趙 驊，陸 雪，蔡恬靜，田 梅，劉青杰

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國(guó)疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

人外周血胞質(zhì)分裂阻滯(cytokinesis-block，CB)分析由Fenech等于1985年提出，可通過(guò)分析雙核細(xì)胞中的微核(micronucleus，MN)、核質(zhì)橋(nucleoplasmic bridge，NPB)及核芽(nuclear bud，NBD)檢測(cè)染色體損傷，已逐漸應(yīng)用于遺傳毒性檢測(cè)和職業(yè)人群的健康監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。

核質(zhì)橋是雙核細(xì)胞兩個(gè)主核間的橋狀核質(zhì)，是DNA錯(cuò)誤修復(fù)、染色體重排和端粒融合的標(biāo)志物。核質(zhì)橋具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并有可能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析，具有成為新的輻射生物劑量計(jì)的潛能。過(guò)往研究發(fā)現(xiàn)不同國(guó)家健康人群間核質(zhì)橋自發(fā)率差異較大，且年齡和性別因素對(duì)其影響尚不明確。本研究選取了我國(guó)健康人群，采用胞質(zhì)分裂阻滯法，分析了核質(zhì)橋的自發(fā)率及年齡、性別對(duì)其的影響，為核質(zhì)橋的影響因素研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

供血者為98位健康成人，無(wú)重大急慢性疾病史、無(wú)化學(xué)毒物接觸史，采樣前6個(gè)月內(nèi)未受到過(guò)電離輻射，其中男性52例，女性46例，年齡范圍為20～68歲，平均年齡為(40.7±12.6)歲。按年齡分為20～29歲組(22人)、30～39歲組(23人)、40～49歲組(25人)和50歲以上組(28人)。簽署知情同意書(shū)后，抽取每名受試者外周血2 mL，注入肝素抗凝管。本研究通過(guò)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所倫理委員會(huì)審查。

1.2 胞質(zhì)分裂阻滯分析

將400 μL外周血加入到含有20%胎牛血清及0.2%植物凝血素(phytohemag-glutinin，PHA)的RPMI 1640培養(yǎng)基(2 mL)中，置于37℃溫箱培養(yǎng)40 h后，加入終濃度為10 μg/mL的細(xì)胞松弛素B(cytochalasin-B，Cyt-B)，混勻后繼續(xù)避光培養(yǎng)至68 h收獲細(xì)胞。采用胞質(zhì)分裂阻滯法進(jìn)行低滲(0.075 mol/L KCI)、固定兩次(

V

∶

V

=3∶1)、滴片、染色(Giemsa染液)。每名受試者外周血樣本設(shè)2個(gè)平行樣。

1.3 計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)

光學(xué)顯微鏡放大400倍或1 000倍下，每個(gè)受試者觀察1 000個(gè)雙核細(xì)胞，計(jì)算核質(zhì)橋、微核及核芽的發(fā)生率。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參照Fenech等報(bào)道，其中雙核細(xì)胞應(yīng)具有兩個(gè)獨(dú)立且核膜完整的細(xì)胞核、兩主核大小接近、與相鄰細(xì)胞不可重疊；核質(zhì)橋位于雙核細(xì)胞中兩個(gè)主核之間，寬度小于主核直徑的1/4；微核是圓形或橢圓形且核膜完整的小核，直徑為主核直徑的1/16～1/3；核芽是與主核由核質(zhì)連接的小核，連接寬度小于核芽直徑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同組間核質(zhì)橋率、微核率、核芽率的比較采用Mann-Whitney

U

檢驗(yàn)，年齡、性別與核質(zhì)橋、微核、核芽的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，年齡與微核的關(guān)系采用線性回歸分析，以

P

＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常人群的核質(zhì)橋自發(fā)率

本研究選取了98例正常個(gè)體，每位受試者分析1 000個(gè)雙核細(xì)胞，其中54例(55.1%)未觀察到核質(zhì)橋，33例(33.7%)觀察到1個(gè)核質(zhì)橋，11例(11.2%)觀察到2個(gè)核質(zhì)橋。核質(zhì)橋總體的自發(fā)率為(0.56±0.69)‰。男性核質(zhì)橋自發(fā)率為(0.65±0.74)‰，女性核質(zhì)橋自發(fā)率為(0.46±0.62)‰，核質(zhì)橋自發(fā)率男性略高于女性，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

