唐文娟，伏 瓊，程 勇，羅世成，梁 冰，2，

（1．貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽550025；2．貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

白血病是一種血液惡性腫瘤，其發(fā)病特點(diǎn)在于不成熟的細(xì)胞喪失分化能力和大量的幼稚細(xì)胞積累。近年來，誘導(dǎo)細(xì)胞分化是白血病聯(lián)合化療的主要策略之一。1986年全反式維甲酸在白血病中 的應(yīng)用，開啟了腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化治療的新方法。但目前常用的分化誘導(dǎo)劑存在較嚴(yán)重的副反應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到限制，因此從我國傳統(tǒng)中草藥中尋找新的分化誘導(dǎo)劑是探索白血病治療的途徑之一。

漆姑草(

Herba Saginae Japonicae

，HSJ)是石竹科植物漆姑的全草，具有解毒止癢、散結(jié)消腫之功效，民間常用于治療癰腫、漆瘡、齲齒痛、淋巴結(jié)結(jié)核、白血病等病癥。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HSJ對慢性髓系白血病細(xì)胞和早幼粒白血病細(xì)胞增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)慢性髓系白血病細(xì)胞和早幼粒白血病細(xì)胞向成熟細(xì)胞方向分化。本次研究對象為人急性早幼粒白血病細(xì)胞(NB4)，通過研究HSJ對NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，以期為HSJ在未來白血病的臨床治療中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

漆姑草全草購自貴陽市藥材市場，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德教授鑒定；蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；c-fos兔抗單克隆抗體(英國Abcam公司)；GAPDH兔抗人單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔 IgG-HRP(美國 Santa Cruz公司)；RNA提取試劑盒(大連寶生生物技術(shù)有限公司)。

1.2 HSJ醇提物制備

HSJ加入70%乙醇，50℃水浴提取4 h，抽濾，濾液濃縮得干浸膏，浸膏過濾除菌后，將母液(相當(dāng)于生藥濃度224.8 mg/mL)置于冰箱中貯存。

1.3 分組與處理

NB4細(xì)胞于全培養(yǎng)基、37℃的CO培養(yǎng)箱中，將快速生長期的NB4細(xì)胞，接種培養(yǎng)24 h，在前期MTT實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上按低(30 μg/mL)、中(60 μg/mL)、高(120 μg/mL)劑量給予不同濃度HSJ醇提物，對照組給予等體積的全培養(yǎng)基(

V

∶

V

∶

V

=89∶10∶1)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 指標(biāo)與方法

1.4.1 電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

藥物作用48 h后，收集細(xì)胞懸液，用PBS洗滌，500 r/min離心5 min，沉淀加戊二醛固定，置透射電鏡下觀察細(xì)胞核及染色質(zhì)等形態(tài)的變化。

1.4.2 NBT還原實(shí)驗(yàn)

將佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol，TPA)和NBT加入到處理好的細(xì)胞中，于37℃水浴1 h，沉淀重懸涂片。陽性細(xì)胞在光鏡下胞漿內(nèi)含藍(lán)灰色顆粒，將細(xì)胞置于光鏡下觀察，計(jì)算NBT的還原率。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

冷乙醇固定NB4細(xì)胞，放入4℃冰箱中保存，用PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，沉淀中加RNase A重懸，于37℃水浴30 min，再加入PI進(jìn)行染色，置4℃冰箱中孵育30min。通過流式細(xì)胞儀檢測波長488 nm處的紅色熒光。

1.4.4 細(xì)胞表面分化抗原CD11b和CD14陽性表達(dá)檢測

將APC-CD11b和FITC-CD14單克隆抗體加入到細(xì)胞中，避光孵育15 min后，用PBS洗滌，沉淀重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測CD11b和CD14陽性細(xì)胞表達(dá)，計(jì)算陽性表達(dá)率。

1.4.5 基因mRNA表達(dá)檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time-PCR，qPCR)方法，先按RNA試劑盒提取總RNA，再用SYBR Green法合成cDNA，兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性95℃、30 s，循環(huán)1次；退火95℃、5 s，延伸60℃、30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2法定量分析目的基因的表達(dá)。c-fos上游引物序列5′-GTCGGTCTTCC AGTCTCCAG-3′，下游序列 5′-TGATTTCCTTGATCG GGTTC-3′；GAPDH上游引物序列5′-GGAGCGAGAT CCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列 5′-GGCTGTTGTC ATACTTCTCATGG-3′。

1.4.6 c-fos蛋白表達(dá)檢測

采用二喹啉甲酸法蛋白定量，將待測蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移及封閉，實(shí)驗(yàn)按照蛋白濃度測定試劑盒(BCA)和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說明書操作，然后分別加入c-fos兔抗單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，GAPDH兔抗單克隆抗體(1∶5 000稀釋)，4℃冰箱孵育。次日加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶8 000稀釋)孵育，曝光。用凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白條帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 HSJ對NB4細(xì)胞形態(tài)的影響

電鏡下對照組NB4細(xì)胞形狀為圓形或橢圓形，細(xì)胞核核仁的輪廓清晰易見，且可觀察到雙核仁，胞核比例較大(圖1A)，而經(jīng)HSJ處理后，可見胞漿呈空泡狀，核仁消失或者減小，細(xì)胞核比例縮小，且胞核形狀呈腎形或蠶豆形，NB4細(xì)胞形態(tài)向成熟細(xì)胞階段分化(圖1B～D)。

圖1 透射電鏡觀察HSJ對NB4細(xì)胞形態(tài)的影響(×2 000)

