于志強(qiáng)，張華允，馬中春

(寧波海關(guān)技術(shù)中心/寧波中盛產(chǎn)品檢測(cè)有限公司，浙江 寧波 315100)

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，新藥的研發(fā)項(xiàng)目也隨之迅速增多。新藥對(duì)心臟的毒副作用是其在開(kāi)發(fā)過(guò)程中被淘汰的重要原因之一。因此，新藥的心臟毒性檢測(cè)在新藥的研發(fā)過(guò)程中尤為重要。

新藥心臟毒性是指新藥在相對(duì)較小的劑量和相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)對(duì)心臟生理功能產(chǎn)生影響或者對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷的藥效反應(yīng)。能夠引起心臟毒性的藥物主要包括直接抑制或者損傷心肌細(xì)胞的藥物，例如蒽環(huán)類的阿霉素、柔紅霉素等；引起液體潴留的藥物，例如噻唑烷二酮類等；烷化劑，例如環(huán)磷酰胺等；抗心力失常和鈣通道阻滯劑等藥物。藥物對(duì)心肌細(xì)胞的毒性機(jī)制復(fù)雜，并能夠引起心肌發(fā)生不可逆的損傷。但目前針對(duì)新藥安全評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法主要是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不能明確人用藥后的毒性癥狀和毒性劑量，同時(shí)不符合“3R”原則。因此尋找能夠準(zhǔn)確，快速，敏感反映出外源性化合物對(duì)心肌造成損傷的檢測(cè)方法是近年來(lái)科研人員的研究重點(diǎn)。

本研究擬針對(duì)新藥中化合物對(duì)心臟造成的毒性作用建立一項(xiàng)應(yīng)用人源心肌細(xì)胞的體外檢測(cè)方法，以期為新藥研發(fā)提供一種準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)手段。為新藥的開(kāi)發(fā)、臨床前實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量檢測(cè)過(guò)程提供有效手段和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人源心肌細(xì)胞(hPSC-CMs)，購(gòu)自寧波醫(yī)諾生物科技有限公司。他莫昔芬和氟哌利多均購(gòu)自Sigma公司。美國(guó)食品及藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)的 Comprehensive

in vitro

Proarrhythmia Assay(CiPA)項(xiàng)目將他莫昔芬歸類為低風(fēng)險(xiǎn)類別，將氟哌利多歸類為中風(fēng)險(xiǎn)類別；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自Hy-Clone公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

96孔板購(gòu)自Costar公司；CO培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Binder公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自Biox公司；超速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hermle公司；CardioExcyte96購(gòu)自德國(guó)Nanion公司。

1.3 心肌毒性測(cè)定

將hPSC-CMs復(fù)蘇，傳代培養(yǎng)3 d后接種于提前用鋪板液包被好的電極矩陣96孔板中，hPSC-CMs培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，由于存在邊緣效應(yīng)和大概30%左右的損失率(包含接種后不跳或者基線不穩(wěn))，所以培養(yǎng)板在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候只選擇中間的孔。如果中間有部分不符合要求的孔可以從外圈選擇，這樣可以保證實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一性。48 h后按每孔200 μL全部置換細(xì)胞培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)分為加藥實(shí)驗(yàn)組和不加藥對(duì)照組。加藥實(shí)驗(yàn)組對(duì)于每個(gè)測(cè)試樣本，設(shè)置3個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，他莫昔芬濃度分別為0.33、1和3 μmol/mL，氟哌利多分別為0.11、0.33和1 μmol/mL。不加藥對(duì)照組給予等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。加藥后1、2、3、6、9、12、18、24、30、36、42 和 48 h 采用CardioExcyte96設(shè)備檢測(cè)心肌細(xì)胞的場(chǎng)電位時(shí)程(field potential duration，F(xiàn)PD)和收縮頻率。場(chǎng)電位時(shí)程主要是指可興奮組織或細(xì)胞受到閾上刺激時(shí)，在靜息膜電位基礎(chǔ)上發(fā)生的快速、去極化引發(fā)的動(dòng)作電位，其中動(dòng)作電位從0相至3相結(jié)束的時(shí)程稱為動(dòng)作電位時(shí)程。心臟收縮的頻率也稱之為安靜時(shí)心臟跳動(dòng)的次數(shù)，簡(jiǎn)稱為心率。心率與年齡有直接關(guān)系，年齡越小，由于新陳代謝比較快，交感神經(jīng)的活性比較高，心臟收縮的頻率較快。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出各組數(shù)據(jù)的平均數(shù)和方差，在Excel中輸入FPD(Max)和收縮頻率數(shù)據(jù)，以FPD(Max)和收縮頻率值為縱坐標(biāo)，時(shí)間含量為橫坐標(biāo)建立直角坐標(biāo)系，繪制FPD(Max)和收縮頻率隨時(shí)間變化曲線。

2 結(jié)果

2.1 他莫昔芬對(duì)心肌毒性測(cè)試結(jié)果

2.1.1 他莫昔芬對(duì)hPSC-CMs細(xì)胞FPD的作用

當(dāng)添加3 μmol/mL的他莫昔芬處理3 h時(shí)，F(xiàn)PD(Max)數(shù)值降為0，結(jié)合收縮頻率數(shù)據(jù)可知出現(xiàn)心肌細(xì)胞停跳現(xiàn)象，18 h時(shí)，心肌細(xì)胞復(fù)跳。對(duì)照組0～48 h FPD(Max)數(shù)值在0.179～0.264范圍內(nèi)。1和0.33 μmol/mL他莫昔芬的FPD值趨勢(shì)與對(duì)照組基本保持一致(圖1)。