=1.32，

P

＞0.05，表1)。

表1 不同性別間核質(zhì)橋、微核及核芽的自發(fā)率(±s)

男性和女性受試者不同年齡組的核質(zhì)橋自發(fā)率見(jiàn)表2。結(jié)果表明，男性受試者在不同年齡組間，核質(zhì)橋自發(fā)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

＜1.49，

P

＞0.05)。女性受試者40～49歲組核質(zhì)橋自發(fā)率最高，顯著高于20～29歲組(

U

=2.31，

P

＜0.05)。相同年齡組的男性和女性核質(zhì)橋自發(fā)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

＜1.41，

P

＞0.05)。

2.2 正常人群的微核及核芽自發(fā)率

98例樣本中均觀察到了微核，其中最少的觀察到1個(gè)，最多的觀察到52個(gè)，微核總體自發(fā)率為(13.10±10.65)‰。男性微核自發(fā)率為(11.57±8.10)‰，女性微核自發(fā)率為(14.82±12.82)‰，微核自發(fā)率女性高于男性，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

=4.40，

P

＜0.05，表1)。男性和女性受試者不同年齡組的微核自發(fā)率見(jiàn)表2。男性和女性受試者在20～29歲組至40～49歲組微核自發(fā)率呈上升趨勢(shì)，男性50歲以上組稍有降低(

P

＞0.05)，女性50歲以上組顯著低于40～49組(

U

＞2.23，

P

＜0.05)。男性20～29歲組微核率高于女性(

U

=4.25，

P

＜0.05)，而40～49歲組和50歲以上組微核率低于女性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

＞4.84，

P

＜0.05)。98例樣本中，有26例(26.5%)未觀察到核芽，其余樣本中觀察到1～9個(gè)核芽，核芽總體自發(fā)率為(2.02±2.08)‰。男性、女性核芽自發(fā)率分別為(2.19±2.09)‰和(1.82±2.08)‰，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

=1.28，

P

＞0.05，表1)。男性和女性受試者不同年齡組的核芽自發(fā)率見(jiàn)表2。男性受試者在不同年齡組間，核芽自發(fā)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

＜1.76，

P

＞0.05)。女性受試者40～49歲組核芽自發(fā)率最高，為3.36‰，顯著高于其余3組(

U

＞2.40，

P

＜0.05)。男性20～29歲組核芽自發(fā)率高于女性(

U

=3.57，

P

＜0.05)，其余3個(gè)年齡組，男性和女性核芽自發(fā)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

U

＜1.80，

P

＞0.05)。

表2 不同年齡組核質(zhì)橋、微核及核芽的自發(fā)率(±s)

2.3 年齡、性別與核質(zhì)橋、微核及核芽自發(fā)率的相關(guān)性

為探索年齡、性別與核質(zhì)橋、微核、核芽自發(fā)率的相關(guān)性，對(duì)其進(jìn)行了Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，核質(zhì)橋、核芽自發(fā)率與年齡、性別無(wú)明顯的相關(guān)性，微核自發(fā)率與年齡、核質(zhì)橋及核芽自發(fā)率具有一定的正相關(guān)性(表3)。進(jìn)一步對(duì)年齡與微核自發(fā)率進(jìn)行了線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)微核自發(fā)率具有隨年齡增加而上升的趨勢(shì)，在20～68歲間，年齡每增加1歲，微核自發(fā)率上升約為0.31‰。

表3 年齡、性別與核質(zhì)橋、微核及核芽自發(fā)率的相關(guān)系數(shù)

