Myriad Genetics、Resonance Health、及Leica Microsystems等正與制藥公司合作開發(fā)伴隨診斷試劑盒，但事實(shí)上伴隨診斷市場(chǎng)仍然處于發(fā)展階段，大量產(chǎn)品處于研發(fā)時(shí)期。美國(guó)是目前伴隨診斷產(chǎn)品和技術(shù)最先進(jìn)的國(guó)家，占伴隨診斷市場(chǎng)的30%。

腫瘤學(xué)是伴隨診斷市場(chǎng)中創(chuàng)收最高的疾病領(lǐng)域，多種用于各類癌癥生物標(biāo)志物檢測(cè)的伴隨診斷產(chǎn)品被開發(fā)，截止到2020年1月，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了38個(gè)伴隨診斷產(chǎn)品，與腫瘤相關(guān)的高達(dá)36個(gè)，涉及包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤如乳腺癌、NSCLC、卵巢癌、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病等多種靶向藥物的診斷。其中用于NSCLC的伴隨診斷試劑共9種，涉及15種靶向藥物的伴隨診斷(表2)。

中國(guó)尚無明確的關(guān)于伴隨診斷的定義或法規(guī)條文，國(guó)內(nèi)審批通過的NSCLC伴隨診斷產(chǎn)品共3個(gè)，

ALK

基因斷裂熒光原位雜交法檢測(cè)試劑盒(Vysis ALK break apart FISH probe kit)、PD-L1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)試劑盒(PD-L1 IHC 22C3 pharmDx)和新一代cobasEGFR突變檢測(cè)試劑盒(cobasEGFR mutation test v2)，以體外診斷試劑的名目歸類在3類醫(yī)療器械中。目前國(guó)內(nèi)獲批上市腫瘤相關(guān)的3類醫(yī)療器械診斷試劑盒約800種，其中與NSCLC相關(guān)的檢測(cè)試劑盒最多，這意味著NSCLC的伴隨診斷在中國(guó)有潛在的巨大市場(chǎng)。

4 伴隨診斷面臨的挑戰(zhàn)

目前FDA批準(zhǔn)的NSCLC伴隨診斷多數(shù)只針對(duì)單一分子指標(biāo)，并不能滿足患者的實(shí)際臨床治療需求。隨著臨床上NSCLC聯(lián)合治療的運(yùn)用，越來越多的潛在生物靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了多指標(biāo)的NSCLC伴隨診斷產(chǎn)品的發(fā)展，例如Foundation One CDx，利用NGS可以同時(shí)檢測(cè)

EGFR

突變、

ALK

和

ROS1

重排及

BRAF

突變。NSCLC的臨床診斷技術(shù)在不斷革新，新的伴隨診斷產(chǎn)品的發(fā)展必將結(jié)合不同的技術(shù)方法(如多重IHC分析、NGS測(cè)序、代謝組學(xué)等)，整合多種檢測(cè)結(jié)果的信息，為患者更精準(zhǔn)的個(gè)性化治療方案提供幫助。然而如何整合這些技術(shù)，提供可靠的整合信息，是包括NSCLC在內(nèi)的所有伴隨診斷面臨的一大難題。伴隨診斷試劑因?yàn)槭褂貌煌脑\斷技術(shù)、試劑和平臺(tái)，與使用單一技術(shù)的檢測(cè)試劑價(jià)格會(huì)有所不同。大多數(shù)情況下，伴隨診斷價(jià)格昂貴，且未納入醫(yī)保。因此，高昂的價(jià)格促使人們選擇那些有相等或可接受的靈敏度和特異性的替代檢測(cè)方法和診斷試劑盒。如2013年FDA批準(zhǔn)上市的檢測(cè)

EGFR

突變的伴隨診斷試劑therascreen EGFR RGQ PCR，其利用PCR方法檢測(cè)

EGFR

突變陽性的NSCLC患者適宜接受吉非替尼、阿法替尼、達(dá)克替尼這3種藥物治療。然而實(shí)際臨床中，NCCN推薦的檢測(cè)

EGFR

突變的方法包括但不限于PCR，用于體外診斷檢測(cè)

EGFR

突變的試劑盒多達(dá)數(shù)十種。高昂價(jià)格使得NSCLC伴隨診斷試劑的臨床應(yīng)用效果并不理想。生物標(biāo)記物發(fā)展與靶向藥物的發(fā)展不平衡也是伴隨診斷難以廣泛應(yīng)用于臨床的一個(gè)問題。FDA批準(zhǔn)的PD-L1伴隨診斷體系Ventana PD-L1 SP142利用IHC方法檢測(cè)PD-L1的表達(dá)，PD-L1陽性的患者適宜接受阿替利珠單抗用于免疫治療。但是，實(shí)際情況是一些IHC顯示PDL1強(qiáng)陽性的患者并不一定對(duì)免疫療法有反應(yīng)，伴隨診斷試劑的完善需要靶向藥物的研發(fā)作支撐。

基于中國(guó)的人口基數(shù)、NSCLC的發(fā)病率以及國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上明確的伴隨診斷產(chǎn)品的空白等原因，中國(guó)伴隨診斷的市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿薮?，但中?guó)想要發(fā)展自己的伴隨診斷產(chǎn)品仍然有實(shí)際困難。首先，國(guó)內(nèi)沒有明確的伴隨診斷的定義和相關(guān)法規(guī)條文，缺乏有效的市場(chǎng)監(jiān)管體系。其次，伴隨診斷產(chǎn)品對(duì)靈敏度和特異性的要求很高，而影響伴隨診斷檢測(cè)的結(jié)果較多，包括樣本來源、處理時(shí)間、保存方式、操作人員的熟練程度等均可能影響結(jié)果的判定。所以明確定義，制定嚴(yán)格的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，行業(yè)準(zhǔn)則，規(guī)范市場(chǎng)監(jiān)管體系是國(guó)內(nèi)伴隨診斷產(chǎn)品發(fā)展首先要解決的問題。

表2 FDA批準(zhǔn)可用于非小細(xì)胞肺癌的伴隨診斷產(chǎn)品[41]

5 總結(jié)與展望

NSCLC作為全球致死率較高的腫瘤，改善預(yù)后、提高患者的生存率一直是臨床關(guān)注的主要問題，而腫瘤異質(zhì)性是NSCLC患者預(yù)后較差的主要原因。隨著人們醫(yī)療意識(shí)的提升，檢測(cè)手段和靶向藥物的發(fā)展，NSCLC患者的生存率得到了一定程度的改善。伴隨診斷以靶向藥物用藥安全為出發(fā)點(diǎn)，通過多種檢測(cè)技術(shù)整合檢測(cè)信息，為患者提供較為精確的用藥建議，從而達(dá)到個(gè)性化、精準(zhǔn)化醫(yī)療的目的。伴隨診斷可以幫助醫(yī)生充分了解患者信息，疾病進(jìn)展，為患者制定最佳治療方案，規(guī)避用藥風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)到節(jié)省開支，降低醫(yī)療成本的作用。對(duì)于相關(guān)企業(yè)來講，開發(fā)伴隨診斷產(chǎn)品、明確靶向藥物的應(yīng)用特性，有助于新藥研發(fā)和產(chǎn)品定位，可推動(dòng)企業(yè)擴(kuò)大市場(chǎng)，帶來更多利潤(rùn)。盡管中國(guó)伴隨診斷市場(chǎng)的開發(fā)仍有多種實(shí)際困難，但伴隨診斷的研發(fā)應(yīng)用可以使多方獲益，是診斷市場(chǎng)發(fā)展的一大趨勢(shì)。