王耀坤，陳玨曉，張明遠，邵長利，楊 玉，商 宇

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

甲狀腺癌(thyroid cancer，TC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤。近二十年來，TC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)快速增長。TC的發(fā)病與多種環(huán)境因素相關(guān)，包括放射因素、碘的攝入、吸煙等。未分化甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)是惡性程度最高的甲狀腺癌。ATC可以自發(fā)產(chǎn)生，也可以由分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)，如甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroid cancer，PTC)與甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid cancer，F(xiàn)TC)進展而來。ATC 發(fā)病率極低，僅占所有甲狀腺癌的2%，但是其致死率極高。因ATC死亡的病例占所有因TC死亡病例的50%以上。與DTC相比，常規(guī)的手術(shù)、放療與化療對ATC均無較好的治療效果。因此進一步發(fā)掘ATC的分子標(biāo)記物，并闡明其在TC發(fā)病中的潛在作用，對于ATC患者的診斷與精準(zhǔn)治療具有重要意義。

基因組變異是惡性腫瘤的重要特征。特有的畸變被許多腫瘤所攜帶，并能夠影響腫瘤的發(fā)生和預(yù)后。基因組變異主要包括單核苷酸變異(single nucleotide variation，SNV)、染色體結(jié)構(gòu)變異與染色體區(qū)段的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)。ATC患者常攜帶各種基因組變異，如

RAS

基因突變、

BRAF

基因突變、

RET/PTC

基因重排等。鑒于ATC病因的復(fù)雜性與ATC患者的個體差異，我們對于基因變異，特別是CNV在ATC發(fā)病中的作用尚不清楚。在本研究中，我們利用在線數(shù)據(jù)庫對ATC患者的基因組變異進行分析，并篩選與患者預(yù)后關(guān)系最密切的基因變異，進而對候選變異基因進行蛋白質(zhì)相互作用與靶向藥物篩選分析，旨在為ATC的惡性機制研究及潛在治療靶點篩選提供新思路。

1 對象與方法

1.1 利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析ATC患者基因變異信息

cBioPortal數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org/)整合了來自多個平臺的腫瘤基因組數(shù)據(jù)，如TCGA與ICGC等；并且提供多維度的腫瘤基因集數(shù)據(jù)，包括體細(xì)胞突變、CNV、mRNA和microRNA(miRNA)表達、DNA甲基化等數(shù)據(jù)。我們對cBioPortal數(shù)據(jù)庫中的“Poorly-Differentiated and Anaplastic Thyroid Cancers(MSKCC，JCI 2016)”項目進行研究。該項目納入了84例低分化甲狀腺癌和33例ATC樣本的數(shù)據(jù)。我們?nèi)〈?3例ATC樣本的數(shù)據(jù)，包括患者的相關(guān)資料、基因突變數(shù)據(jù)與CNV數(shù)據(jù)。然后通過在線繪制韋恩圖網(wǎng)站DrawVennDiagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選同時發(fā)生突變及CNV的基因，計算其遺傳變異頻率并排序。

1.2 分析基因變異對患者生存率的影響

從cBioPortal數(shù)據(jù)庫獲得患者的生存時間數(shù)據(jù)、基因突變數(shù)據(jù)與CNV數(shù)據(jù)。分析變異頻率最高基因的基因變異(如錯義突變與CNV)與患者生存率之間的關(guān)系。GraphPad Prism 5.0軟件被用于繪制生存曲線并進行統(tǒng)計分析?；颊呱娣治霾捎肒aplan-Meier法，組間生存率比較采用Log Rank檢驗，以

P

＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 利用STRING數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)相互作用并進行基因功能富集及注釋

STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是在線搜索已知的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫。利用STRING數(shù)據(jù)庫查找靶蛋白的相互作用蛋白?！癮ctive interaction sources”設(shè)置為“Experiments”。“minimum required interaction score”設(shè)置為“0.4”。進而利用STRING數(shù)據(jù)庫的Analysis模塊，對相互作用蛋白進行GO基因生物學(xué)功能注釋。