3 討論

理想的生物劑量計(jì)，在具有良好劑量-效應(yīng)關(guān)系和較強(qiáng)輻射敏感性的同時(shí)，還應(yīng)在正常人群中具有較低的自發(fā)率，不受性別和年齡的影響，或與其具有明確的變化規(guī)律。染色體畸變分析是目前輻射生物劑量估算的金標(biāo)準(zhǔn)，主要分析指標(biāo)是雙著絲粒染色體，已在國(guó)內(nèi)外多次應(yīng)用。研究表明，核質(zhì)橋源于雙著絲粒染色體，因此，核質(zhì)橋也有可能成為新的輻射生物劑量計(jì)。在相同的培養(yǎng)條件下，核質(zhì)橋與雙著絲粒的發(fā)生率具有正相關(guān)性。雙著絲粒染色體的本底自發(fā)率很低，而受到電離輻射后則會(huì)出現(xiàn)較高的發(fā)生率。因此，探索核質(zhì)橋的自發(fā)率及其在不同性別、年齡人群中的變化規(guī)律，對(duì)其成為輻射生物劑量計(jì)具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)核質(zhì)橋在正常人群的自發(fā)率很低(0.56‰)，與雙著絲粒染色體接近(0.58‰)，遠(yuǎn)低于微核自發(fā)率(13.10‰)和核芽自發(fā)率(2.02‰)。本研究核質(zhì)橋自發(fā)率與Coskun等對(duì)土耳其人群(0.61‰)及Zijno等對(duì)意大利人群(0.61‰)的研究結(jié)果相近；高于Lope等對(duì)西班牙人群的報(bào)道，低于Cho等對(duì)韓國(guó)人群、Donmez-Altuntas等對(duì)土耳其人群、Nefic等對(duì)波黑人群及Garaj-Vrhovac等對(duì)克羅地亞人群的研究結(jié)果。不同報(bào)道中核質(zhì)橋自發(fā)率差異較大，可能是由于不同種族之間的差異，也可能是年齡、性別不同或核質(zhì)橋的判定標(biāo)準(zhǔn)不同所致。因此，應(yīng)明確不同人群的核質(zhì)橋自發(fā)率，確定核質(zhì)橋在人群中的正常值區(qū)間，降低遺傳因素導(dǎo)致的本底水平的不穩(wěn)定性，從而有效應(yīng)對(duì)個(gè)體輻射暴露的篩查和生物劑量的評(píng)估。

過(guò)往研究表明，年齡、性別是影響核質(zhì)橋自發(fā)率的重要因素，但在對(duì)不同國(guó)家健康人群的報(bào)道中結(jié)果不盡相同。本研究中，男性總體核質(zhì)橋自發(fā)率略高于女性，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)；相同年齡組男性與女性的核質(zhì)橋自發(fā)率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)，與過(guò)往報(bào)道結(jié)果一致。但也有研究表明，男性核質(zhì)橋自發(fā)率顯著高于女性，或者顯著低于女性。本研究中相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，核質(zhì)橋與年齡并無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。按不同年齡分組后，男性和女性核質(zhì)橋自發(fā)率在20～29歲組至40～49歲組隨年齡的增加而增加，而50歲及以上組反而降低?？赡芘c總體樣本量較少有關(guān)，下一步還將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果。有研究結(jié)果表明，年齡與核質(zhì)橋自發(fā)率具有相關(guān)性。因此，性別、年齡因素對(duì)核質(zhì)橋自發(fā)率的影響尚需更多的研究。此外，還有研究報(bào)道了吸煙、不良生活方式也可影響核質(zhì)橋的自發(fā)率，因此今后的研究還將關(guān)注這些因素。本研究還分析了微核及核芽的自發(fā)率。微核總體自發(fā)率為13.10‰，屬于健康人群正常的自發(fā)率水平，但高于部分報(bào)道的健康人群微核率的自發(fā)率，可能是與本研究受試者的平均年齡較大(40.7歲)有關(guān)。微核自發(fā)率女性高于男性，核芽自發(fā)率在男性和女性之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)。微核在男性和女性的不同年齡組中，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，而核芽?jī)H在女性的不同年齡組中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。微核自發(fā)率存在性別差異在過(guò)往研究中已有報(bào)道，Mateuca等研究表明，微核自發(fā)率在健康人群中隨年齡增長(zhǎng)有所升高，女性微核自發(fā)率高于男性，可能與X染色體形成的微核或X染色體缺失有關(guān)。年齡增長(zhǎng)可導(dǎo)致DNA修復(fù)效率下降以及基因突變?cè)龆?，從而引起DNA損傷增加，進(jìn)而導(dǎo)致染色體損傷的頻率升高[24]。

綜上所述，本研究采用胞質(zhì)分裂阻滯法，發(fā)現(xiàn)我國(guó)健康人群中的核質(zhì)橋自發(fā)率較低，不受性別因素影響，在20～49歲范圍內(nèi)具有隨年齡增加而升高的趨勢(shì)，為核質(zhì)橋的影響因素研究提供了科學(xué)依據(jù)。