圖1 他莫昔芬對(duì)hPSC-CMs細(xì)胞FPD的作用曲線圖

2.1.2 他莫昔芬對(duì)hPSC-CMs收縮頻率的作用

當(dāng)添加3 μmol/mL的他莫昔芬處理3 h時(shí)，結(jié)合FPD(Max)數(shù)據(jù)，出現(xiàn)心肌細(xì)胞停跳現(xiàn)象，反應(yīng)為收縮頻率數(shù)值降為0，18 h時(shí)，心肌細(xì)胞復(fù)跳。對(duì)照組收縮頻率在64.86～73.82次/分鐘范圍內(nèi)。1 μmol/mL他莫昔芬處理下的心肌細(xì)胞收縮頻率低于對(duì)照組；0.33 μmol/mL他莫昔芬處理下的心肌細(xì)胞收縮頻率趨勢(shì)與對(duì)照組基本保持一致(圖2)。

圖2 他莫昔芬對(duì)hPSC-CMs收縮頻率的作用曲線圖

2.2 氟哌利多心肌毒性測(cè)試結(jié)果

2.2.1 氟哌利多對(duì)hPSC-CMs FPD的作用

心肌細(xì)胞FPD值對(duì)氟哌利多具有濃度依賴性，濃度越高，F(xiàn)PD(Max)數(shù)值越大，即QT間期長(zhǎng)度越長(zhǎng)。對(duì)照組0～48 h FPD(Max)數(shù)值在0.179～0.243范圍內(nèi)。24 h時(shí)進(jìn)行全換液，換液后各濃度與對(duì)照組基本一致(圖3)。

圖3 氟哌利多對(duì)hPSC-CMs FPD的作用曲線圖

2.2.2 氟哌利多對(duì)hPSC-CMs收縮頻率的作用

心肌細(xì)胞收縮頻率值對(duì)氟哌利多具有濃度依賴性，濃度越高，收縮頻率數(shù)值越小，結(jié)合FPD(Max)數(shù)據(jù)，氟哌利多具有降低心肌細(xì)胞收縮頻率，延長(zhǎng)QT間期的作用。對(duì)照組收縮頻率在63.49～76.93次/分鐘范圍內(nèi)。24 h時(shí)進(jìn)行全換液，換液后各濃度處理的心肌細(xì)胞均有一定程度的恢復(fù)，但氟哌利多0.33和1 μmol/mL處理組收縮頻率低于對(duì)照組，氟哌利多0.11 μmol/mL處理組的收縮頻率與對(duì)照組基本保持一致(圖4)。

圖4 氟哌利多對(duì)hPSC-CMs收縮頻率的作用曲線圖

3 討論

現(xiàn)階段，新藥的心臟毒性主流檢測(cè)方法是應(yīng)用動(dòng)物模型。動(dòng)物模型不僅檢測(cè)成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、效率低，并且與人體存在基因和生理等方面的種屬差異。例如，正常人體心臟搏動(dòng)頻率為60～100次/分鐘，而小鼠靜息狀態(tài)下的心率是人類的10倍，因此其在預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性反應(yīng)方面必然與人體存在較大偏差。因此進(jìn)行新藥評(píng)價(jià)最為準(zhǔn)確的方法就是采用人體心臟作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，可以最真實(shí)地反映心臟對(duì)于候選藥物的響應(yīng)情況，然而這在藥物臨床前研究階段是不可能實(shí)現(xiàn)的。

本研究主要應(yīng)用hPSC-CMs建立新藥心臟毒性體外檢測(cè)方法。應(yīng)用CiPA項(xiàng)目認(rèn)定的低風(fēng)險(xiǎn)化合物他莫昔芬和中風(fēng)險(xiǎn)化合物氟哌利多作用于hPSC-CMs模型，通過(guò)檢測(cè)兩種化合物不同濃度作用hPSC-CMs后的FPD和收縮頻率的變化來(lái)判斷其心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)程度是否符合CiPA項(xiàng)目的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬只有在高濃度時(shí)才能對(duì)hPSC-CMs的FPD和收縮頻率產(chǎn)生影響，使心肌細(xì)胞出現(xiàn)停跳現(xiàn)象；心肌細(xì)胞FPD值和收縮頻率對(duì)氟哌利多均有濃度依賴性，濃度越高，F(xiàn)PD(Max)數(shù)值越大，即QT間期長(zhǎng)度越長(zhǎng)，收縮頻率數(shù)值越小。上述結(jié)論與CiPA項(xiàng)目的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)相符，證明該方法可以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)低風(fēng)險(xiǎn)化合物他莫昔芬和中風(fēng)險(xiǎn)化合物氟哌利多對(duì)hPSC-CMs模型的毒性作用。

本研究建立的新藥心臟毒性體外檢測(cè)方法仍需后續(xù)通過(guò)檢測(cè)CiPA項(xiàng)目認(rèn)定的多種低、中和高風(fēng)險(xiǎn)化合物來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其可靠性、準(zhǔn)確度和靈敏度。本研究的后續(xù)研究將進(jìn)一步優(yōu)化條件并應(yīng)用建立的新藥心臟毒性體外檢測(cè)方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)尋找多種新藥來(lái)對(duì)其心臟毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。