1.4 利用CARE軟件篩選ATC潛在靶向藥物

CARE(http://care.dfci.harvard.edu/)是一款在線預(yù)測靶向治療和耐藥的調(diào)節(jié)基因的軟件。除了用于預(yù)測藥物靶向治療效果外，CARE還可以用來預(yù)測基因改變與藥物功效之間的關(guān)聯(lián)。CARE軟件的一個關(guān)鍵指數(shù)是CARE評分。對于輸入的目的基因，CARE評分的正值越高表示與藥物反應(yīng)的相關(guān)性越高，而負(fù)值越低則表示與藥物耐藥相關(guān)性越高。首先將與患者生存率改變關(guān)系密切的基因輸入CARE搜索框，并選定相應(yīng)的突變類型，然后根據(jù)CARE評分篩選可能有效的靶向藥物。

2 結(jié)果

2.1 TP53、PI3KCA、ARID2是ATC遺傳變異頻率最高的基因

ATC患者基因變異信息分析結(jié)果如圖1所示。通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫中的ATC樣本數(shù)據(jù)，一共檢索到134個突變基因與11個拷貝數(shù)變異基因。對突變基因與拷貝數(shù)變異基因取交集，發(fā)現(xiàn)8個基因同時存在拷貝數(shù)變異與基因突變，包括

TP53

、

PI3KCA

、

ARID2

、

IL7R

、

CDKN2A

、

FAT1

、

SRC

、

ALK

。其中，

TP53

、

PI3KCA

、

ARID2

是ATC遺傳變異頻率最高的基因，其變異頻率分別為75.8%、21.2%與12%。

2.2 TP53基因的錯義突變與患者生存率下降有關(guān)

基因變異對患者生存率的影響如圖2所示。對變異頻率最高的

TP53

、

PI3KCA

與

ARID2

的各種遺傳變異與患者生存率之間的關(guān)系進行分析，我們發(fā)現(xiàn)14例攜帶

TP53

錯義突變的患者的生存時間均少于15個月。在9例攜帶野生型TP53的患者中，我們發(fā)現(xiàn)2例患者生存時間超過30個月，1例患者生存時間超過90個月。因此，

TP53

基因的錯義突變與患者生存率下降有關(guān)。由于ATC的發(fā)病率非常低，而且患者的生存時間往往較短，因此盡管結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

=0.07)，我們?nèi)匀徊聹y，若增加樣本量，應(yīng)該可以發(fā)現(xiàn)

TP53

基因的錯義突變與患者生存率下降存在關(guān)聯(lián)。除此之外，

PI3KCA

和

ARID2

基因的突變與拷貝數(shù)變異及

TP53

基因的其他變異均未發(fā)現(xiàn)與患者的生存率有明顯關(guān)系。

圖1 ATC患者基因變異情況分析

圖2 TP53基因錯義突變與ATC患者生存期的關(guān)系

圖3 P53相互作用蛋白及GO功能注釋

2.3 P53通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯等生物學(xué)過程參與ATC的發(fā)生

利用STRING數(shù)據(jù)庫分析TP53蛋白相互作用關(guān)系，以闡明

TP53

基因在ATC發(fā)病中可能發(fā)揮的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能夠直接與P53(

TP53

編碼產(chǎn)物)結(jié)合的 蛋 白 包 括 ： FZR1、 MDM2、 MDM4、 TP53BP1、CREBBP、 EP300、 BCL2L1、 HMGB1、 TP53BP2、RPA1(圖3A)。進一步對相互作用蛋白進行富集與生物學(xué)功能注釋。發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白富集于DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞對射線的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、細(xì)胞周期阻滯的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程(圖3B)。輻射暴露是甲狀腺癌的風(fēng)險因素，即使是低劑量的診斷性輻射。結(jié)果提示，

TP53

的突變可能與輻射等環(huán)境因素導(dǎo)致的ATC易感性增加有關(guān)。

2.4 索拉非尼、拉帕提尼等藥物可作為攜帶TP53錯義突變ATC患者的候選靶向藥

利用在線軟件CARE分析

TP53

的錯義突變與藥物反應(yīng)性的關(guān)系，

TP53

突變下出現(xiàn)耐藥性的藥物如表1所示，

TP53

突變下具有反應(yīng)性的藥物如表2所示。

TP53

的突變導(dǎo)致大量藥物出現(xiàn)耐藥性，如Nutlin-3、GW2580、PLX4720、普納替尼(Ponatinib)、達拉菲尼(Dabrafenib)。在