2.2 HSJ對NB4細(xì)胞NBT還原能力的影響

經(jīng)HSJ作用后，NB4細(xì)胞NBT還原反應(yīng)中沉積不溶性藍(lán)黑色顆粒的NB4細(xì)胞數(shù)目增多，NBT還原率高于對照組，且隨HSJ濃度增加而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05，圖2)。

2.3 HSJ對NB4細(xì)胞周期的影響

經(jīng)HSJ作用后，3個(gè)HSJ劑量組的NB4細(xì)胞中G2期細(xì)胞均高于對照組，而S期細(xì)胞均低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05，圖3)。

圖2 HSJ對NB4細(xì)胞NBT還原能力的影響

圖3 HSJ對NB4細(xì)胞周期的影響

2.4 HSJ對分化相關(guān)抗原CD11b和CD14陽性細(xì)胞表達(dá)率的影響

經(jīng)HSJ作用后，3個(gè)HSJ劑量組的NB4細(xì)胞表面分化相關(guān)抗原CD11b和CD14陽性表達(dá)率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05，圖4和圖5)。

圖4 HSJ對NB4細(xì)胞表面分化抗原CD14陽性表達(dá)率的影響

圖5 HSJ對NB4細(xì)胞表面分化抗原CD11b陽性表達(dá)率的影響

2.5 HSJ對NB4細(xì)胞c-fos mRNA和蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)HSJ作用后，HSJ低劑量組c-fos mRNA和蛋白表達(dá)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)，HSJ中劑量和高劑量組c-fos mRNA和蛋白表達(dá)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05，圖6和圖7)。

圖6 HSJ對NB4細(xì)胞c-fos mRNA表達(dá)的影響

3 討論

急性白血病時(shí)大量幼稚細(xì)胞積累和喪失分化能力，主要表現(xiàn)為阻礙細(xì)胞分化，細(xì)胞成熟障礙，促進(jìn)細(xì)胞分化現(xiàn)已成為臨床治療白血病可參考的主要策略之一。誘導(dǎo)細(xì)胞分化這一手段的特點(diǎn)在于不直接殺死腫瘤細(xì)胞，通過誘導(dǎo)劑的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞向正常方向轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細(xì)胞的生物化學(xué)、形態(tài)及功能等方面接近正常細(xì)胞，是目前白血病臨床治療較為理想的手段之一。NB4細(xì)胞具有向成熟單核-巨噬系、粒系細(xì)胞方向分化的能力，是研究腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的理想模型。在前期MTT實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本次研究以HSJ不同劑量作用于NB4細(xì)胞48 h，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖7 HSJ對NB4細(xì)胞c-fos蛋白表達(dá)的影響

形態(tài)分化是細(xì)胞分化最基本的特征表型，能直觀地反映藥物對細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。本次實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)角度觀察NB4細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的HSJ作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的變化。電鏡下HSJ組細(xì)胞胞漿呈空泡狀，核仁減小或者消失，胞核比例縮小，且胞核形狀呈腎形或蠶豆形，NB4細(xì)胞形態(tài)向成熟細(xì)胞階段分化。然而在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究中，形態(tài)改變不一定典型，單憑形態(tài)學(xué)判斷細(xì)胞是否分化有一定的爭議。現(xiàn)已知，細(xì)胞功能的成熟是白血病細(xì)胞分化早期的標(biāo)志之一，細(xì)胞功能越完善則分化成熟度越高。NBT是一種可溶性的淡黃色染料，通過TPA的激發(fā)，使細(xì)胞內(nèi)成熟度較高的超氧陰離子增多，淡黃色的NBT將被還原成不可溶的藍(lán)黑色沉淀-甲臜。NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSJ低、中、高劑量組的NBT陽性表達(dá)均高于對照組，由此可知在HSJ誘導(dǎo)下NB4細(xì)胞具有向成熟細(xì)胞分化的能力。同時(shí)，細(xì)胞向成熟方向分化過程中的必要條件是細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞周期停滯，在細(xì)胞分化早期可以見到細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞周期變化，并且隨著細(xì)胞分化向后期推進(jìn)等變化更加明顯。本次實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞周期可被HSJ阻滯，細(xì)胞停滯在G2期，細(xì)胞DNA的合成和有絲分裂減少，細(xì)胞增殖能力受到抑制，促進(jìn)了細(xì)胞分化。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生進(jìn)一步分化時(shí)細(xì)胞表面分化抗原也會(huì)隨之改變，本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步探討細(xì)胞分化方向和所處階段，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測NB4細(xì)胞表面分化抗原CD11b和CD14的表達(dá)率。CD14是成熟單核-巨噬細(xì)胞的標(biāo)志抗原，其表達(dá)升高可作為細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志之一；而CD11b是成熟粒系細(xì)胞的標(biāo)志抗原，在成熟粒細(xì)胞中高表達(dá)。本研究結(jié)果表明，HSJ低、中、高劑量組NB4細(xì)胞CD14和CD11b陽性表達(dá)均高于對照組，提示HSJ能誘導(dǎo)細(xì)胞向成熟方向分化。

c-fos

基因是一種與細(xì)胞增殖抑制、分化有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，c-fos在未成熟的早幼粒細(xì)胞中表達(dá)較低，但在分化成熟的粒細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞中c-fos表達(dá)增高，因此有研究認(rèn)為c-fos是細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)表明，HSJ中、高劑量組c-fos mRNA和蛋白表達(dá)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上，本研究從基因水平和蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)了HSJ能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向成熟方向分化，其作用機(jī)制可能與HSJ調(diào)控NB4細(xì)胞

c-fos

基因表達(dá)有關(guān)。