TP53

發(fā)生錯義突變時，有部分藥物呈現(xiàn)高反應(yīng)性，如CP-724714、拉帕提尼(Lapatinib)、魯索替尼(Ruxolitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、尼洛替尼(Nilotinib)。在以上藥物中，索拉非尼已經(jīng)在國內(nèi)獲批用于治療局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的放射性碘難治性DTC。在針對ATC的臨床Ⅱ期試驗中，也發(fā)現(xiàn)索拉非尼具有良好的療效。這也進一步說明通過CARE軟件作出的預(yù)測結(jié)果具有可靠性。

表1 TP53突變下出現(xiàn)耐藥性的藥物

表2 TP53突變下具有反應(yīng)性的藥物

3 討論

精準(zhǔn)醫(yī)療是今后醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向，其通過對疾病不同狀態(tài)和過程精確分類，最終實現(xiàn)對疾病和患者進行個性化精準(zhǔn)治療。盡管靶向藥物如凡德他尼、索拉非尼、卡博替尼已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療甲狀腺癌，但是現(xiàn)在的甲狀腺癌的精準(zhǔn)治療還遠遠達不到以精準(zhǔn)診斷為基礎(chǔ)的個體化治療，而探索靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用與針對特定人群精準(zhǔn)選擇靶向藥物是甲狀腺癌精準(zhǔn)醫(yī)療的新趨勢。有研究報導(dǎo)CNV與甲狀腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。因此，在本研究中利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫對惡性程度最高的ATC進行了CNV與基因突變的聯(lián)合分析。篩選出

TP53

、

PI3KCA

與

ARID2

三個遺傳變異頻率最高的基因。在生存分析中，發(fā)現(xiàn)僅有

TP53

的錯義突變與患者生存率下降存在密切關(guān)系。因此，可推薦將

TP53

的錯義突變作為ATC的候選治療靶點，并且進行了進一步的分析。但是，以上結(jié)果不能完全排除其他基因與

TP53

的其他基因變異形式對患者生存率產(chǎn)生影響。原因有兩個，第一是某些基因變異形式如CNV的發(fā)生率較低，如

ARID2

僅有1個患者出現(xiàn)；第二是ATC惡性程度高，ATC患者的生存期普遍較短。進一步分析了

TP53

參與ATC發(fā)病的可能機制及

TP53

錯義突變導(dǎo)致的藥物耐藥，并篩選出若干可能有效的靶向藥物。MDM2是P53的相互作用蛋白，可以介導(dǎo)P53的降解，加速惡性轉(zhuǎn)化。Nutlin-3是MDM2的拮抗劑，可重新激活野生型

TP53

的轉(zhuǎn)錄活性，繼而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。分析結(jié)果表明

TP53

的錯義突變能夠?qū)е禄颊邔σ訮53、MDM2為靶點的Nutlin-3的耐藥。除了普納替尼、達拉菲尼等藥物，還有大量藥物在篩選中被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)耐藥性，如AZD8055、delalisib、Masitinib等。拉帕提尼是一種雙重酪氨酸激酶抑制劑，可以阻斷ERBB2(也稱為HER2)和EGFR途徑，臨床上主要用于治療HER2陽性的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。EGFR過度表達于ATC，EGFR抑制劑吉非替尼也被發(fā)現(xiàn)抑制ATC的生長。因此，我們推測拉帕提尼作為EGFR靶向藥具有應(yīng)用于治療ATC的潛力。魯索替尼是JAK激酶抑制劑，臨床上用于治療骨髓纖維化；亦有實驗證實其可用于癌癥治療，如出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥的轉(zhuǎn)移性胰腺癌。JAK/STAT3信號通路的抑制能夠抑制ATC細(xì)胞及ATC裸鼠移植瘤的生長。因此，我們認(rèn)為魯索替尼可以作為攜帶

TP53

錯義突變ATC患者的候選靶向藥物?？傊ㄟ^對ATC患者的基因組數(shù)據(jù)進行挖掘，我們發(fā)現(xiàn)

TP53

錯義突變是與ATC患者預(yù)后關(guān)系最密切的基因變異，而索拉非尼、拉帕提尼、魯索替尼等藥物可成為攜帶

TP53

錯義突變ATC患者的候選靶向藥。